Name: multifactorial assessment of motor behavior in rats after unilateral sciatic nerve crush injury
Uploaded: 2021-07-31T14:30:00
Duration: 14 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multifactorial Assessment of Motor Behavior in Rats after Unilateral Sciatic Nerve Crush Injury at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal alemán de Educación e Investigación (BMBF DysTract a C.W.I.) y por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) de la Universidad de Würzburg (N-362 a C.W.I.; Z2-CSP3 a L.R.). Además, este proyecto ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del EJP RD COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover a J.V.), y de la Fundación VERUM. Además, C.W.I. está financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) Project-ID 424778381-TRR 295, por la Deutsche Stiftung Neurologie y ParkinsonFonds. L.R. cuenta además con el apoyo de la Dystonia Medical Reseach Foundation.
Los autores agradecen a Keali Röhm, Veronika Senger, Heike Menzel y Louisa Frieß por su asistencia técnica, así como a Helga Brünner por el cuidado de los animales.

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+mouse+sciatic+nerve+crush+and+subsequent+assessment+of+regeneration+by+whole+mount+muscle+analysis.">Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3606 (2012).</li><li>Savastano, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciatic+nerve+injury:+a+simple+and+subtle+model+for+investigating+many+aspects+of+nervous+system+damage+and+recovery.">Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery.</a> Journal of Neuroscience Methods. 227, 166-180 (2014).</li><li>Menorca, R. M., Fussell, T. S., Elfar, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+cell+transplantation+effects+on+sciatic+nerve+regeneration+after+a+standardized+crush+injury+in+the+rat.">Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat.</a> Microsurgery. 28 (6), 458-470 (2008).</li><li>Knorr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+dystonia-like+movements+in+TOR1A+rats+after+transient+nerve+injury+is+accompanied+by+dopaminergic+dysregulation+and+abnormal+oscillatory+activity+of+a+central+motor+network.">The evolution of dystonia-like movements in TOR1A rats after transient nerve injury is accompanied by dopaminergic dysregulation and abnormal oscillatory activity of a central motor network.</a> Neurobiology of Disease. , 105337 (2021).</li><li>Quartarone, A., Hallett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+physiological+basis+of+dystonia.">Emerging concepts in the physiological basis of dystonia.</a> Movement Disorders. 28 (7), 958-967 (2013).</li><li>Metz, G. A., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ladder+rung+walking+task:+a+scoring+system+and+its+practical+application.">The ladder rung walking task: a scoring system and its practical application.</a> Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).</li><li>Metz, G. A., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+subcortical+lesions+impair+skilled+walking+in+the+ladder+rung+walking+test:+a+new+task+to+evaluate+fore-+and+hindlimb+stepping,+placing,+and+co-ordination.">Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination.</a> Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).</li><li>Johansson, B. B., Ohlsson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment,+social+interaction,+and+physical+activity+as+determinants+of+functional+outcome+after+cerebral+infarction+in+the+rat.">Environment, social interaction, and physical activity as determinants of functional outcome after cerebral infarction in the rat.</a> Experimental Neurology. 139 (2), 322-327 (1996).</li><li>Ohwatashi, A., Ikeda, S., Harada, K., Kamikawa, Y., Yoshida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+enhanced+functional+recovery+and+expression+of+GDNF+after+photochemically+induced+cerebral+infarction+in+the+rat.">Exercise enhanced functional recovery and expression of GDNF after photochemically induced cerebral infarction in the rat.</a> EXCLI Journal. 12, 693-700 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo de evaluación del comportamiento proporciona una visión general de las ventajas y desventajas, así como las posibles lecturas de la batería de prueba de comportamiento seleccionada en un modelo de roedor después de la lesión por aplastamiento del nervio ciático. 
Para obtener un resultado comparativo de lesión del agobiamiento del nervio ciático, una técnica constante del agobio es obligatoria. El uso de una abrazadera no aserrada (Ultra Fine Hemostat) en lugar de fórceps puede mejorar la consistencia del aplastamiento. Utilice la misma abrazadera, así como la misma posición de aplastamiento para garantizar la misma compresión nerviosa. El uso exclusivo de la abrazadera para la lesión por aplastamiento y la manipulación de la abrazadera con cuidado mejora la consistencia. Además, realice el procedimiento de la lesión por aplastamiento con cuidado. Daño adicional al nervio durante la cirugía, como la tracción no deseada del nervio puede conducir a efectos secundarios no deseados como la automutilación. Por lo tanto, se recomienda una preparación cuidadosa del nervio, así como una administración de un analgésico durante un mínimo de dos días. 
La evaluación multifactorial del comportamiento del motor puede caracterizar el fenotipo después de lesión del agobio del nervio en ratas en los varios niveles. Utilizamos la OFT, el análisis de la marcha de la pasarela XT, la tarea de caminar por la viga y la tarea de caminar por el peldaños de la escalera. Un procedimiento experimental cegado y el análisis de datos a los grupos experimentales es esencial para estos experimentos. Antes de la evaluación del comportamiento, los animales se aclimataron en la sala de pruebas en condiciones de prueba durante al menos 30 minutos. Todas las pruebas de comportamiento aplicadas en este documento tienen la ventaja de que no se requiere privación de alimentos o agua. El mismo grupo de animales se utilizó en todas las pruebas de comportamiento descritas. Se realizó un máximo de dos pruebas de comportamiento diferentes por día para cada animal. Si las pruebas de comportamiento se realizan a intervalos regulares, preste atención a un procedimiento comparable, como realizar la prueba en el mismo orden animal y a la misma hora del día. Otro aspecto importante para el análisis del comportamiento es el ciclo día-noche de las ratas. Considere un ciclo día-noche invertido para obtener niveles más naturales y más altos de actividad en el ciclo diurnos (ciclo oscuro). Esto tiene que ser considerado especialmente para la medición del comportamiento espontáneo, como la OFT. En este experimento, no se pudo implementar un ciclo día-noche invertido, pero se garantizó una aclimatación adecuada a las condiciones de prueba. Una iluminación perfecta es esencial para los videos de alta resolución para la tarea de caminar por el haz y la tarea de caminar por el peldaños de la escalera. Esta alta calidad de vídeo no se puede alcanzar cuando se realizan experimentos en la oscuridad. 
La evaluación de la marcha requiere un rendimiento continuo de la tarea. El primer aspecto importante de una tarea continua es convencer a los animales para que crucen la configuración. Para aumentar la motivación, coloque pequeños pellets de alimentos (45 mg) al final de la configuración. Para que los animales se familiaricen con los pellets de alimentos, los pellets deben alimentarse con ellos antes de la prueba. Además, un cuadro de meta al final de la configuración puede ser útil. La configuración de la Pasarela ya incluye una caja de meta, pero las ratas a veces dudan en entrar en la caja de la meta. Alternativamente, puede agregar una jaula pequeña en la caja de la meta, pero la jaula casera de las ratas no cabe en la caja de la meta. Deje que la rata habitúe en la jaula durante unos minutos antes de la adquisición. Además, otra rata de la misma jaula de casa se puede colocar en la caja de la meta o en la jaula dentro de la caja de la meta. Asegúrese de que la segunda rata permanece en la caja y no bloquea la entrada a la caja de la meta. Además, también es posible quitar la caja de meta del sistema CatWalk y colocar la jaula de la casa de la rata al final de la pasarela, lo que permite a la rata entrar en su "territorio de origen" después de cada carrera. Para la configuración de la tarea de caminar por la viga y la tarea de caminar peldaños de escalera, recomendamos agregar una caja de meta o la jaula de inicio al final de la configuración. Para garantizar la consistencia, la pasarela, la tarea de caminar por la viga y la tarea de caminar por el peldaños de la escalera deben realizarse al menos una vez a la semana con seis a diez carreras.
Aunque no todos los análisis arrojaron diferencias significativas en este estudio, considere que una inclusión de animales modificados genéticamente o grupos de tratamiento podría producir datos valiosos que puedan distinguir entre grupos de las mismas pruebas de comportamiento. 
Lesión del agobio del nervio no tenía ningún efecto sobre la actividad locomotriz de la rata, que fue medida en cinco minutos OFT. El análisis de la marcha de la pasarela XT es una herramienta más objetiva y sensible para analizar la colocación de la marcha, la pata y el dedo deldo del pies. Después de un entrenamiento intensivo, las ratas aprenden a cruzar la pasarela del aparato CatWalk XT a la configuración predeterminada. La lesión nerviosa no reduce la capacidad de las ratas para cruzar la pasarela. El cómputo automático de varios parámetros presenta los datos objetivamente. Se puede obtener información adicional mediante el uso del módulo "Mediciones interactivas de la huella" y, de hecho, estos análisis arrojaron diferencias significativas en varios parámetros de la dispersión del dedo del pie, la longitud de impresión y el ángulo de la pata con el eje del cuerpo comparando ratas con y sin lesión nerviosa.
Las ratas se pueden entrenar fácilmente para la tarea de caminar por la viga. Las diferencias en el tiempo de latencia para cruzar la viga y en el número de resbalones del pie por paso de la extremidad posterior lesionada por nervio se detectaron comparando ratas ingenuas con ratas aplastadas. Una desventaja de analizar ratas lesionadas por los nervios con la tarea de caminar por el haz es el tamaño del haz. Dentro de las primeras dos semanas después de la lesión por aplastamiento del nervio ciático, las ratas necesitan ayuda para cruzar el haz a medida que su equilibrio se deteriora. Aunque algunas ratas pueden ser capaces de cruzar el haz, el riesgo de lesiones causadas por una caída es alto. Por lo tanto, se debe ayudar a los animales aplastados por los nervios a cruzar el haz durante las dos primeras semanas después de la lesión por aplastamiento del nervio ciático o más tiempo, si es necesario. Sin embargo, es difícil comparar las carreras con y sin ayuda. Además, el equilibrio motor es un parámetro importante evaluado por la tarea de caminar por el haz. Considerábamo este parámetro para no ser relevante a nuestro modelo de la rata del aplastamiento del nervio. Por lo tanto, las puntuaciones descritas por Ohwatashi et al. y Johansson &ohlsson no pudieron ser utilizadas y las corridas con un recorrido de haz incompleto fueron excluidas para el análisis de los datos18,19.
La escala de 7 categorías de Metz et al. puede analizar tanto las extremidades anteriores como las posteriores y distinguir entre los diferentes niveles de gravedad de los errores de todas las extremidades durante la tarea de caminar por el peldaños de la escalera16,17. Analizando los errores más prominentes, que incluyen las categorías a partir de la 0 a 2, ningunas diferencias de errores por el paso se podrían detectar en el hindlimb al comparar las ratas nervio-heridas del peso con las ratas ingenuas del peso. Además, el tiempo de latencia de atravesar el aparato de peldaños de escalera no difirió entre las ratas wt lesionadas por el nervio y las ratas ingenuas wt. Los modelos de aprendizaje profundo podrían mejorar y acelerar el análisis de datos de la tarea de caminar por el peldaños de la escalera a través de un enfoque automatizado.
Es importante mencionar que la lesión por aplastamiento nervioso, así como todas las pruebas de comportamiento descritas, se pueden traducir fácilmente a los ratones, adaptando los ajustes y tamaños de las configuraciones. El uso de ratones como organismo modelo tiene el efecto beneficioso que existen modelos transgénicos para muchas enfermedades humanas.

Los roedores son excelentes organismos modelo para profundizar en la comprensión de las enfermedades humanas1,2 probando hipótesis en múltiples niveles biológicos. Un nivel biológico fundamental para la caracterización de modelos de roedores es el nivel de fenotipo, medido por evaluaciones de comportamiento. Dependiendo del modelo animal y de la pregunta de investigación científica, la selección de una batería de prueba de comportamiento potente y fiable es esencial para cubrir una amplia gama de aspectos conductuales, como para los modelos animales de la enfermedad de Parkinson y la distonía3,4,5,6.
El nervio ciático es el nervio más grande del cuerpo humano con fibras motoras y sensoriales. Las lesiones del nervio ciático pueden resultar fácilmente de una variedad de eventos tales como accidentes de tráfico y cirugías7,8. Por lo tanto, las actividades de investigación que utilizan modelos de roedores con lesiones del nervio ciático, son de valor traslacionalmente relevante. A pesar de que el aspecto traslacional de la regeneración nerviosa de rata a humano tiene que ser considerado críticamente9,la lesión por aplastamiento del nervio ciático (axonotmesis) en modelos de roedores es un método comúnmente utilizado para analizar los procesos de degeneración y regeneración de los nervios periféricos10,11. En caso de una lesión por aplastamiento, el nervio no está completamente transectado. Daña el axón, resultando en un bloqueo de conducción directamente después de la lesión por aplastamiento seguido de procesos regenerativos 4,12,13.
Por otra parte, en la investigación de la distonía, la lesión unilateral por aplastamiento del nervio ciático es un método establecido para desencadenar movimientos similares a la distonía (DLM) en modelos de roedores de distonía genéticamente predispuestos, que no muestran DLM per se4,14. Se supone que el traumatismo nervioso periférico perturba la integración sensoriomotora al afectar las fibras nerviosas ciáticas, responsables de las funciones motoras y sensoriales15.
Aquí proporcionamos una descripción detallada para una lesión estandarizada por aplastamiento del nervio ciático y una batería de evaluaciones de comportamiento motor que se compone de la prueba de campo abierto (OFT), análisis de la marcha de CatWalk XT, tarea de caminar por la viga y tarea de caminar peldaños de escalera en ratas de tipo salvaje ingenuo (wt) (n = 8-9) y ratas wt cinco semanas después de la lesión unilateral por aplastamiento del nervio ciático (n = 10). La OFT proporciona información sobre la actividad locomotora general, mientras que un análisis detallado de la marcha se logra mediante el sistema automatizado de análisis de la marcha CatWalk XT. La tarea de caminar por el haz se utiliza para evaluar la coordinación motora mediante la evaluación del tiempo para cruzar el haz y el número de errores de colocación del pie. Para el análisis del rendimiento de la marcha, la tarea de caminar peldaños de escalera proporciona información sobre la colocación de pies o patas y errores en un aparato de peldaños de escalera horizontal con un patrón de peldaños constante pero irregular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, &#8805;99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33209-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Appose ULC skin stapler 35W</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8886803712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen eye cream</td>
			<td>Bayer Vital GmbH</td>
			<td>81552983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Box for OFT</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camcorder GC-PX100</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catwalk XT</td>
			<td>Noldus</td>
			<td></td>
			<td>&#160;setup and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber for isofluran</td>
			<td>GT-Labortechnik</td>
			<td></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpel No. 11</td>
			<td>Feather</td>
			<td>20.001.30.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr&#228;ger Vapor 19.3 isoflurane system</td>
			<td>Dr. Wilfried M&#252;ller GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #2 - laminectomy forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11223-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>super-fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dustless precision pellets 45 mg</td>
			<td>Bio-Serv</td>
			<td>F0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EthoVision XT</td>
			<td>Noldus</td>
			<td></td>
			<td>&#160;setup and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 160 mm</td>
			<td>Hartenstein</td>
			<td>PZ09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia mask, rat</td>
			<td>Dr. Wilfried M&#252;ller GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goal box for ladder rung walking task apparatus</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clipper Magnum 5000</td>
			<td>Wahl GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating table</td>
			<td>MEDAX</td>
			<td>13801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>1214</td>
			<td>prescription needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinovea</td>
			<td>www.kinovea.org</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ladder rung walking task apparatus</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needleholder</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>20-526-14-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octeniderm</td>
			<td>Sch&#252;lke</td>
			<td>118211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl 50 mg/ml, injectable</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Carprofen, prescription needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band retractors</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer for beam</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer for ladder rung walking task apparatus</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Silkam 4/0 DS 19</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>C0762202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra fine hemostats (non-serrated clamp)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13020-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifactorial assessment of motor behavior in rats after unilateral sciatic nerve crush injury

La inducción de una lesión del nervio periférico es un método ampliamente utilizado en neurociencia para la evaluación de los mecanismos de reparación y dolor, entre otros. Además, en el campo de la investigación de los desordenes de movimiento, lesión ciática del agobio se ha empleado para accionar un distonía-como fenotipo en modelos genético predispuestos del roedor de DYT-TOR1A de la distonía. Para lograr resultados consistentes, reproducibles y comparables después de una lesión por aplastamiento del nervio ciático, un método estandarizado para inducir el aplastamiento nervioso es esencial, además de una caracterización fenotípica estandarizada. Se debe prestar atención no solo a la variedad específica de pruebas de comportamiento, sino también a los requisitos técnicos, la correcta ejecución y el análisis de datos consecutivos. Este protocolo describe en detalle cómo realizar una lesión por aplastamiento del nervio ciático y proporciona una batería de prueba de comportamiento para la evaluación de los déficits motores en ratas que incluye la prueba de campo abierto, el análisis de la marcha de CatWalk XT, la tarea de caminar por la viga y la tarea de caminar por peldaños de escalera.

Los resultados representativos de los cinco minutos de OFT muestran que la lesión por aplastamiento nervioso cinco semanas después de la cirugía no tiene ningún efecto sobre la actividad locomotriz (Figura 1).
El análisis de la marcha con el sistema CatWalk XT(Figura 2)genera muchos parámetros diferentes. Los parámetros selectivos se analizaron estadísticamente comparando ratas wt ingenuas con ratas wt lesionadas por los nervios cinco semanas después del aplastamiento nervioso (Figura 2D). Se pudieron detectar alteraciones significativas para la velocidad promedio de carrera, la longitud de la zancada y el área de impresión de la pata trasera (derecha) lesionada por los nervios. Un análisis más detallado de la pata trasera nervio-lesionada fue realizado con el módulo de las "medidas interactivas de la huella". Una reducción significativa de los parámetros de la extensión del dedo del pies, de la extensión intermedia del dedo del pies y de la longitud de la impresión fue observada en ratas nervio-heridas del peso comparadas a las ratas ingenuas del peso. Además, el eje del cuerpo del ángulo de la pata y el vector de movimiento del ángulo de la pata difieren significativamente cuando se comparan las ratas wt lesionadas por los nervios con las ratas wt ingenuas (Figura 2E).
La Figura 3 presenta los datos de coordinación motora obtenidos a través de la evaluación de tareas de marcha de haz. Las ratas wt lesionadas por los nervios mostraron un tiempo de latencia significativamente mayor para cruzar el haz en comparación con las ratas wt ingenuas cinco semanas después de la lesión (Figura 3B). Como lectura adicional de la tarea de caminar de la viga, los resbalones completos y los medios resbalones de la extremidad posterior nervio-lesionada fueron contados y considerados como error para el análisis estadístico. El porcentaje de errores por paso de la extremidad posterior (derecha) nervio-lesión fue aumentado perceptiblemente de ratas nervio-heridas del peso comparadas a las ratas ingenuas del peso.
Los datos representativos de la tarea de caminar peldaño de escalera (Figura 4) no muestran alteraciones significativas en el tiempo de latencia para cruzar la pasarela del aparato de peldaño de escalera (Figura 4C) o en el porcentaje de errores por escalón de la extremidad posterior lesionada por los nervios (derecha) (Figura 4D). El análisis del porcentaje de error por paso de la extremidad posterior lesionada por el nervio consideró sólo la puntuación de 0 a 2 de la escala de 7 categorías de Metz et al. La distribución de todas las categorías de puntuación por paso de la escala de 7 categorías de la extremidad posterior lesionada por los nervios y la extremidad posterior no lesionada por los nervios (izquierda) se ilustra en la Figura 4E.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig01.jpg"> Figura 1:Evaluación de la actividad locomotriz durante la prueba de campo abierto. (A) Imagen de la configuración de la prueba de campo abierto. Imagen seleccionada restada de un video grabado durante la prueba de campo abierto que muestra una rata en la arena de campo abierto sin (B) y con (C) seguimiento. (d) La velocidad durante una grabación de prueba de campo abierto de cinco minutos se investigó en ratas y ratas wt ingenuas wt cinco semanas después de lesión por aplastamiento nervioso. Los datos se muestran como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t no emparejada de los datos distribuidos normalmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig02.jpg"> Figura 2:Análisis de la marcha con el sistema CatWalk XT. (A) Imagen del aparato CatWalk XT. (B) Ejemplos de la vista de impresión que muestra las huellas de patas etiquetadas en modo de color falso y ejemplos de la vista de temporización que muestra el diagrama de marcha basado en el tiempo de ratas y ratas wt ingenuas wt cinco semanas después de la lesión por aplastamiento nervioso. (C) Ejemplos de la clasificación del dedo del pie que muestra la extensión del dedo del pie (TS), la extensión intermedia del dedo del pie (ITS) y la longitud de impresión (PL), así como ejemplos de la vista del eje del cuerpo que muestra el eje del cuerpo (línea blanca) y el vector de movimiento (línea roja) de las ratas wt ingenuas y las ratas wt cinco semanas después de la lesión por aplastamiento nervioso. (D) Datos de parámetros seleccionados de la clasificación "estándar" que compara ratas noïve del peso y ratas del peso cinco semanas después de lesión del aplastamiento del nervio. (E) Datos de parámetros seleccionados del "módulo de mediciones interactivas de la huella" que comparan ratas noïve wt y ratas wt cinco semanas después de la lesión por aplastamiento nervioso. Los datos se muestran como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t no emparejada de los datos distribuidos normalmente, la prueba t no emparejada con la corrección de Welch de los datos normalmente distribuidos con varianza desigual y la prueba U de Mann-Whitney de los datos distribuidos no normales. El valor p < 0,05 se definió como estadísticamente significativo etiquetado como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig03.jpg"> Figura 3: Análisis de la marcha con la tarea de caminar por el haz. (A) Imagen y dibujos esquemáticos de la configuración de la tarea de caminar por el haz. El tiempo del estado latente de cruzar la viga (b) y los errores del resbalón del pie del porcentaje por el paso de la extremidad posterior nervio-lesión durante la tarea que caminaba de la viga (c) eran analizados en ratas ingenuas del peso y ratas del peso cinco semanas después de lesión del agolpamiento del nervio. Imagen representativa para la posición de la hora de inicio (D) y la posición de la hora de finalización (E) de la tarea de caminar por el haz. Secuencia de imagen representativa de un error de deslizamiento completo (F) y un error de deslizamiento medio (G) de la tarea de caminar por el haz. Los datos se muestran como media ± sem. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba U de Mann-Whitney de los datos distribuidos no normales. El valor p < 0,05 se definió como estadísticamente significativo etiquetado como *p < 0,05, **p < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig04.jpg"> Figura 4: Análisis de la marcha utilizando la tarea de caminar peldaños de escalera. Imagen (A) y dibujos esquemáticos (B) de la configuración de la tarea de caminar peldaños de escalera. La época del estado latente de atravesar el aparato del peldaño de la escalera (c) y los errores del resbalón del pie del porcentaje por el paso de la extremidad posterior nervio-lesión durante la tarea que caminaba del peldaño de la escalera (d) fueron evaluados en ratas ingenuas del peso y ratas del peso cinco semanas después de lesión del agolpamiento del nervio. (E) La distribución porcentual de la categoría de puntuación por paso según la escala de 7 categorías de Metz et al. para el hindlimb izquierdo y derecho de las ratas ingenuas del peso y de las ratas del peso cinco semanas después de lesión del agobio del nervio. Los datos se muestran como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t no emparejada de los datos distribuidos normalmente y la prueba U de Mann-Whitney de los datos distribuidos no normales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62606/62606fig05.jpg"> Figura 5: Representación ejemplar de cada categoría según la escala de 7 categorías de Metz et al. durante la tarea de caminar peldaños de escalera. Secuencia de imagen representativa de la extremidad posterior derecha de la categoría 0 - falta total, categoría 1 - deslizamiento profundo, categoría 2 - ligero deslizamiento, categoría 3 - reemplazo, categoría 4 - corrección, durante la tarea de caminar peldaños de escalera. Imágenes representativas para la categoría 5 - colocación parcial y categoría 6 - colocación correcta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62606/62606fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>

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Multifactorial Assessment of Motor Behavior in Rats after Unilateral Sciatic Nerve Crush Injury

Proporcionamos un protocolo para la evaluación del comportamiento motor a través de una batería de prueba de comportamiento en ratas después de una lesión por aplastamiento del nervio ciático.

Evaluación Multifactorial Del Comportamiento Motor En Ratas Después De La Lesión Unilateral Por Aplastamiento Del Nervio Ciático

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In ...

La meta total de este protocolo es describir los procedimientos implicados en la realización de aplastamiento irreproducible del nervio ciático, y proporcionar un protocolo para el gravamen del comportamiento del motor después de trauma periférico. La selección de una batería de prueba de comportamiento potente y confiable es esencial para cubrir una amplia gama de aspectos de comportamiento, y depende del modelo animal utilizado y la pregunta de investigación científica. Este protocolo describe detalladamente cómo realizar una lesión del aplastamiento del nervio ciático y proporciona una batería de la prueba del comportamiento para el gravamen de los déficits del motor en ratas, que incluya la prueba de campo abierto, el análisis del paso de la pasarela, la tarea que camina de la viga, y la tarea que camina del peldaños de la escalera.Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices nacionales e institucionales aplicables para el cuidado y el uso de animales. Mantenga un ambiente estéril durante todo el procedimiento quirúrgico. Configure la mesa de cirugía con el equipo necesario.Anestesiar profundamente a la rata en un gabinete cerrado con isoflurano y afeitarse una extensa área de la extremidad posterior derecha. A continuación, coloque la rata en la máscara de anestesia y continúe la anestesia profunda con isoflurano. Fije el torso y ambas extremidades traseras de la rata con cinta adhesiva.Coloque ambas extremidades traseras en una posición simétrica y extendida y gire cada pata plana sobre la mesa de cirugía. Desinfecte la piel de la zona afeitada con un antiséptico adecuado. Busque la muesca ciática del íleon.Haga una incisión en la piel desde la muesca ciática en la dirección de la pata con un bisturí. Si las extremidades posteriores están fijas y la incisión de la piel se realiza correctamente, se puede ver una cavidad en el plano fascial entre el músculo glúteo máximo y el músculo bíceps femoral que se asemeja a una línea blanca. Inserte las lórceps hemostáticas súper finas cerradas en la cavidad y extienda las fuerzas.El plano fascial debe abrirse sin lesionar ningún tejido muscular. Coloque los retractores de banda elástica debajo de los músculos para mantener la incisión de la piel abierta. Retire suavemente cualquier tejido circundante y vasos sanguíneos del nervio ciático hasta que el nervio esté completamente expuesto.Es importante no estirar o tirar del nervio durante todo el procedimiento. Aplaste el nervio ciático con una abrazadera no aserrada con presión utilizable constante y rápida. Para esto, abra la abrazadera, coloque el nervio en la mandíbula inferior de la abrazadera y cierre la abrazadera bloqueándola en la primera posición durante 3 x 10 segundos.Después de la lesión por aplastamiento, vuelva a abrir la abrazadera con cuidado. el sitio del agobio del nervio ciático aparece translúcido. Retire los retractores de banda elástica.Cierre la incisión del plano fascial con una sutura reabsorbible. Cierre la incisión de la piel con grapas en la piel del cuerpo. La actividad locomotriz, así como la actividad conductual de las ratas se pueden analizar mediante una prueba de campo abierto.La configuración del campo abierto, que debe estar ubicado en un entorno oscuro y silencioso, consiste en el sistema de seguimiento de video automatizado, EthoVision XT, y una arena con una superficie negra limpiable y resistente a los arañazos. Coloque la arena y la cámara en la posición correcta y configure el software EthoVision XT. Coloque la rata suavemente en el centro de la arena de pruebas.Durante la grabación, el experimentador debe mantenerse alejado del campo abierto configurado, con el fin de evitar distraer a la rata. Para el análisis de datos de la prueba de campo abierto, vaya a la sección de análisis en la barra lateral izquierda y elija Seguimiento de visualización"en la pestaña Resultados". A continuación, exporte los parámetros necesarios a XL.Within el software, elija una serie de variables de diferentes categorías para el análisis de datos.Un análisis de la marcha por el sistema CatWalk XT puede ayudar a evaluar muchos parámetros diferentes relacionados con las huellas, la postura y la marcha de los modelos animales. Una pasarela de cristal se ilumina con luz verde y la luz dispersada por las huellas de los animales se captura con una cámara de vídeo de alta velocidad, que se encuentra debajo de la pasarela. Las señales se pueden analizar con el software CatWalk XT.El experimento tiene que realizarse en condiciones oscuras. Comience configurando el sistema CatWalk XT. Elija la configuración experimental.Coloque la cámara en su posición y ajuste el enfoque. Configure la configuración de detección. Configure las paredes del pasillo del sistema CatWalk y asegúrese de que las paredes permanezcan paralelas a la pasarela.Defina la longitud de la pasarela y calibre la pasarela. A continuación, ajuste una imagen de fondo. Se necesita una pasarela limpia y vacía para la imagen de fondo.La rata debe cruzar la pasarela sin ninguna interrupción. De acuerdo con los criterios de ejecución definidos, se necesitan tres corridas compatibles por rata para el análisis de datos. Entrene a los animales durante al menos ocho días antes de comenzar con el experimento real.La Pasarela debe realizarse al menos una vez a la semana, con 6 a 10 corridas para garantizar un rendimiento continuo de la tarea. Para el análisis de datos, evalúe solo las ejecuciones compatibles. Clasifique las impresiones de patas automáticamente con el software CatWalk XT.Revise las etiquetas de impresión de pata manualmente. Corrija las etiquetas de impresión de patas incorrectas, agregue etiquetas de impresiones de patas no detectadas y elimine cualquier ruido y etiquetas incorrectas. Los resultados numéricos se muestran en una hoja XL, que muestra una serie de parámetros básicos.Para obtener información más detallada sobre cada huella, clasifique los dedos de las patas traseras. Este análisis requiere el módulo interactivo de mediciones de huellas. Establezca los marcadores para el análisis de huella manualmente.Analice cada impresión de pata trasera en las tres corridas compatibles. Dibuje una línea desde el centro del primer dedo del día hasta el centro del quinto dedo del día para medir la dispersión del dedo deldo del día. Dibuje una línea desde el centro del segundo dedo deldo del piso hasta el centro del cuarto dedo del piso para medir la dispersión intermedia del dedo deldo deldo del artículo.Dibuje una línea desde el centro del tercer dedo del pie hasta el talón de la pata trasera para medir la longitud de impresión manual. Revise los resultados numéricos de las mediciones interactivas de la huella que se muestran en una hoja separada. Los déficits de la marcha se pueden determinar por la tarea que camina de la viga.El enfoque de la tarea de caminar por el haz en este tema de investigación específico será el análisis de la coordinación motora y no la evaluación del equilibrio motor. Para la tarea de caminar por el haz, se necesita un haz, espaciador, mesa, fondo uniforme y una videocámara. Utilice una viga de madera de 90 centímetros de largo, 1,7 centímetros de ancho y 2 centímetros de alto.Entrena a los animales durante siete días. Coloque la rata en la plataforma de arranque de la viga. La rata debe cruzar la viga tres veces sin ninguna interrupción.Incluso si la rata alcanza tres corridas compatibles dentro de las primeras tres corridas, se debe llevar a cabo un mínimo de 6 a 10 corridas para el rendimiento continuo de la tarea. Seleccione las secuencias de vídeo de tres corridas compatibles de la grabación. Defina el punto de hora de inicio y el punto de hora de finalización de las tres ejecuciones compatibles seleccionadas.Aquí, el punto de tiempo de inicio está etiquetado por una línea negra en el haz, y la colocación de la primera extremidad posterior detrás de la línea negra se define como el punto de tiempo de inicio de la carrera. La colocación de la primera extremidad trasera en la plataforma al final de la viga define el punto de tiempo final. A continuación, calcule el tiempo necesario para que la rata cruce la viga.Puntuar el número de pasos y errores de tres corridas compatibles para ambas extremidades traseras por separado, mediante el uso de la función de zoom y cámara lenta del software. Los errores incluyen resbalones totales de pies y resbalones de medio pie. Un deslizamiento total del pie se define como una colocación del pie que es seguida por un deslizamiento profundo, causando una pérdida de contacto de la pata afectada con la viga.Un medio deslizamiento se define como la pata que se desliza fuera de la pared lateral de la viga sin perder el contacto completo. Calcular el porcentaje de deslizamientos de pie en relación con el número de pasos para cruzar la viga. La tarea de caminar peldaños de escalera puede evaluar la función motora, la colocación de las extremidades delanteras y traseras, y la coordinación entre las extremidades.Se necesita un aparato de peldaños de escalera, espaciador, mesa, fondo uniforme y videocámara para esta prueba de comportamiento. El aparato de peldaños horizontales consiste en peldaños metálicos y paredes laterales de policarbonato transparente. Entrena a los animales durante ocho días.Coloque la rata en la zona de inicio de los operadores de peldaños de escalera. La rata tiene que cruzar la pasarela de 100 centímetros del aparato de peldaños de escalera tres veces sin interrupción, para que pueda calificar como una carrera compatible. Seleccione las secuencias de vídeo de tres corridas compatibles de la grabación.Defina el punto de hora de inicio y el punto de hora de finalización de las tres ejecuciones compatibles seleccionadas. La colocación de la extremidad trasera detrás de la primera línea negra en la pared lateral del aparato define el punto de tiempo de inicio de la carrera. La colocación de la primera extremidad frontal detrás de la segunda línea negra en la pared lateral del aparato define el punto de tiempo final de la carrera.A continuación, calcule la duración de la carrera a través de la pasarela. Puntuar las tres corridas compatibles con la escala de 7 categorías de Mets y colegas mediante el uso de la cámara lenta o la función fotograma a fotograma del software. Determine el número de pasos y el número de errores de acuerdo con las categorías de la escala para cada miembro por separado.La escala distingue entre las siguientes categorías. Falta total. Resbalón profundo.Ligero resbalón. Replacement.Correction. Colocación parcial. Y correcta colocación.A continuación, calcule los errores por paso. Los resultados representativos de la prueba de campo abierto de cinco minutos muestran que la lesión por aplastamiento nervioso, cinco semanas después de la cirugía, no tiene ningún efecto sobre la actividad locomotriz. El análisis de la marcha con el sistema CatWalk XT genera muchos parámetros diferentes.Se pudieron detectar alteraciones significativas para la velocidad promedio de carrera, la longitud de la zancada y el área de impresión de la pata trasera derecha lesionada por los nervios. Las ratas de tipo salvaje lesionadas por los nervios mostraron un tiempo de latencia significativamente mayor para cruzar la viga, en comparación con las ratas ingenuas de tipo salvaje cinco semanas después de la lesión. Como lectura adicional de la tarea de caminar de la viga, los resbalones completos y los medios resbalones del miembro trasero nervio-dañado fueron contados y considerados como error para el análisis estadístico.El porcentaje de errores por paso del miembro posterior derecho nervio-dañado fue aumentado perceptiblemente del tipo salvaje nervio-dañado ratas, comparadas al tipo salvaje ratas ingenuas. Los datos representativos de la tarea de caminar peldaños de escalera no muestran alteraciones significativas en el tiempo de latencia para cruzar la pasarela del aparato de peldaños de escalera, o en el porcentaje de errores por paso del miembro posterior derecho lesionado por nervio. El análisis del porcentaje de error por paso del miembro posterior lesionado de nervios consideró solo la puntuación de 0 a 2 de la escala de 7 categorías de Mets y colegas.Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo realizar una lesión por aplastamiento del nervio ciático, y cómo implementar una evaluación multifactorial del comportamiento motor en ratas después del aplastamiento unilateral del nervio ciático. Para lograr resultados consistentes, reproducibles y comparables después de una lesión por aplastamiento del nervio ciático, un método estandarizado para inducir el aplastamiento nervioso es esencial, así como una caracterización fenotípicamente estandarizada. El entrenamiento adecuado para la prueba de comportamiento específica proporciona las ventajas de ahorrar tiempo durante la evaluación del experimento y obtener mejores resultados.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Axoplasma de aislamiento de nervio ciático de rata

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

Investigación

Neurociencias

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Un aplastamiento del nervio óptico Lesiones modelo murino para estudiar la supervivencia de células ganglionares retinianas

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Nerve Excitability Assessment in Chemotherapy-induced Neurotoxicity

Evaluación de la excitabilidad en los nervios inducidos por la quimioterapia Neurotoxicidad

Chemotherapy-induced neurotoxicity is a serious consequence of cancer treatment, which occurs with some of the most commonly used chemotherapies1,2. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Ratón reproducible aplastamiento del nervio ciático y posterior evaluación de la regeneración mediante el análisis de músculo entero Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Rastreo Selectivo de Fibras auditivo en el nervio vestíbulo coclear aviar embrionarias

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Unilateral Pyramidotomy of the Corticospinal Tract in Rats for Assessment of Neuroplasticity-inducing Therapies

Unilateral Pyramidotomy del Tracto corticoespinal en ratas de Evaluación de Terapias Neuroplasticity inductores

The corticospinal tract (CST) can be completely severed unilaterally in the medullary pyramids of the rodent brainstem. The CST is a motor tract that has ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

En Vivo Transferencia de genes a células de Schwann en el nervio ciático de roedores mediante electroporación

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Análisis cinemático 3D para la evaluación funcional en el modelo de rata de lesión de aplastamiento de nervios ciáticos

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Measuring and Manipulating Functionally Specific Neural Pathways in the Human Motor System with Transcranial Magnetic Stimulation

Medición y manipulación de vías neuronales funcionalmente específicas en el sistema motor humano con estimulación magnética transcraneal

Understanding interactions between brain areas is important for the study of goal-directed behavior. Functional neuroimaging of brain connectivity has ...