Name: immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts
Uploaded: 2021-05-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (31630058 till X.W. och 31772134 till W.L.).

1. Icke-viruliferös insektsuppfödning
<ol><li>Samla WBPHs från risfält och bak med risplantor i 1 L glasbägare täckta med insektssäkert nät i en inkubator vid 28 °C med 16 h ljus och 8 h mörk. Eftersom SRBSDV inte överförs via ägg är nykläckta nymfer inte viruliferösa.</li>
	<li>Med en penselpenna borstar du försiktigt insekter från bägarens uppfödningsinsekter till en ny bägare med färska risplantor varje vecka tills WBPH-nymfer har kläckts. Fortsätt att föda upp dessa kläckta icke-virulifer?...

<ol>
	<li>Nault, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+transmission+of+plant+viruses:+a+new+synthesis.">Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis.</a> Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).</li><li>Mitchell, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroptera+as+vectors+of+plant+pathogens.">Heteroptera as vectors of plant pathogens.</a> Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).</li><li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-virus+interactions+in+a+plant+host+and+in+a+hemipteran+vector:+Implications+for+vector+fitness+and+virus+epidemics.">Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics.</a> Virus Research. 286, 198069 (2020).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Hogenhout, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector-mediated+transmission+of+plant+viruses.">Insect vector-mediated transmission of plant viruses.</a> Virology. 479, 278-289 (2015).</li><li>Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+black-streaked+dwarf+virus:+from+multiparty+interactions+among+plant-virus-vector+to+intermittent+epidemics.">Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics.</a> Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).</li><li>Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+vector+transmission+and+epidemiology+of+plant-infecting+fijiviruses.">Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).</li><li>Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+on+the+transmission+mechanism+of+tenuiviruses+by+their+vector+insects.">New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects.</a> Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).</li><li>Qin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+midgut+epithelial+cells+by+a+persistently+transmitted+virus+is+mediated+by+sugar+transporter+in+its+insect+vector.">Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector.</a> PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).</li><li>Barnard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+fluorescence+immunoassays.">The development of fluorescence immunoassays.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-Jun+N-terminal+kinase+pathway+of+a+vector+insect+is+activated+by+virus+capsid+protein+and+promotes+viral+replication.">The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication.</a> eLife. 6, 26591 (2017).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-Based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks.">TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).</li><li>Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Sogatella+furcifera+proteome+that+interact+with+P10+protein+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Scientific Reports. 6, 32445 (2016).</li><li>Pu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+characteristics+of+Southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+by+rice+planthoppers.">Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers.</a> Crop Protection. 41, 71-76 (2012).</li><li>Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+viral+dissemination+from+the+midgut+determines+incompetence+of+small+brown+planthopper+as+a+vector+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Virus Research. 167, 404-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+application+of+the+antibodies+of+Sogatella+furcifera+VAMP7+and+Vti1a+proteins+in+expressed+in+Escherichia+coli.">Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli.</a> Plant Protection. 47, 55-60 (2021).</li><li>Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).</li><li>Tsai, J., Perrier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+the+digestive+and+reproductive+systems+of+Dalbulus+maidis+and+Graminella+nigrifrons+(Homoptera:+Cicadellidae).">Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae).</a> Fla Entomology. 79, 563 (1996).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Kruse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining'omics+and+microscopy+to+visualize+interactions+between+the+Asian+citrus+psyllid+vector+and+the+Huanglongbing+pathogen+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+in+the+insect+gut.">Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut.</a> PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).</li><li>Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quenching+autofluorescence+of+insect+tissues+for+in+situ+detection+of+endosymbionts.">Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts.</a> Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).</li></ol>

För bästa resultat bör några viktiga punkter beaktas. För det första är ett högt förhållande av viruliferösa insekter bland den totala befolkningen nödvändig. Även om den lägsta AAP för SRBSDV av WBPH-nymfer och vuxna är 5 min17, bör insekterna tillåtas att mata på färska SRBSDV-infekterade risplantor i 2 d för att uppnå en förvärvseffektivitet på upp till 80%. Eftersom SRBSDV-virionerna kan detekteras i 80% av midguts18, skar vi ut och märkte de ...

De mest beskrivna växtvirusen överförs av insekter från ordningen Hemiptera som inkluderar bladlöss, vitflugor, bladhoppare, växthoppare och thrips 1,2. De piercing-sugande munstyckena av hemipteraninsekter genomborrar växtvävnaden för att mata och utsöndra saliv, samtidigt som viruset överförs effektivt2. Olika överföringsmekanismer av växtvirus av vektorinsekter har beskrivits. Dessa inkluderar icke-beständiga, semipersistent och persistenta. Den långlivade typen är antingen icke-förökningsbar eller förökningsmedel3,4, men för båda dessa typer måste det överförda viruset röra sig genom insektens kropp. I persistent-propagative mode infekterar och replikerar virus initialt i epitelcellerna i insektens tarm, sprider sig sedan till olika vävnader och så småningom in i spottkörtlarna, varifrån de sedan kan införas i en växt genom saliven under insektsmatning 5,6. Långlivade överförda virus rör sig genom olika organ och replikeras i sina insektsvektorer, vilket kräver specifika interaktioner mellan virus och vektorkomponenter i olika stadier 7,8.
Virala proteiner och insektsproteiner måste interagera för att underlätta kritiska processer för virusigenkänning, infektion, replikation eller spridning i vektorinsekterna 9,10. Även om optisk mikroskopi kan användas för att observera cellulära strukturer hos insekter, kan den inte visa virionfördelning, cellulär lokalisering eller samlokalisering av virala proteiner och insektsprotein eller ultrastrukturen hos insektsvävnader och celler. Immunofluorescensmärkning utfördes först av Coons et al. i musens fagocytiska celler genom märkning av specifika fluoresceinantikroppar, och nu används den i stor utsträckning11. Immunofluorescenstekniken, även känd som fluorescensantikroppstekniken, är en av de tidigaste immunologiska märkningsteknikerna som utvecklats och baseras på den specifika bindningsreaktionen mellan antigenet och antikroppen11,12. Den kända antikroppen märks först med fluorescein, som används som en sond för att detektera motsvarande antigener i cellerna eller vävnaderna13,14. Efter att den fluoresceinmärkta antikroppen binder till motsvarande antigen i celler eller vävnader kommer sonden att avge ljus fluorescens när den bestrålas med excitationsvåglängder och ses med ett fluorescensmikroskop för att lokalisera antigenet15.
De flesta vektorinsekter av växtvirus är hemipteraner. En högre befolkningstäthet av vektorinsekter som har en hög överföringseffektivitet för växtviruset kan leda till virusepidemier5. Sydligt risstrimmigt dvärgvirus (SRBSDV, släktet Fijivirus, familjen Reoviridae), en av de allvarligaste patogenerna för ris, har snabbt spridit sig över risodlingsområden i Öst- och Sydostasien och orsakat allvarliga avkastningsförluster sedan 201016,17. Vuxna och nymfer av den vitryggade växthopparen (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) överför SRBSDV till ris på ett ihållande förökningssätt med hög effektivitet. Fältstudier har visat att utbrott av SRBSDV-inducerad rissvartstrimmig dvärgsjukdom vanligtvis sammanfaller med massmigration av WBPH, en avgörande faktor i SRBSDV-epidemier 7,8,18. Vesikelassocierat membranprotein 7 (VAMP7) är en löslig N-etylmaleimidkänslig faktorbindningsproteinreceptor (SNARE), som kan förmedla transport av ämnen via vesikelfusion. VAMP7 interagerar med det yttre huvudkapsidproteinet i SRBSDV in vitro, vilket indikerar att VAMP7 kan vara nära associerat med virusöverföring16.
I protokollet som presenteras här skar vi ut tarmen från viruliferös WBPH som ett exempel för att märka SRBSDV-virioner och VAMP7 i midgutepitelceller16. Som den första invasionsplatsen för virus spelar midgutepitelet viktiga roller vid virusinfektion, replikering och överföring. Först detaljerade vi stegen för att skära tarmen från nymfer och vuxna av WBPH. För det andra använde vi specifika fluoresceinmärkta antikroppar för att märka SRBSDV-virioner och VAMP7 i tarmepitelceller. Sedan observerade vi epitelceller och den cellulära placeringen av virionerna och VAMP7 via ett laserskanningskonfokalmikroskop. Resultaten visade att SRBSDV-virioner och VAMP7 kunde samlokaliseras i cytoplasman i midgutepitelcellerna, vilket tyder på att VAMP7: s specifika funktion kan vara relaterad till spridning av virioner från midgutepitelceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Bull serum albumin (BSA)</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1331</td>
			<td>Dilute antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0771-18*18mm</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Beitja</td>
			<td>XTL-7045B1</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM880</td>
			<td>Observe fluorescence signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ZBP-7105</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with 4&#39;6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB104139</td>
			<td>Label cell necleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>For tissues fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>A22284</td>
			<td>Label actin of midgut epithiels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0290C484</td>
			<td>For tissues permeation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers (5-SA)</td>
			<td>AsOne</td>
			<td>6-7905-40</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts

De flesta växtvirus i naturen överförs från en växt till en annan av hemipteran insekter. En hög populationstäthet av vektorinsekter som är mycket effektiva vid virusöverföring spelar en nyckelroll i virusepidemier på fält. Att studera virus-insektsvektorinteraktioner kan öka vår förståelse av virusöverföring och epidemier i syfte att utforma nya strategier för att kontrollera växtvirus och deras vektorinsekter. Immunofluorescensmärkning har använts i stor utsträckning för att analysera interaktioner mellan patogener och värdar och används här i den vitryggiga växthopparen (WBPH, Sogatella furcifera), som effektivt överför södra risets svarta streckade dvärgvirus (SRBSDV, släktet Fijivirus, familjen Reoviridae), för att lokalisera virionerna och insektsproteinerna i midgutepitelcellerna. Med hjälp av laserskanningskonfokalmikroskopi studerade vi de morfologiska egenskaperna hos midgutepitelceller, cellulär lokalisering av insektsproteiner och samlokalisering av virioner och ett insektsprotein. Detta protokoll kan användas för att studera virusaktiviteter hos insekter, funktioner hos insektsproteiner och interaktioner mellan virus och vektorinsekter.

Figur 1 illustrerar alla steg i detta protokoll: insektsuppfödning, virusförvärv, excision av tarmen, immunofluorescerande märkning och att göra bilden.
Utskurna WBPH-tarmar från vuxna fixerades i 4% (m/v) paraformaldehyd, permeabiliserades med 2% (v/v) Triton X-100 och inkuberades sedan med Dylight 633 phalloidin10,18. Den laserscannande konfokala mikrografin i figur 2 ...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Detta protokoll för immunofluorescerande märkning av både växtvirusproteiner och vektorinsektsproteiner i utskurna insektstrån kan användas för att studera interaktioner mellan virus- och vektorinsekter, insektsproteinfunktioner och molekylära mekanismer bakom virusöverföring.

Immunofluorescerande märkning av växtvirus och insektsvektorproteiner i hemipterantarmar

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Detta protokoll kan användas för att studera olika rörelser i insekter, funktioner hos insektsproteiner och interaktioner mellan virus och vektorinsekter in vivo. Denna metod är effektiv och informativ. Strukturerna i insektens tarm och hjälpcellerna visualiseras tydligt när de ses med laserskanningens konfokalmikroskopi.Demonstrerar proceduren kommer att vara Lu Zhang, PhD från vårt laboratorium. Till att börja med, överför icke-viruliferösa insekter från glasbägare till färskt södra ris svart streckat dvärgvirus, SRBSDV, infekterade risplantor täckta med ett insektssäkert nät under en tvådagars virusförvärvsperiod. Samla sedan insekterna i glasbägare som innehåller färska risplantor.Efter två dagar, samla insekterna från glasbägarna med hjälp av en manuell aspirator för dissektion och excision av tarmen. Förbered 0,01 molar PBS, 4% paraformaldehyd och 2% Triton X-100 enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Använd en pipetter för att placera 100 mikroliter PBS på en glasskiva och placera bilden på scenen i ett optiskt mikroskop.Använd manuell sug för att samla SRBSDV-infekterade vuxna från glasbägarna och placera dem i ett 1,5 ml rör på is för att förlama insekterna. Överför en förlamad vuxen till 100 mikroliter PBS på bilden med buken uppåt. Använd pincett för att klämma fast kroppen och ta bort huvudet med en annan uppsättning pincett.Med en uppsättning pincett, kläm fast sidorna på buken och kläm fast ovipositoren eller svansens copulatoriska organ med den andra uppsättningen, dra sedan försiktigt det intersegmentella membranet i ett buksegment för att långsamt exponera tarmen i buken. Fortsätt riva bort membranet och dra gradvis ut hela tarmen från buken. Dra försiktigt av svansen som är ansluten till slutet av tarmen för att ta bort hela tarmen.Placera utskurna tarmar i ett 200 mikroliter centrifugrör. Tillsätt 200 mikroliter PBS till röret och använd en pipett för att tvätta tarmarna noggrant. Använd en pipetter för att placera 100 mikroliter PBS på en glasskiva och placera bilden på scenen i ett optiskt mikroskop.Använd manuell sug för att samla SRBSDV-infekterade nymfer från glasbägare och placera dem i 1,5 milliliter rör placerat på is för att förlama insekterna. Överför en förlamad nymf till 100 mikroliter buffert på glidbanan med buken uppåt. Lossa nymfens svans, kläm sedan fast insektskroppen för att fixa den försiktigt och använd det andra paret för att klämma fast huvudet.Dra försiktigt bort huvudet från kroppen medan du fortfarande behåller dess fäste vid tarmen så att huvudet lossnar från kroppen, men tarmen är fortfarande fäst vid bröstkorgen och buken. Med pincetten som fortfarande klämmer fast kroppen, använd det andra paret för att flytta huvudet försiktigt och gradvis dra ut tarmen. Lossa tarmen från huvudet för att få en intakt tarm utan att skada kroppen.Placera de utskurna tarmarna i ett rör. Tillsätt PBS till röret och sug försiktigt, släpp lösningen med en pipett för att tvätta tarmarna noggrant. Förbered antikropparna och monteringsmediet enligt beskrivningen i textmanuskriptet.Placera de nyligen utskurna och PBS-tvättade WBPH-tarmarna i 100 mikroliter 4% paraformaldehyd i ett 200 mikroliter centrifugrör vid rumstemperatur. Efter två timmar, byt ut paraformaldehydlösningen med 200 mikroliter PBS. Efter 10 minuter, ta bort PBS för att eliminera eventuell paraformaldehyd och upprepa PBS-tvättsteget två gånger.Efter två PBS-tvättar, tillsätt 200 mikroliter icke-joniskt tvättmedel Triton X-100 för att permeabilisera proverna vid rumstemperatur. Efter 30 minuter, ta bort Triton X-100 och tvätta bort eventuellt kvarvarande tvättmedel med tre 10-minuters tvättar med PBS. Späd de märkta antikropparna en till 50 med 50 mikroliter tjurserumalbumin.Tillsätt de utspädda antikropparna till röret och inkubera proverna över natten vid fyra grader Celsius. På morgonen efter att antikroppen har tagits bort, tvätta bort det återstående antikroppsspädningsmedlet med tre 10-minuters tvättar med PBS. Späd en mikroliter DyLight 633-Phalloidin med 50 mikroliter PBS och tillsätt 50 mikroliter utspädd falloidin till röret under en två timmars inkubation vid rumstemperatur.Efter avlägsnande av falloidin, tvätta noggrant bort återstående falloidin med tre 10-minuters tvättar med PBS. Placera en droppe monteringsmedium innehållande DAPI på ett mikroskopglas. Överför tarmarna till mediet och placera försiktigt täckglaset över provet utan att skapa bubblor.Den representativa laserskanningskonfokala mikrografin av utskurna WBPH-tarmar från vuxna efter märkning med falloidin visade tre sektioner: framtarmen, mellantarmen och baktarmen. Bland dessa är midgut det initiala infektionsstället för SRBSDV. Tarmens monolagerepitelcellstruktur underlättar studien av cellulär lokalisering av insektsproteiner och samlokalisering av virus- och insektsproteiner.Utskurna WBPH-tarmar med DyLight 488-märkta anti-VAMP-7- och SRBSDV-virioner med DyLight 549-märkta anti-SRBSDV-antikroppar visas här. VAMP-7- och SRBSDV-virioner visade sig samlokaliseras i cytoplasman, vilket tyder på att VAMP-7 kan spela en roll i virusöverföring in vivo. Permeabiliserade tarmar ska rengöras noggrant efter inkubation med luciferinkonjugerade antikroppar för att minska bakgrunden och ospecifik bindning.Detta är en pålitlig metod för att se lokalisering av virus, andra patogener och insektsproteiner i insekter. Det ger grunden för vidare studier av förhållandet mellan patogener och insekter.

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-inducerad geners uttryck (VIGS) i Nicotiana benthamiana Och Tomat

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

ReAsH / Flash märkning och bildanalys av proteiner Tetracysteine ​​sensor i cellerna

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium-medierad virusinducerade geners uttryck test på Bomull

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabola Märkning och Membrane Fraktione för jämförande proteomik analys av<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fjädring cellkulturer

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Fysiologiska Inspelningar och RNA sekvensering av de smak bihang till Gula-febern Mosquito<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

En jämförande analys av rekombinant proteinuttryck i olika Biofactories: Bakterier, insektsceller och växt Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Hög genomströmning crispr Vektorkonstruktion och karakterisering av DNA Ändringar av Generation tomat håriga Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Transient expression och cellulär lokalisering av rekombinanta proteiner i odlade insektsceller

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Direkt agroinokulering av majsplantor genom injektion med rekombinant Foxtail Mosaic Virus och Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunofluorescerande färgning för visualisering av heterochromatin associerade proteiner i Drosophila Salivary Körtlar

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...