Name: digital-droplet pcr to detect indels mutations in genetically modified anopheline mosquito populations
Uploaded: 2021-06-28T14:00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations at JoVE.com

Finansieringen blev ydet af University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ er donald Bren professor ved University of California, Irvine.

1. DNA-udvinding
<ol><li>Klargør EDTA/Nuclei Lysis Buffer (EDTA/NLS) med forholdet mellem 500 μL NLS og 120 μL EDTA pr. prøve. Opskalering for flere prøver. Chill blandingen på is. BEMÆRK: Opløsningen bliver overskyet i 2-5 min, når den afkøles afhængigt af lydstyrken.</li>
	<li>Homogenisere myggeprøven ved hjælp af en mekanisk homogenisator til 10-15 s i et 1,5 mL mikrocentrifugerør fyldt med 600 μL KØLET EDTA/NLS blandes grundigt.</li>
	<li>Der tilsættes 17,5 μL på 20 mg/mL Proteinase K til røret og blandes grundigt.</li>
	<li>Inkuberes natten over ved 55 °C. Alternativt inkuberes prøven ved 55 °C i 3 timer med rysten og hvirvlen prøven hver 1 h.</li>
	<li>Tilsæt 200 μL proteinudfældningsopløsning til rumtemperaturprøven og hvirvler kraftigt i 20 s.</li>
	<li>Chill prøven i 5 minutter på is.</li>
	<li>Centrifugere prøven til pellet proteiner på 15.890 RCF i 4 min.</li>
	<li>Ryk forsigtigt supernatanten, som indeholder DNA'et, og overfør det til et rent 1,5 mL mikrocentrifugerør, der indeholder 600 μL isopropanol.</li>
	<li>Bland forsigtigt opløsningen ved at vende røret 5-10 gange. Centrifuge i 1 min ved 15.890 RCF. Forsigtigt dekanter supernatanten, mens DNA-pellet bevares.</li>
	<li>Tilsæt 600 μL stuetemperatur 70% ethanol. Vask det pelleterede DNA ved forsigtigt at vende røret.</li>
	<li>Centrifuge i 1 min ved 15.890 RCF. Fjern forsigtigt supernatanten ved at ønske ved hjælp af en glaspipettespids.</li>
	<li>Vend røret på rent absorberende papir og lufttørre pellet i 10-15 min.</li>
	<li>Brug DNA'et igen med pcr-vand. Brug 20 μL pr. individuel myggeprøve eller 100 μL til 10 poolede myg. BEMÆRK: DNA-ekstraktionsmetoder til myggeprøver ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt sæt (se Materialetabel)er tilpasset fra producentens isolerende genomiske DNA fra vævskulturceller og dyrevævsprotokol.</li>
</ol>2. ddPCR reaktioner og dråbe generation forberedelse
<ol><li>Kvantificer DNA ved hjælp af et fluorometer. BEMÆRK: For drop-off assay, anbefales det at bruge en række 3.000-30.000 haploid genom kopier pr reaktion, som er designet til at opdage NHEJ begivenheder med en HEX-mærkning sonde, der binder sig til en WT sekvens af den målrettede cut site og vil ikke udgløde (drop-off), hvis der er en sletning eller indsættelse på målet site, angiver tilstedeværelsen af en NHEJ-variant.</li>
	<li>Beregn kopinummeret ved hjælp af haploid genomvægten og koncentrationen af DNA i ekstraktet. Dette gøres ved at multiplicere koncentrationen af det ekstraherede DNA med det volumen, der bruges til at opnå den samlede DNA-masse, og derefter dividere den med haploid genomvægten. Sørg for, at den tilsatte volumen er mellem 1-10 μL. Fortynd efter behov for at være i det anbefalede haploide genomkopieringsområde. BEMÆRK: En Anopheles gambiae haploid genom anslås at være 0,27 pg per voksen myg10.</li>
	<li>Design primere og sonder. Design frem og omvendte oligonukleotidgrundere med en Primer Melting Temperature (Tm) i intervallet 55-60 °C, der flankerer 5'- og 3'-enderne på gRNA-målstedet, der producerer en amplicon på 150-400 bp.<ol>
<li>HEX (Hexachlor-fluorescein)-mærket sonde til NHEJ detektion: Design en oligonuleotid på ~ 15-20 bp i længden supplerer målet site og tilføje HEX-sonde til 5'-end og BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) til 3 'ende. Hydrolysesondens Tm skal være 3-10 °C højere end primernes Tm.</li>
		<li>FAM (6-carboxyfluorescein)-mærket sonde til reference WT: Design en oligonuleotid ~ 15-20 bp i længden supplerer en bevaret genom site fjernt (ca. 25 bp) fra målet stedet og tilføje FAM-sonde til 5'-end og BHQ1 til 3 'ende. Hydrolysesondens Tm skal være 3-10 °C højere end primernes Tm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PCR reaktion forberedelse
<ol><li>25 μL af ddPCR-prøveblandingen med følgende komponenter: ddPCR-supermix til sonder (ingen UTP): 12,5 μL, frem- og omvendte primere (10 μM): 1 μL hver, HEX/FAM-sonder (10 μM): 0,625 μL hver, DNA: 1-5 μL (3.750-37.500 haploide genomkopier) og vand: op til 25 μL.</li>
	<li>Bland reaktionerne grundigt ved at hvirvle eller refluks pipetter (op og ned) (20x). BEMÆRK: Hvis reaktionerne er i en 96-brønd plade, pipette hele volumen op og ned 20 gange i stedet for hvirvlende for at undgå boble dannelse.</li>
	<li>Centrifugere prøverne kortvarigt for at afregne blandingen i bunden af røret eller godt. BEMÆRK: Sørg for, at reaktionerne er ved stuetemperatur for dråbegenerationen. Forbered 1x ddPCR mix for ekstra / ubrugte brønde i hver patron (hver patron har 8 brønde).</li>
</ol>4. Dråbe generation
<ol><li>Ved hjælp af en 50 μL multikanal pipette skal du lægge 20 μL af ddPCR-prøveblandingen i patronens midterste række (Figur 1A, øverst).</li>
	<li>Hæld 70 μL af olien i nederste række. Læg 20 μL 1x ddPCR supermix i ubrugte brønde. BEMÆRK: Der må ikke indføres bobler.</li>
	<li>Placer pakningen rører kun kanterne, undgå centrum konkavede område (Figur 1B).</li>
	<li>Placer pladen sikkert i dråbegeneratoren, og luk dækslet for at starte kørslen.</li>
	<li>Brug multikanal pipetten, overføre 40 μL af emersion mix fra den øverste række af patronen (Figur 1A, nederst) i 96-brønd plade.<ol>
<li>Tegn flydende prøve til 3-5 s i en 45-30 ° vinkel. Udvis blandingen langsomt i over 3 s i en 45 ° vinkel ind i siden af brønden, så den kan dryppe ned ad siden. Det er okay at gå til det andet stop (fuldstændig udvisning) af pipetten for at udvise al væsken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ved hjælp af folievarmetætninger forsegles pladerne i 5 s ved 180 °C.</li>
</ol>5. PCR
<ol><li>Placer den forseglede plade i termocyklussen (Figur 1C) og indstil de anbefalede PCR-betingelser, hvis du følger NHEJ Drop-Off-retningslinjerne på følgende måde:<ol>
<li>Indledende denaturering ved 95 °C i 10 min.</li>
		<li>Sæt 40 cyklusser på 94 °C i 30 s til denatur, 55 °C i 1 min til udglød og 60 °C i 2 min for at forlænge.</li>
		<li>Hold ved 98 °C i 10 min.</li>
		<li>Hold ved 4 °C. BEMÆRK: Udglødningstemperaturen for bestemte primere og sondesæt kan optimeres ved hjælp af en termisk gradient. Brug en rampehastighed på 2 °C/s til alle trin. PCR-betingelserne bør justeres afhængigt af hvert eksperimentelt design og set-up.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Dråbeaflæsning
<ol><li>Placer pladen sikkert i dråbelæseren med godt A-1 øverst til venstre (glattet hjørne, de tre andre kantet) (Figur 1D).</li>
	<li>Konfigurer pladen i programmet: Design af FAM som den kendte referencekanal og HEX som den ukendte (Figur 2A).</li>
	<li>Kør Droplet-læseeksperimentet som direkte kvantificering. Når kørslen er færdig, skal du ændre eksperimenttypen til Drop-Off (DOF) for analysen (Figur 2A).</li>
</ol>7. Analyse
<ol><li>Angiv de korrekte eksperimentelle parametre (Figur 2A): Prøveoplysninger, SuperMix, Destinationsnavn (WT eller NHEJ), Måltype (Ref eller Ukendt), Signal Ch1 (HEX eller FAM), Signal Ch2 (HEX eller FAM), og angiv manuelt tærsklen for dråbeantal (anbefal over 10.000 for pålidelige resultater). Softwaren udfører det meste af analysen med den angivne parameter.</li>
	<li>Kontroller antallet af dråber under fanen Dråbe. sikre, at alle er over 10.000 (figur 2B).</li>
	<li>Kontroller 1 D amplitud for effektiv signaladskillelse fra negativer.</li>
	<li>Fremhæv hele pladen i Pladeeditor, og angiv eksperimenttypen til Aflevering.</li>
	<li>Angiv WT-målet som en reference, der angiver kanal et for FAM og kanal to for HEX.</li>
	<li>Sæt NHEJ mål som ukendt, udpege kanal et for FAM og kanal to som ingen.</li>
	<li>Angiv klyngetærsklerne med grafværktøjerne for hvert eksempel under fanen 2D-amplitud. Overvej halen, der er forbundet med WT-klyngen. dette er normalt for NHEJ-analyser (figur 3A). BEMÆRK: Klik på gearikonet øverst til højre på grafen under fanen Forhold. Vælg den fraktionerede overflod. Grafen vil nu afbilde et punkt svarende til procentdelen af NHEJ-hændelser (figur 3B).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li><li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae.">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).</li><li>Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Bo&#235;te, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agricultural+pest+control+with+CRISPR-based+gene+drive:+time+for+public+debate:+Should+we+use+gene+drive+for+pest+control.">Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control.</a> EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11, 5553 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+and+direct+Sanger+sequencing+for+the+detection+of+the+BRAFV600E+mutation+in+papillary+thyroid+carcinoma.">Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902 (2019).</li><li>Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+droplet+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+characterizing+DNA+reference+material+for+KRAS+mutation+detection.">Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9650 (2018).</li><li>Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+strategy+for+detecting+CRISPR_Cas9+induced+mutations+using+next-generation+sequencing.">A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 15 (1), 1002 (2014).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+droplet+PCR+and+IDAA+for+the+detection+of+CRISPR+indel+edits+in+the+malaria+species+Anopheles+stephensi.">Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi.</a> Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).</li><li>Holt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298 (5591), 129-149 (2002).</li></ol>

Forfatterne har ingen oplysninger.

Digital-droplet PCR er en effektiv metode til at bestemme tilstedeværelsen af indel alleler som følge af NHEJ begivenheder i en Cas / gRNA-baseret gen-drev system og giver mulighed for kvantificering af hyppigheden af disse alleler hos enkeltpersoner eller befolkninger. Nogle trin i protokollen skal følges med særlig omhu for at opnå pålidelige resultater. For det første skal den genomiske DNA-ekstraktion udføres omhyggeligt for at sikre høj kvalitet og tilstrækkelig mængde. En god ekstraktion vil tillade nøjagtig bestemmelse af haploid genom kopier pr reaktion. Det er vores erfaring, at et kommercielt tilgængeligt sæt (se Materialetabel)konsekvent leverede DNA-ekstraktioner af høj kvalitet. Ekstraktioner af individuelle myg kan dog vise sig at være særligt udfordrende, da DNA-pellet bliver svært at visualisere og let kan suges op med supernatanten, hvis den ikke passer på. For det andet skal primere og sonder udformes omhyggeligt. Før ddPCR-eksperimentet er afsluttet, skal du sikre dig, at de designede primere resulterer i et enkelt PCR-produkt ved først at udføre en traditionel PCR og visualisere et enkelt produkt via gelelektroforese. Reference FAM sonden skal også være konstrueret således, at den supplerer en meget bevaret sekvens. Dette vil sikre nøjagtige opdagelser af WT alleler i hele en forskelligartet befolkning. Primer/sondekombinationerne for hvert unikt eksperiment vil have forskellige termocykelforhold, og det anbefales at optimere disse forhold ved hjælp af en termisk gradient.
Der findes andre metoder til identifikation af indels, f.eks. Sanger sekventering er begrænset, fordi det har en lavere grænse for detektion og lav opdagelse magt til at identificere nye varianter. Sanger sekventering er også arbejdskrævende og er ikke høj-throughput. Sammenlignet med Sanger sekventering, NGS ikke har de samme begrænsninger af lav følsomhed, opdagelse magt, og gennemløb. En anden fordel ved NGS er dens evne til at opdage en række mutationer fra enkelt nukleotidpolymorfi (SNPs) til omlægninger. NGS er imidlertid en dyrere og tidskrævende metode til at bestemme Cas9/gRNA-associerede indels, fordi der kun er en målregion af interesse, og den er bedst egnet til større genom-dækkende analyser. Sammenlignet med de ovennævnte metoder er ddPCR høj gennemløb og har en hurtig turn-around tid. Hvis ddPCR materialer og instrumenter er tilgængelige in-house, 96 prøver kan behandles inden for 1-2 dage, hvilket gør det velegnet til hurtig analyse af store forsøg med Cas9/gRNA-modificerede organismer.
Mens mange fordele findes for ddPCR der er også begrænsninger. For det første er ddPCR-udstyret ikke hyppigt tilgængeligt i et uafhængigt laboratoriemiljø. ddPCR-udstyr kan være tilgængeligt i fællesskab på større forskningsinstitutioner, men dette giver ikke mulighed for nem datagenerering og -analyse uden for institutionen. For det andet giver ddPCR i modsætning til alternativerne ikke de individuelle unikke sekvenser af identificerede indelmutationer. Digital-droplet PCR vil give hyppigheden af indel mutationer i en population, men uden sekvensen, kan man ikke afgøre, om de foreliggende indels er mere tilbøjelige til at bevare eller hæmme funktionen af genet af interesse. DDPCR-metoden er måske bedst egnet til at analysere vilde populationer efter et feltfrigivelsesforsøg af en Cas9 /gRNA-baseret drevorganisme, fordi den effektivt kan bestemme hyppigheden af indførelsen af transgene i den indfødte befolkning og dannelsen af indels i befolkningen i tæt på realtid. På grund af ddPCR hurtig turn-around tid, ville det være muligt at udføre prøveudtagning og analysere befolkningen i et felt forsøg region ugentligt, hvis materialer var tilgængelige lokalt. Opstartsomkostningerne for køb, import og oprettelse af ddPCR-udstyret vil være høje i fjerntliggende laboratorier, men fordelene ved at kunne vurdere en streng vild befolkning, da den er under forandring fra et drevsystem, ville retfærdiggøre omkostningerne.

Gendrev har et enormt potentiale til at kontrollere insektpopulationer af medicinsk og landbrugsmæssig relevans1,2,3,4,5. For eksempel kan gendrevssystemer baseret på CRISPR Cas-nukleaser og guide RNA'er (gRNAs) bruges til at ændre vektormyggepopulationer ved at introducere træk, der giver ildfasthed til malariaparasitter, der fører til reduceret transmission og mindre sygdom1,4,5. Gendrevssystemet kopierer sig selv og det tilhørende træk fra et homologt kromosom til et andet i de præ-meiotiske kimceller, og dette sikrer, at størstedelen af afkomene arver drevet og skaber potentialet for langvarig og bæredygtig befolkningsændring i marken. En ulempe ved de Cas/gRNA-baserede metoder er imidlertid muligheden for at generere indsættelses- og sletningsmutationer (indel) mutationer gennem ikke-homologe end-joinerende (NHEJ) DNA-reparation, hvilket resulterer i generering af drevresistente alleler, som, når de akkumuleres til en høj nok frekvens i befolkningen, kan stoppe drevsystemet i at sprede1,2,3,4 . Denne protokol beskriver en højgennemsigtet og pålidelig metode, der kan bestemme forekomsten og den relative mængde indelmutationer, både på befolkningsniveau og individuelt niveau, under Cas /gRNA-baseret gendrev.
Næste generations sekventeringsmetoder (NGS) giver en løsning uden sidestykke. De omkostninger og tekniske krav , der er forbundet med NGS, forbyder imidlertid rutinemæssig afprøvning og begrænser brugen af den som en metode med høj gennemløb til vurdering af indels6,7,8. Traditionelle PCR-kvantificeringsmetoder har længe været anvendt som standardevalueringsprocedure for genomindels; Disse metoder er imidlertid arbejdskrævende, tager lang tid at skaffe data og har en høj grad af variation. Digital-Droplet PCR (ddPCR) har vist sig at være mere følsomme over for at opdage mutationer end Sanger sekventering i nogle applikationer og har en lavere detektionsgrænse end NGS i andre6,7,8,9. Desuden er omkostningerne til at vurdere et prøvesæt og turn-around-tid for at opnå resultater henholdsvis billigere og hurtigere for ddPCR end enten Sanger sekventering eller NGS9. Ved hjælp af et dual-probe-system identificerer Drop-Off-analysen NHEJ-alleler baseret på fraværet af WT-sekvens (wild-type) på det gRNA-ledede mål Cas9-cut site. I denne analyse forstærkes en kort amplicon, herunder det forventede udskårne sted for det Cas/gRNA-baserede system, med et bestemt primerpar. En fluorescerende sonde er designet til at binde sig til en bevaret region af amplicon og en anden fluorescerende sonde genkender WT sekvens af cut site. I nærværelse af en NHEJ-allel vil sidstnævnte ikke binde sig til ampliconen.
Brugen af ddPCR giver mulighed for at designe primere til at målrette sletninger, enkelt base-par forskelle og indsættelser, som vil give mulighed for NHEJ profilering i myg befolkning analyser9. I betragtning af disse attraktive funktioner skabte vi en protokol til ddPCR til højgennemsigtet påvisning af indels genereret fra et Cas / gRNA-baseret gendrevsystem i myg.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR-grade Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any certified PCR-grade water can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K 20 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward and Reverse oligonucleotide primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital-droplet pcr to detect indels mutations in genetically modified anopheline mosquito populations

De seneste fremskridt inden for myggegenom og genteknologi har skabt et behov for hurtige og effektive metoder til påvisning af målrettet DNA-sekvensvariation i stor skala. Specifikt er det vigtigt at registrere indsættelser og sletninger (indels) på gen-redigerede websteder, der er genereret af CRISPR-guide RNA (gRNA)/Cas9-medieret ikke-homolog end-joining (NHEJ), for at vurdere mytageneseens troskab og hyppigheden af utilsigtede ændringer. Vi beskriver her en protokol for digital-droplet PCR (ddPCR), der er velegnet til høj-throughput NHEJ analyse. Selvom denne metode ikke producerer data, der identificerer individuel sekvensvariation, giver den et kvantitativt skøn over sekvensvariationen i en population. Derudover kan denne protokol med passende ressourcer implementeres i en felt-site laboratorieindstilling lettere end næste generation eller Sanger sekventering. ddPCR har også en hurtigere turn-around tid til resultater end nogen af disse metoder, hvilket giver mulighed for en hurtigere og mere komplet analyse af genetisk variation i vilde populationer under feltforsøg med genetisk manipulerede organismer.

En anvendelse af denne procedure findes i Carballar-Lejarazú et al.9. DDPCR Drop-off assay udnytter to fluorescerende sonder til at skelne WT og indel sekvenser: En FAM sonde binder sig til en bevaret sekvens inden for amplicon, mens HEX sonde mål WT sekvens af det målrettede site (Figur 4A). I nærværelse af en indel vil HEX-sonden ikke binde. De repræsentative resultater findes i figur 2, tabel 1 og tabel 2 i Carballar-Lejarazú et al.9. Ved hjælp af denne protokol har ddPCR vist sig at opdage en bred vifte af CRISPR-Cas9 inducerede NHEJ-hændelser og kvantificere NHEJ-frekvensen i en individuel eller samlet prøve. Femten forskellige poolede prøver af 10 myg indeholdt hver forskellige NHEJ alleler (tabel 2 i Carballar-Lejarazú et al.9). Disse blev analyseret med ddPCR ved hjælp af protokollen og parametrene, der præsenteres her. Resultaterne fra tabel19 viser, at alle 15 prøver, der blev udført 100 % indel alleler som identificeret ved drop-off-analysen (figur 4B). I et andet eksperiment blev 11 poolede prøver af WT myg og NHEJ myg med forskellige NHEJ-procenter (0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% og 100%) undersøgt med denne ddPCR-protokol og resultaterne (figur 2; Carballar- Lejarazú et al.9) viste, at den identificerede procentdel ligger tæt på den sammenlignede teknik med Indel Detection by Amplicon Analysis (Figur 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig01.jpg"> Figur 1: Eksperimentel opsætning og procedure. (A) Patronforberedelse til dråbegenerering. (Øverst) Prøverne fyldes i patronens midterste række, mens olien fyldes i nederste række. (Nederst) Øverste række fyldt med emulgeret dråber efter dråbe generation. (B) Dråbegenerator med en patron fyldt med prøve og dækket af en pakning på plads. (C) 96-brøndsplade dækket af folieforsegling i en Termocyklusr. (D) Dråbelæser med 96-brønd-plade på plads med et metaldæksel låst over pladen for at fastgøre den. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig02.jpg"> Figur 2: Dråbeaflæsning. (A) Softwaregrænseflade til dropletaflæsning. Orange kasser viser brønde med prøver. Grå kasser er tomme brønde. Eksperimentelle parametre konfigureres i panelet Rediger værktøjer (højre side). Hvert eksempel kan redigeres ved at klikke på den respektive prøveboks. Vælg DOF (Drop Off) for eksperimentel type. Udfyld de relevante oplysninger om eksemplets navn og typesamt SuperMixi eksempeloplysninger. Vælg den grundlæggende aflevering til analyseoplysningerne. I WT-eksemplet skal du vælge WT for destinationsnavnet, Reference for Destinationstypeog både FAM og HEX for henholdsvis Signal Ch1 og Ch2. Udfyld det relevante navn til destinationsnavnetfor NHEJ-prøver , vælg Ukendt for måltypenog vælger FAM for Signal Ch1. Lad Signal Ch2 være på ingen. (B) Droplet count resultater for flere prøver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig03.jpg"> Figur 3: Analyse af drop-off-analyse. (A) Cluster 2D plot for dråben tæller af WT og NHEJ alleler. Under fanen 2D-amplitud er alle dråber som standard uklassificeret. I denne figur tildeles farver manuelt til at skelne. Den orange prikker klynge er WT allele tæller opnået ved binding af både FAM og HEX sonder på reference sekvens og mål site sekvens, henholdsvis. Blå prikker repræsenterer snesevis af dråber, der har FAM-binding til referencesekvensen, men ingen HEX-binding ved målstedssekvensen (dermed drop-off af HEX). Grå prikker er tomme dråber, der ikke har hverken FAM- eller HEX-binding. (B) Ratio / Abundance grafer af NHEJ begivenheder. Under fanen Ratio skal du vælge Fraktioneret overflod for en graf med korrespondentprocenten for NHEJ-hændelser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig04.jpg"> Figur 4: Anvendelse af drop-off assay med ddPCR for ikke-homolog end-sammenføjning identifikation og kvantificering i transgene Anopheles stephensi linje, AsMCRkh1. (A) Skematisk præsentation af ddPCR Drop-Off assay til at opdage mutationer på et målrettet DNA-sted med en dual-probe system. En amplicon på 150-400 bp forstærkes med de forreste og omvendte primere. En FAM-mærket sonde er designet til at binde sig til en bevaret sekvens af ampliconen, mens en HEX-mærket sonde er designet til at binde sig til WT gRNA-målrettet stedet. (B) Påvisning af forskellige typer indels med ddPCR. Femten puljer af 10 AsMCRkh1 myg hver indeholder forskellige typer af indel, herunder indsættelse, sletning og substitution, blev analyseret med ddPCR Drop-Off assay. Nærmere oplysninger om mutationer og sekvenser findes i tabel 2 og tabel S3 i Carballar et al. 9. (C) Kvantificering af NHEJ i blandede prøver af AsMCRkh1 og WT myg med forskellige nøgletal (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 og 0:10) ved hjælp af ddPCR og en sammenlignet teknik indel detection af amplicon Analysis9. Billeder tilpasset fra Carballar-Lejarazú et al. Biotechniques. 68( 4):172-179 (2020)9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer/Probe</td>
			<td>Sekvens (5' » 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR Forward Primer</td>
			<td>ATGATCAAATGTCGACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR Omvendt primer</td>
			<td>ACCGTACTGGTTGAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR HEX Probe (BHQ1)</td>
			<td>[HEX]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR FAM Probe (BHQ1)</td>
			<td>[6FAM]-CCACGTGGGATCGAAGG-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HEX: Hexachlor-fluorescein, FAM: 6-carboxyfluorescein, BHQ: Black Hole Quencher</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Sekvenser af primere og sonder.

Watch this Scientific Journal Video about Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations at JoVE.com

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Denne protokol indeholder trin fra DNA-ekstraktion til eksperimentel opsætning til digital dråbe PCR (ddPCR), herunder analyse til identifikation og kvantificering af ikke-homologe slut-sammenføjning (NHEJ) begivenheder på målsteder efter gRNA-induceret Cas9 kavalergang og DNA-reparation. Andre anvendelser af denne metode omfatter applikationer såsom polymorfi afsløring og gen-redigering variant verifikation.

Digital-Droplet PCR at opdage Indels mutationer i genetisk modificerede Anopheline Mosquito Populationer

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

Denne protokol giver en høj gennemløb og pålidelig makeup til NHEJ-analyse, der kan bestemme forekomsten og den relative mængde af Indel-mutationer i gen-redigerede mygpopulationer. Sammenlignet med den næste generation, eller Sanger sekventering, ddPCR har hurtigere ekspeditionstid for resultater, som giver mulighed for hurtig og komplet analyse af genetisk variation til felt for genetisk modificerede organismer. Denne metode bør generelt gælde for alle forsøgssystemer.Demonstrere proceduren vil være Thai Pham, en medarbejder forskning associeret fra Yang's lab. Til at begynde med skal du forberede 25 mikrolitere af den digitale dråbe PCR eller ddPCR-prøveblanding ved at tilføje ddPCR super mix, fremad og omvendte primere, HEX- eller FAM-sonder, DNA og vand i de proportioner, der er beskrevet i teksten. Bland derefter grundigt reaktionen ved at hvirvler.Ved hjælp af en 50 mikroliter multikanal pipette, indlæse 20 mikroliter af ddPCR prøve mix i den midterste række af patronen. Brug derefter en 200 mikroliter multikanal pipette til at indlæse 70 mikroliter af olien i nederste række uden at generere bobler i hele pipettering. Placer pakningen, rører kun kanterne, undgå midten, konkavede område, og derefter placere pladen sikkert i dråbegeneratoren, og lukke dækslet for at starte kørslen.For at overføre nedsænkning mix fra den øverste række af patronen i 96-brønd plade, skal du bruge en multikanal pipette, og drop 40 mikroliter af flydende prøve i tre til fem sekunder i en vinkel på 30 til 45 grader. Derefter udvise blandingen i brønden langsomt i over tre sekunder i en 45 graders vinkel, så den kan falde ned fra siden, og derefter gå til det andet stop af pipetten for at udvise væsken helt. Ved hjælp af folievarmetætninger forsegles pladerne i fem sekunder ved 180 grader celsius.Placer den forseglede plade i termocyklussen, og indstil PCR-betingelserne for NHEJ drop off retningslinjer ved at indstille indledende denaturering ved 95 grader celsius i 10 minutter. Derefter indstilles 40 cyklusser på 94 grader celsius i 30 sekunder til denatur, 55 grader celsius fra et minut til anneal og 60 grader celsius i to minutter for at udvide. Efter 40 cyklusser, sæt hold på 98 grader celsius i 10 minutter, og sidste hold på fire grader celsius.Brug en rampehastighed på to grader celsius i sekundet for alle trin. Udglødningstemperaturen vil variere, afhængigt af de anvendte sonder eller primer. Placer pladen sikkert i dråbelæseren med A1 mærket godt øverst til venstre.Åbn programmet og konfigurer pladen ved at udpege FAM som den kendte referencekanal og HEX som den ukendte for hver brønd. Rediger derefter navnet på hvert eksempel. Kør dropletaflæsningseksperimentet som direkte kvantificering, mens skabelonen gemmes.Udpege de korrekte eksperimentelle parametre for softwareanalyse, nemlig prøveoplysninger, super mix, målnavn, måltype, signalkanal 1 og kanal to. Angiv derefter tærsklen for dråbeantal over 10.000 for pålidelige resultater. Kontroller derefter dråbetallet for hver brønd i dråbefanen, hvilket sikrer, at alle er over 10.000.Endelig skal du kontrollere 1D-amplituden for effektiv signaladskillelse fra negativer. I pladeeditoren skal du markere hele pladen og indstille eksperimenttypen til at falde fra. Angiv WT-målet som en reference og udpege kanal et for FAM og kanal to for HEX.Sæt NHEJ mål som ukendt, udpege kanal et for FAM og kanal to som ingen. Angiv klyngetærsklerne med grafværktøjerne for hvert eksempel under fanen 2D-amplitud. Halen er normalt forbundet med WT-klyngen til NHEJ-analyser.Under fanen forhold skal du klikke på gearikonet øverst til højre i grafen og vælge den fraktionerede overflod for at plotte et punkt svarende til procentdelen af NHEJ-begivenheder. 15 forskellige udtrukne prøver af 10 myg hver indeholdt forskellige NHEJ alleler, blev analyseret og identificeret ved hjælp af drop off assay, og resultaterne viste, at alle 15 prøver transporteres 100% Indel alleler. I et andet eksperiment blev 11 udtrukne prøver af vilde myg og NHEJ myg med forskellige NHEJ-procenter undersøgt med denne ddPCR-protokol.Resultaterne viste, at den identificerede procentdel var forholdsvis tæt på Indel-påvisning ved ampliconanalyseteknik. Pipette langsomt for at undgå bobler, og lad alle emulgeret dråber til at dryppe ned væggen af brønde.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Fletning absolutte og relative kvantitativ PCR data at kvantificere STAT3 Splice Variant Afskrifter

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Overvågning Rumlig Segregation i Surface kolonisere mikrobielle populationer

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Single-celle genekspression Brug Multiplex RT-qPCR at Karakterisere Meget forskellige sjældne Lymfoide populationer

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Vild type Blokering af PCR Kombineret med direkte sekventering som en yderst følsom metode til påvisning af lavfrekvent somatiske mutationer

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Enkelt dråbe Digital Polymerase Chain Reaction for omfattende og samtidige påvisning af mutationer i Hotspot regioner

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identificering af mutationer ved høj opløsning smelter i en TILLING population af ris

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

Anvendelse af fryseoptøede embryoner til højeffektiv produktion af genetisk modificerede mus

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Levering af modificeret mRNA i en myokardieinfarkt musemodel

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Introduktion af punktmutationer i humane pluripotente stamceller ved hjælp af problemfri genomredigering

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...