Name: immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts
Uploaded: 2021-05-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (31630058 X.W.'ye ve 31772134 W.L.'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

1. Virülifer olmayan böcek yetiştiriciliği
<ol><li>WBPH'leri pirinç tarlalarından toplayın ve 1 L cam beherlerde pirinç fideleri ile arkadan toplayın, böceklere dayanıklı ağ ile kaplanmış, 28 ° C'de bir inkübatörde 16 saat ışık ve 8 saat karanlık. SRBSDV yumurta yoluyla bulaşmadığından, yeni yumurtadan çıkmış nimfler virülifer değildir.</li>
	<li>Bir fırça kalemiyle, WBPH perileri yumurtadan çıkana kadar her hafta taze pirinç fidelerinin yeni bir kabına beher, böcekleri yetiştire...

<ol>
	<li>Nault, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+transmission+of+plant+viruses:+a+new+synthesis.">Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis.</a> Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).</li><li>Mitchell, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroptera+as+vectors+of+plant+pathogens.">Heteroptera as vectors of plant pathogens.</a> Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).</li><li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-virus+interactions+in+a+plant+host+and+in+a+hemipteran+vector:+Implications+for+vector+fitness+and+virus+epidemics.">Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics.</a> Virus Research. 286, 198069 (2020).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Hogenhout, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector-mediated+transmission+of+plant+viruses.">Insect vector-mediated transmission of plant viruses.</a> Virology. 479, 278-289 (2015).</li><li>Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+black-streaked+dwarf+virus:+from+multiparty+interactions+among+plant-virus-vector+to+intermittent+epidemics.">Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics.</a> Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).</li><li>Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+vector+transmission+and+epidemiology+of+plant-infecting+fijiviruses.">Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).</li><li>Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+on+the+transmission+mechanism+of+tenuiviruses+by+their+vector+insects.">New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects.</a> Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).</li><li>Qin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+midgut+epithelial+cells+by+a+persistently+transmitted+virus+is+mediated+by+sugar+transporter+in+its+insect+vector.">Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector.</a> PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).</li><li>Barnard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+fluorescence+immunoassays.">The development of fluorescence immunoassays.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-Jun+N-terminal+kinase+pathway+of+a+vector+insect+is+activated+by+virus+capsid+protein+and+promotes+viral+replication.">The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication.</a> eLife. 6, 26591 (2017).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-Based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks.">TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).</li><li>Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Sogatella+furcifera+proteome+that+interact+with+P10+protein+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Scientific Reports. 6, 32445 (2016).</li><li>Pu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+characteristics+of+Southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+by+rice+planthoppers.">Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers.</a> Crop Protection. 41, 71-76 (2012).</li><li>Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+viral+dissemination+from+the+midgut+determines+incompetence+of+small+brown+planthopper+as+a+vector+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Virus Research. 167, 404-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+application+of+the+antibodies+of+Sogatella+furcifera+VAMP7+and+Vti1a+proteins+in+expressed+in+Escherichia+coli.">Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli.</a> Plant Protection. 47, 55-60 (2021).</li><li>Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).</li><li>Tsai, J., Perrier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+the+digestive+and+reproductive+systems+of+Dalbulus+maidis+and+Graminella+nigrifrons+(Homoptera:+Cicadellidae).">Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae).</a> Fla Entomology. 79, 563 (1996).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Kruse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining'omics+and+microscopy+to+visualize+interactions+between+the+Asian+citrus+psyllid+vector+and+the+Huanglongbing+pathogen+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+in+the+insect+gut.">Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut.</a> PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).</li><li>Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quenching+autofluorescence+of+insect+tissues+for+in+situ+detection+of+endosymbionts.">Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts.</a> Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).</li></ol>

En iyi sonuçlar için, birkaç önemli nokta dikkate alınmalıdır. İlk olarak, toplam popülasyon arasında yüksek oranda virülifer böcek gereklidir. WBPH perileri ve yetişkinler tarafından SRBSDV için minimum AAP 5 dakika17 olmasına rağmen, böceklerin% 80'e varan bir kazanım verimliliği elde etmek için 2 gün boyunca taze SRBSDV ile enfekte olmuş pirinç bitkileriyle beslenmelerine izin verilmelidir. SRBSDV viryonları, midgutların18'inin% 80'inde tespit ...

Tanımlanan bitki virüslerinin çoğu, yaprak bitleri, beyaz sinekler, yaprakçıklar, planthoppers vethrips 1,2'yi içeren Hemiptera düzeninden böcekler tarafından bulaşır. Hemipteryen böceklerin delici-emici ağız kısımları, tükürüğü beslemek ve salgılamak için bitki dokusunu deler, aynı zamanda virüsü verimli bir şekilde iletir2. Bitki virüslerinin vektör böcekleri tarafından farklı bulaşma mekanizmaları tanımlanmıştır. Bunlar arasında kalıcı olmayan, yarı kalıcı ve kalıcı bulunur. Kalıcı tip ya yayılmaz ya da çoğaltıcı 3,4'tür, ancak bu türlerin her ikisi için de bulaşan virüs böceğin vücudu boyunca hareket etmelidir. Kalıcı-yayılım modunda, virüsler başlangıçta böceğin bağırsağının epitel hücrelerinde enfekte olur ve çoğalır, daha sonra farklı dokulara ve sonunda tükürük bezlerine yayılır, buradan daha sonra böcek besleme sırasında tükürük yoluyla bir bitkiye sokulabilirler 5,6. Kalıcı olarak bulaşan virüsler farklı organlardan geçer ve böcek vektörlerinde çoğalırlar, bu da farklı aşamalarda virüs ve vektör bileşenleri arasında spesifik etkileşimler gerektirir 7,8.
Viral proteinler ve böcek proteinleri, vektör böceklerinde virüs tanıma, enfeksiyon, replikasyon veya yayılma için kritik süreçleri kolaylaştırmak için etkileşime girmelidir 9,10. Optik mikroskopi böceklerdeki hücresel yapıları gözlemlemek için kullanılabilse de, virion dağılımını, viral proteinlerin ve böcek proteinlerinin hücresel lokalizasyonunu veya kolokalizasyonunu veya böcek dokularının ve hücrelerinin ultrayapısını gösteremez. İmmünofloresan etiketleme ilk olarak Coons ve ark. tarafından farenin fagositik hücrelerinde spesifik floresein antikorlarının etiketlenmesi yoluyla gerçekleştirilmiştir ve şimdi yaygın olarak kullanılmaktadır11. Floresan antikor tekniği olarak da bilinen immünofloresan tekniği, geliştirilen en eski immünolojik etiketleme tekniklerinden biridir ve antijen ile antikor11,12 arasındaki spesifik bağlanma reaksiyonuna dayanır. Bilinen antikor ilk olarak, hücrelerde veya dokularda karşılık gelen antijenleri tespit etmek için bir prob olarak kullanılan floresein ile etiketlenir13,14. Floresein etiketli antikor, hücrelerdeki veya dokulardaki karşılık gelen antijene bağlandıktan sonra, prob, uyarma dalga boyları ile ışınlandığında ve antijen15'i lokalize etmek için bir floresan mikroskobu ile görüntülendiğinde parlak floresan yayar.
Bitki virüslerinin çoğu vektör böcekleri hemipteranlardır. Bitki virüsü için yüksek bulaşma verimliliğine sahip vektör böceklerinin daha yüksek popülasyon yoğunluğu, virüs salgınlarına yol açabilir5. Pirincin en ciddi patojenlerinden biri olan Güney pirinç siyah çizgili cüce virüsü (SRBSDV, Fijivirus cinsi, Reoviridae familyası), Doğu ve Güneydoğu Asya'da pirinç yetiştirme alanlarına hızla yayılmış ve 2010 yılından bu yana ciddi verim kayıplarına neden olmuştur16,17. Beyaz sırtlı planthopper'ın yetişkinleri ve nimfleri (WBPH, Sogatella furcifera Horváth), SRBSDV'yi pirince yüksek verimlilikle kalıcı-yayılıcı bir şekilde iletir. Saha çalışmaları, SRBSDV kaynaklı pirinç siyah çizgili cüce hastalığının salgınlarının genellikle SRBSDV salgınlarında çok önemli bir faktör olan WBPH'lerin kitlesel uzun mesafeli göçü ile çakıştığını göstermiştir 7,8,18. Vezikülle ilişkili membran proteini 7 (VAMP7), vezikül füzyonu yoluyla maddelerin taşınmasına aracılık edebilen çözünür bir N-etilmaleimide duyarlı faktör bağlanma proteini reseptörüdür (SNARE). VAMP7, SRBSDV'nin in vitro dış majör kapsid proteini ile etkileşime girer, bu da VAMP7'nin virüs iletimi ile yakından ilişkili olabileceğini gösterir16.
Burada sunulan protokolde, midgut epitel hücrelerinde SRBSDV viryonlarını ve VAMP7'yi etiketlemek için örnek olarak virülifer WBPH'den bağırsakları eksize ettik16. Virüsün ilk istila yeri olan midgut epiteli, virüs enfeksiyonu, replikasyonu ve bulaşmasında hayati rol oynar. İlk olarak, bağırsakları nimflerden ve WBPH'lerin yetişkinlerinden çıkarma adımlarını detaylandırdık. İkincisi, bağırsak epitel hücrelerinde SRBSDV viryonlarını ve VAMP7'yi etiketlemek için spesifik floresein etiketli antikorlar kullandık. Daha sonra epitel hücrelerini ve viryonların ve VAMP7'nin hücresel lokalizasyonunu lazer taramalı konfokal mikroskopla gözlemledik. Sonuçlar, SRBSDV viryonlarının ve VAMP7'nin midgut epitel hücrelerinin sitoplazmasında kolokalize olabileceğini gösterdi, bu da VAMP7'nin spesifik işlevinin viryonların midgut epitel hücrelerinden yayılmasıyla ilişkili olabileceğini düşündürdü.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Bull serum albumin (BSA)</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1331</td>
			<td>Dilute antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0771-18*18mm</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Beitja</td>
			<td>XTL-7045B1</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM880</td>
			<td>Observe fluorescence signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ZBP-7105</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with 4&#39;6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB104139</td>
			<td>Label cell necleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>For tissues fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>A22284</td>
			<td>Label actin of midgut epithiels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0290C484</td>
			<td>For tissues permeation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers (5-SA)</td>
			<td>AsOne</td>
			<td>6-7905-40</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts

Doğadaki çoğu bitki virüsü, hemipteran böcekler tarafından bir bitkiden diğerine bulaşır. Virüs bulaşmasında oldukça etkili olan vektör böceklerinin yüksek popülasyon yoğunluğu, alanlardaki virüs salgınlarında önemli bir rol oynamaktadır. Virüs-böcek vektör etkileşimlerini incelemek, bitki virüslerini ve vektör böceklerini kontrol etmek için yeni stratejiler tasarlamak amacıyla virüs bulaşması ve salgınlar hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir. İmmünofloresan etiketleme, patojenler ve konakçılar arasındaki etkileşimleri analiz etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve burada, midgut epitel hücrelerindeki viryonları ve böcek proteinlerini bulmak için güney pirinç siyah çizgili cüce virüsünü (SRBSDV, cins Fijivirus, aile Reoviridae) verimli bir şekilde ileten beyaz sırtlı planthopper'da (WBPH, Sogatella furcifera) kullanılmaktadır. Lazer taramalı konfokal mikroskopi kullanarak, midgut epitel hücrelerinin morfolojik özelliklerini, böcek proteinlerinin hücresel lokalizasyonunu ve viryonların ve bir böcek proteininin kolokalizasyonunu inceledik. Bu protokol, böceklerdeki virüs aktivitelerini, böcek proteinlerinin işlevlerini ve virüs ile vektör böceği arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.

Şekil 1, bu protokoldeki tüm adımları göstermektedir: böcek yetiştiriciliği, virüs edinimi, bağırsağın eksizyonu, immünofloresan etiketleme ve slaytın yapılması.
Yetişkinlerden eksize edilen WBPH bağırsakları% 4 (m / v) paraformaldehit içinde sabitlendi,% 2 (v / v) Triton X-100 ile geçirgenleştirildi ve% 2 (v / v) Triton X-100 ile permeabilize edildi ve daha sonra Dylight 633 phalloidin10,18<sup class="xre...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Eksize edilmiş böcek bağırsaklarında hem bitki virüsü proteinlerinin hem de vektör böcek proteinlerinin immünofloresan etiketlenmesi için bu protokol, virüs ve vektör böcekleri, böcek protein fonksiyonları ve virüs bulaşmasının altında yatan moleküler mekanizmalar arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.

Hemipteran Bağırsaklarda Bitki Virüsü ve Böcek Vektör Proteinlerinin İmmünofloresan Etiketlenmesi

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Bu protokol, böceklerdeki çeşitli hareketleri, böcek proteinlerinin işlevlerini ve in vivo virüs ve vektör böcek arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir. Bu yöntem verimli ve bilgilendiricidir. Böcek bağırsağının ve yardımcı hücrelerin yapıları, lazer taramalı konfokal mikroskopi ile bakıldığında açıkça görselleştirilir.Prosedürü gösteren Lu Zhang, laboratuvarımızdan PhD olacaktır. Başlamak için, virülifer olmayan böcekleri cam beherlerden taze güney pirinç siyah çizgili cüce virüsüne, SRBSDV'ye, iki günlük bir virüs edinme erişim süresi boyunca böcek geçirmez bir ağ ile kaplı enfekte pirinç bitkilerine aktarın. Daha sonra böcekleri taze pirinç fideleri içeren cam beherlerde toplayın.İki gün sonra, bağırsakların diseksiyonu ve eksizyonu için manuel bir aspiratör kullanarak cam beherlerden böcekleri toplayın. Metin makalesinde açıklandığı gibi 0.01 molar PBS,% 4 paraformaldehit ve% 2 Triton X-100 hazırlayın. Bir cam slayt üzerine 100 mikrolitre PBS yerleştirmek için bir pipetleyici kullanın ve slaytı optik mikroskop sahnesine yerleştirin.SRBSDV ile enfekte olmuş yetişkinleri cam beherlerden toplamak için manuel aspiratör kullanın ve böcekleri felç etmek için buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Felçli bir yetişkini, karın yukarı bakacak şekilde slayttaki 100 mikrolitre PBS'ye aktarın. Vücudu sıkıştırmak için cımbız kullanın ve kafayı başka bir cımbızla çıkarın.Bir cımbız setiyle, karnın kenarlarını kelepçeleyin ve ovipozitörü veya kuyruğun çiftleşme organını diğer setle sıkıştırın, ardından bağırsakları karın içinde yavaşça açığa çıkarmak için bir karın segmentinin intersegmental zarını dikkatlice çekin. Zarı yırtmaya devam edin ve yavaş yavaş tüm bağırsağı karnından çıkarın. Tüm bağırsağı çıkarmak için bağırsağın ucuna bağlı kuyruğu yavaşça çekin.Eksize edilmiş bağırsakları 200 mikrolitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Tüpe 200 mikrolitre PBS ekleyin ve bağırsakları iyice yıkamak için bir pipet kullanın. Bir cam slayt üzerine 100 mikrolitre PBS yerleştirmek için bir pipetleyici kullanın ve slaytı optik mikroskop sahnesine yerleştirin.SRBSDV ile enfekte olmuş perileri cam beherlerden toplamak için manuel aspiratör kullanın ve böcekleri felç etmek için buz üzerine yerleştirilmiş 1,5 mililitrelik tüpe yerleştirin. Felçli bir perisini, karın yukarı bakacak şekilde slayttaki 100 mikrolitre tampona aktarın. Perisinin kuyruğunu ayırın, sonra yavaşça sabitlemek için böcek gövdesini sıkıştırın ve kafayı sıkıştırmak için diğer çifti kullanın.Başın vücuttan ayrılması için bağırsaklara bağlanmasını sürdürürken kafayı yavaşça vücuttan uzaklaştırın, ancak bağırsak hala göğüs kafesine ve karnına bağlanır. Cımbızlar hala vücudu sıkıştırırken, kafayı dikkatlice hareket ettirmek ve bağırsağı yavaş yavaş çıkarmak için diğer çifti kullanın. Vücuda zarar vermeden sağlam bir bağırsak elde etmek için bağırsağı kafadan ayırın.Eksize edilen bağırsakları bir tüpe yerleştirin. Tüpe PBS ekleyin ve yavaşça emerek bağırsakları iyice yıkamak için çözeltiyi bir pipetle serbest bırakın. Antikorları ve montaj ortamını metin makalesinde açıklandığı gibi hazırlayın.Yeni eksize edilmiş ve PBS ile yıkanmış WBPH bağırsaklarını, oda sıcaklığında 200 mikrolitrelik bir santrifüj tüpüne 100 mikrolitre% 4 paraformaldehit içine yerleştirin. İki saat sonra, paraformaldehit çözeltisini 200 mikrolitre PBS ile değiştirin. 10 dakika sonra, herhangi bir paraformaldehiti ortadan kaldırmak için PBS'yi çıkarın ve PBS yıkama adımını iki kez tekrarlayın.İki PBS yıkamasından sonra, numuneleri oda sıcaklığında geçirgenleştirmek için 200 mikrolitre iyonik olmayan deterjan Triton X-100 ekleyin. 30 dakika sonra, Triton X-100'ü çıkarın ve kalan deterjanı PBS ile 10 dakikalık üç yıkama ile yıkayın. Etiketli antikorları 50 mikrolitre boğa serum albümini ile bir ila 50 arasında seyreltin.Seyreltilmiş antikorları tüpe ekleyin ve numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Antikoru çıkardıktan sonraki sabah, kalan antikor seyrelticiyi PBS ile 10 dakikalık üç yıkama ile yıkayın. Bir mikrolitre DyLight 633-Phalloidin'i 50 mikrolitre PBS ile seyreltin ve oda sıcaklığında iki saatlik bir inkübasyon için tüpe 50 mikrolitre seyreltilmiş faloidin ekleyin.Phalloidini çıkardıktan sonra, kalan falloidini PBS ile üç adet 10 dakikalık yıkama ile iyice yıkayın. Bir mikroskop lamdına DAPI içeren bir damla montaj ortamı yerleştirin. Bağırsakları ortama aktarın ve kapak camını kabarcıklar oluşturmadan numunenin üzerine yavaşça yerleştirin.Falloidin ile etiketlendikten sonra yetişkinlerden eksize edilen WBPH bağırsaklarının temsili lazer tarama konfokal mikrografisi üç bölüm gösterdi: ön bağırsak, midgut ve hindgut. Bunlar arasında midgut, SRBSDV'nin ilk enfeksiyon bölgesidir. Bağırsağın tek katmanlı epitel hücre yapısı, böcek proteinlerinin hücresel lokalizasyonunun ve viral ve böcek proteinlerinin kolokalizasyonunun incelenmesini kolaylaştırır.Burada DyLight 488 etiketli anti--7 ile eksize edilmiş WBPH bağırsakları ve DyLight 549 etiketli anti-SRBSDV antikoru ile SRBSDV viryonları gösterilmiştir. -7 ve SRBSDV viryonlarının sitoplazmada birlikte lokalize olduğu gösterilmiştir, bu da-7'nin in vivo virüs iletiminde rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Permeabilize bağırsaklar, arka planı ve spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için lusiferin konjuge antikorları ile inkübasyondan sonra iyice temizlenmelidir.Bu, böceklerde virüs, diğer patojenler ve böcek proteinlerinin lokalizasyonunu görüntülemek için güvenilir bir yöntemdir. Patojenler ve böcekler arasındaki ilişkinin daha ileri çalışmaları için temel sağlar.

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virüs indüklenen gen susturma (VIGS) Nicotiana benthamiana Ve Domates

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine ​​Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Pamuk olarak Agrobacterium Virüs Bağlı Gen susturma Testi

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Fizyolojik Kayıtlar ve Sarı-ateş Sivrisinek Tat Çıkıntılara RNA Sıralama<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Rekombinant Foxtail Mozaik Virüs ve Şeker Kamışı Mozaik Virüs Bulaşıcı Klonlar ile Enjeksiyon ile Mısır Fidelerinin Doğrudan Agroinokokülasyonu

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Drosophila Tükürük Bezlerinde Heterokromatin İlişkili Proteinlerin Görselleştirilmesi için İmmünofluoresan Boyama

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...