Name: digital-droplet pcr to detect indels mutations in genetically modified anopheline mosquito populations
Uploaded: 2021-06-28T14:00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations at JoVE.com

Financiering werd verstrekt door de University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ is een Donald Bren Professor aan de Universiteit van Californië, Irvine.

1. DNA-extractie
<ol><li>Bereid EDTA/Nuclei Lysis Buffer (EDTA/NLS) voor met de verhouding van 500 μL NLS en 120 μL EDTA per monster. Opschalen voor meerdere samples. Koel het mengsel af op ijs. OPMERKING: De oplossing wordt troebel in 2-5 minuten wanneer deze wordt gekoeld, afhankelijk van het volume.</li>
	<li>Homogeniseer het muggenmonster met behulp van een mechanische homogenisator voor 10-15 s in een microcentrifugebuis van 1,5 ml gevuld met 600 μL gekoelde EDTA / NLS; Meng.</li>
	<li>Voeg 17,5 μL van 20 mg/ml proteïnase K toe aan de tube en meng grondig.</li>
	<li>Incubeer 's nachts bij 55 °C. U kunt het monster afwisselend gedurende 3 uur bij 55 °C incuberen en het monster om de 1 uur schudden en vortexen.</li>
	<li>Voeg 200 μL eiwitprecipitatieoplossing toe aan het monster bij kamertemperatuur en vortex krachtig gedurende 20 s.</li>
	<li>Koel het monster gedurende 5 minuten op ijs.</li>
	<li>Centrifugeer het monster tot pelleteiwitten bij 15.890 RCF gedurende 4 minuten.</li>
	<li>Zuig het supernatant dat het DNA bevat zorgvuldig op en breng het over naar een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml met 600 μL isopropanol.</li>
	<li>Meng de oplossing voorzichtig door de buis 5-10 keer om te keren. Centrifugeer gedurende 1 min bij 15.890 RCF. Decanteer het bovennatuurlijk middel voorzichtig met behoud van de DNA-pellet.</li>
	<li>Voeg 600 μL kamertemperatuur 70% ethanol toe. Was het gepelleteerde DNA door de buis voorzichtig om te keren.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 1 min bij 15.890 RCF. Verwijder het bovennatuurlijk voorzichtig door aspiratie met behulp van een glazen pipetpunt.</li>
	<li>Keer de buis om op schoon absorberend papier en droog de pellet gedurende 10-15 minuten aan de lucht.</li>
	<li>Resuspend het DNA met water van PCR-kwaliteit. Gebruik 20 μL per individueel muggenmonster of 100 μL voor 10 gepoolde muggen. OPMERKING: DNA-extractiemethoden voor muggenmonsters met behulp van een in de handel verkrijgbare kit (zie Tabel met materialen)zijn aangepast van het protocol voor het isoleren van genomisch DNA van weefselkweekcellen en dierlijk weefsel van de fabrikant.</li>
</ol>2. ddPCR-reacties en voorbereiding van druppelgeneratie
<ol><li>Kwantificeer DNA met behulp van een fluorometer. OPMERKING: Voor de drop-off-test wordt aanbevolen om een bereik van 3.000-30.000 haploïde genoomkopieën per reactie te gebruiken, die is ontworpen om NHEJ-gebeurtenissen te detecteren met een HEX-labelingsonde die bindt aan een WT-sequentie van de beoogde snijplaats en niet zal gloeien (drop-off) als er een deletie of insertie op de doellocatie is, wat wijst op de aanwezigheid van een NHEJ-variant.</li>
	<li>Bereken het kopienummer met behulp van het haploïde genoomgewicht en de concentratie van DNA in het extract. Dit wordt gedaan door de concentratie van het geëxtraheerde DNA te vermenigvuldigen met het volume dat wordt gebruikt om de totale DNA-massa te verkrijgen en deze vervolgens te delen door het haploïde genoomgewicht. Zorg ervoor dat het toegevoegde volume tussen 1-10 μL ligt. Verdun indien nodig om binnen het aanbevolen haploïde genoomkopiebereik te zijn. OPMERKING: Een Anopheles gambiae haploïde genoom wordt geschat op 0,27 pg per volwassen mug10.</li>
	<li>Ontwerp primers en sondes. Ontwerp voorwaartse en omgekeerde oligonucleotideprimers met een Primer Melting Temperature (Tm) in het bereik van 55-60 °C die de 5'- en 3'-uiteinden van de gRNA-doellocatie flankeren en een amplicon van 150-400 bp produceren.<ol>
<li>HEX (Hexachloor-fluoresceïne)-gelabelde sonde voor NHEJ-detectie: Ontwerp een oligonucleotide van ~ 15-20 bp in lengte complementair aan de doellocatie en voeg de HEX-sonde toe aan het 5'-uiteinde en BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) aan het 3'-uiteinde. De Tm van de hydrolysesonde moet 3-10 °C hoger zijn dan de Tm van de primers.</li>
		<li>FAM (6-carboxyfluoresceïne)-gelabelde sonde voor referentie WT: Ontwerp een oligonucleotide ~ 15-20 bp in lengte complementair aan een geconserveerde genoomlocatie ver weg (ongeveer 25 bp) van de doellocatie en voeg de FAM-sonde toe aan het 5'-uiteinde en BHQ1 aan het 3'-uiteinde. De Tm van de hydrolysesonde moet 3-10 °C hoger zijn dan de Tm van de primers.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PCR-reactievoorbereiding
<ol><li>Bereid 25 μL van de ddPCR Sample Mix met de volgende componenten: ddPCR supermix voor probes (geen UTP): 12,5 μL, voorwaartse en omgekeerde primers (10 μM): 1 μL elk, HEX/FAM-probes (10 μM): 0,625 μL elk, DNA: 1-5 μL (3.750-37.500 haploïde genoomkopieën) en water: tot 25 μL.</li>
	<li>Meng de reacties grondig door vortexing of reflux pipetteren (op en neer) (20x). OPMERKING: Als de reacties zich in een 96-well plaat bevinden, pipetteer dan het hele volume 20 keer op en neer in plaats van te vortexen om bubbelvorming te voorkomen.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters kort om het mengsel op de bodem van de buis of put te laten bezinken. OPMERKING: Zorg ervoor dat de reacties op kamertemperatuur zijn voor het genereren van druppels. Bereid 1x ddPCR-mix voor extra/ongebruikte putjes in elke patroon (elke patroon heeft 8 putjes).</li>
</ol>4. Druppelgeneratie
<ol><li>Gebruik een meerkanaalspiffpet van 50 μL om 20 μL van de ddPCR-monstermix in de middelste rij van de patroon te plaatsen(figuur 1A,boven).</li>
	<li>Laad 70 μL van de olie in de onderste rij. Laad 20 μL 1x ddPCR supermix in ongebruikte putten. OPMERKING: Introduceer geen bubbels.</li>
	<li>Plaats de pakking en raak alleen de randen aan en vermijd het middelste geconcavedeerde gebied(figuur 1B).</li>
	<li>Plaats de plaat stevig in de druppelgenerator en sluit het deksel om de run te starten.</li>
	<li>Breng met behulp van de meerkanaalspipet 40 μL van het emersionmengsel over van de bovenste rij van de patroon(figuur 1A,onderkant) naar de 96-putplaat.<ol>
<li>Trek vloeibaar monster voor 3-5 s in een hoek van 45-30°. Verwijder het mengsel langzaam gedurende meer dan 3 s in een hoek van 45° in de zijkant van de put, zodat het langs de zijkant kan druppelen. Het is goed om naar de tweede stop (volledige uitdrijving) van de pipet te gaan om alle vloeistof te verdrijven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik folie heat seals, sluit de platen af voor 5 s bij 180 °C.</li>
</ol>5. Pcr
<ol><li>Plaats de verzegelde plaat in de thermocycler(figuur 1C)en stel de aanbevolen PCR-voorwaarden in als u de NHEJ Drop-Off-richtlijnen als volgt volgt:<ol>
<li>Initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 10 min.</li>
		<li>Stel 40 cycli in van 94 °C voor 30 s tot denaturatie, 55 °C gedurende 1 minuut tot gloeien en 60 °C gedurende 2 minuten om uit te breiden.</li>
		<li>Houd dit 10 minuten vast bij 98 °C.</li>
		<li>Houd bij 4 °C. OPMERKING: De gloeitemperatuur voor specifieke primers en sondesets kan worden geoptimaliseerd met behulp van een thermische gradiënt. Gebruik een hellingsnelheid van 2 °C/s voor alle stappen. Pcr-omstandigheden moeten worden aangepast afhankelijk van elk experimenteel ontwerp en elke opstelling.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Druppel aflezen
<ol><li>Plaats de plaat stevig in de druppellezer met goed A-1 linksboven (afgevlakte hoek, de andere drie zijn omrand) (Figuur 1D).</li>
	<li>Stel de plaat in het programma in: FAM aanwijzen als het bekende referentiekanaal en HEX als het onbekende(figuur 2A).</li>
	<li>Voer het druppelleesexperiment uit als directe kwantificering. Nadat de uitvoering is voltooid, wijzigt u het experimenttype in Drop-Off (DOF) voor de analyse(Afbeelding 2A).</li>
</ol>7. Analyse
<ol><li>Wijs de juiste experimentele parameters aan(Figuur 2A): Sample Information, SuperMix, Target Name (WT of NHEJ), Target Type (Ref of Unknown), Signal Ch1 (HEX of FAM), Signal Ch2 (HEX of FAM) en stel handmatig de drempel in voor het aantal druppels (beveel boven 10.000 aan voor betrouwbare resultaten). De software voert het grootste deel van de analyse uit met de aangewezen parameter.</li>
	<li>Controleer het aantal druppels op het tabblad Druppel; ervoor zorgen dat ze allemaal boven de 10.000 zijn(figuur 2B).</li>
	<li>Controleer de amplitude van 1 D voor een efficiënte signaalscheiding van negatieven.</li>
	<li>Markeer in de plaateditorde hele plaat en stel het experimenttype in op Afzetten.</li>
	<li>Stel het WT-doel in als referentie enwijs kanaal één aan voor FAM en kanaal twee voor HEX.</li>
	<li>Stel het NHEJ-doel in als onbekend en wijs kanaal één aan voor FAM en kanaal twee als geen.</li>
	<li>Stel op het tabblad 2D-amplitude de clusterdrempels in met de grafiekgereedschappen voor elk monster. Denk aan de staart geassocieerd met de WT-cluster; dit is normaal voor NHEJ-testen(figuur 3A). OPMERKING: Klik op het tabblad Verhouding op het tandwielpictogram in de rechterbovenhoek van de grafiek. Selecteer de fractionele overvloed. De grafiek zal nu een punt uitzetten dat overeenkomt met het percentage NHEJ-gebeurtenissen (figuur 3B).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li><li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae.">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).</li><li>Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Bo&#235;te, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agricultural+pest+control+with+CRISPR-based+gene+drive:+time+for+public+debate:+Should+we+use+gene+drive+for+pest+control.">Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control.</a> EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11, 5553 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+and+direct+Sanger+sequencing+for+the+detection+of+the+BRAFV600E+mutation+in+papillary+thyroid+carcinoma.">Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902 (2019).</li><li>Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+droplet+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+characterizing+DNA+reference+material+for+KRAS+mutation+detection.">Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9650 (2018).</li><li>Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+strategy+for+detecting+CRISPR_Cas9+induced+mutations+using+next-generation+sequencing.">A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 15 (1), 1002 (2014).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+droplet+PCR+and+IDAA+for+the+detection+of+CRISPR+indel+edits+in+the+malaria+species+Anopheles+stephensi.">Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi.</a> Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).</li><li>Holt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298 (5591), 129-149 (2002).</li></ol>

De auteurs hebben geen onthullingen.

Digital-droplet PCR is een efficiënte methode om de aanwezigheid van indel allelen als gevolg van NHEJ-gebeurtenissen in een op Cas/gRNA gebaseerd gene-drive systeem te bepalen en maakt het mogelijk om de frequentie van deze allelen in individuen of populaties te kwantificeren. Sommige stappen van het protocol moeten met speciale zorg worden gevolgd om betrouwbare resultaten te bereiken. Ten eerste moet de genomische DNA-extractie zorgvuldig worden uitgevoerd om een hoge kwaliteit en voldoende kwantiteit te garanderen. Een goede extractie maakt een nauwkeurige bepaling van de haploïde genoomkopieën per reactie mogelijk. Onze ervaring was dat een in de handel verkrijgbare kit (zie Tabel met materialen)consistent hoogwaardige DNA-extracties leverde. Extracties van individuele muggen kunnen echter bijzonder uitdagend blijken te zijn, omdat de DNA-pellet moeilijk te visualiseren wordt en gemakkelijk kan worden opgezogen met het supernatant als het niet voorzichtig is. Ten tweede moeten primers en sondes zorgvuldig worden ontworpen. Voordat u het ddPCR-experiment voltooit, moet u ervoor zorgen dat de ontworpen primers resulteren in een enkel PCR-product door eerst een traditionele PCR uit te voeren en een enkel product te visualiseren via gel-elektroforese. De referentie FAM-sonde moet ook zo zijn ontworpen dat deze complementair is aan een sterk geconserveerde sequentie. Dit zorgt voor nauwkeurige detecties van WT-allelen in een diverse populatie. De primer/probe combinaties voor elk uniek experiment zullen verschillende thermocycler condities hebben, en het wordt aanbevolen om die omstandigheden te optimaliseren met behulp van een thermische gradiënt.
Er bestaan andere methoden voor het identificeren van indels, zoals Sanger-sequencing of NGS. Sanger-sequencing is beperkt omdat het een ondergrens van detectie en een laag detectievermogen heeft om nieuwe varianten te identificeren. Sanger sequencing is ook arbeidsintensief en is geen high-throughput. In vergelijking met Sanger-sequencing heeft NGS niet dezelfde beperkingen van lage gevoeligheid, detectievermogen en doorvoer. Een ander voordeel van NGS is het vermogen om een verscheidenheid aan mutaties te detecteren, van single nucleotide polymorphism (SNP's) tot herschikkingen. NGS is echter een duurdere en tijdrovendere methode bij de toepassing van het bepalen van Cas9 / gRNA-geassocieerde indels omdat er slechts één doelgebied van belang is en het het meest geschikt is voor grotere genoombrede analyses. In vergelijking met de bovengenoemde methoden is ddPCR een hoge doorvoer en heeft het een snelle doorlooptijd. Als de ddPCR-materialen en -instrumenten in eigen huis beschikbaar zijn, kunnen 96 monsters binnen 1-2 dagen worden verwerkt, waardoor het zeer geschikt is voor snelle analyse van grote proeven met Cas9 / gRNA-gemodificeerde organismen.
Hoewel er veel voordelen zijn voor ddPCR, zijn er ook beperkingen. Ten eerste is de ddPCR-apparatuur niet vaak beschikbaar in een onafhankelijke laboratoriumomgeving. ddPCR-apparatuur kan gemeenschappelijk beschikbaar zijn bij grotere onderzoeksinstellingen, maar dit maakt het niet mogelijk om gegevens te genereren en te analyseren buiten de instelling. Ten tweede biedt ddPCR, in tegenstelling tot de alternatieven, niet de individuele unieke sequenties van geïdentificeerde indelmutaties. Digitale druppel PCR zal de frequentie van indelmutaties binnen een populatie leveren, maar zonder de sequentie kan men niet bepalen of de aanwezige indels meer kans hebben om de functie van het betreffende gen te behouden of te remmen. De ddPCR-methode is misschien het meest geschikt om wilde populaties te analyseren na een veldafgifteproef van een op Cas9 / gRNA gebaseerd aandrijforganisme omdat het efficiënt de frequentie van introductie van het transgen in de inheemse populatie en de generatie van dedels binnen de populatie in bijna realtime kan bepalen. Vanwege de snelle doorlooptijd van ddPCR zou het mogelijk zijn om wekelijks monsters te nemen en de populatie in een veldproefregio te analyseren als materialen lokaal beschikbaar waren. De opstartkosten voor de aanschaf, import en installatie van de ddPCR-apparatuur zouden hoog zijn in afgelegen laboratoria, maar de voordelen van het rigoureus kunnen beoordelen van een wilde populatie terwijl deze wordt aangepast door een aandrijfsysteem, zouden de kosten rechtvaardigen.

Gene drives hebben een enorm potentieel om insectenpopulaties van medische en agrarische relevantie te beheersen1,2,3,4,5. Genaandrijvingssystemen op basis van CRISPR Cas-nucleasen en gids-RNA's (gRNA's) kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om vectormuggenpopulaties te wijzigen door eigenschappen te introduceren die refractie verlenen aan malariaparasieten, wat leidt tot verminderde overdracht en minder ziekte1,4,5. Het gene-drive systeem kopieert zichzelf en de bijbehorende eigenschap van het ene homologe chromosoom naar het andere in de pre-meiotische geslachtscellen, en dit zorgt ervoor dat de meerderheid van de nakomelingen de drive erft en het potentieel creëert voor langdurige en duurzame populatiemodificatie in het veld. Een nadeel van de cas/gRNA-gebaseerde methoden is echter de mogelijkheid om insertie- en deletie (indel) mutaties te genereren door middel van niet-homologe end-joining (NHEJ) DNA-reparatie, wat resulteert in het genereren van drive-resistente allelen, die wanneer ze zich ophopen tot een voldoende hoge frequentie in de populatie, kunnen voorkomen dat het aandrijfsysteem zichverspreidt 1,2,3,4 . Dit protocol beschrijft een high-throughput en betrouwbare methode die de prevalentie en relatieve hoeveelheid indel mutaties kan bepalen, zowel op populatie- als op individueel niveau, tijdens cas / gRNA-gebaseerde gene drive.
Next-generation sequencing (NGS)-methoden bieden een ongeëvenaarde sequencingresolutie. De kosten en technische vereisten in verband met NGS verbieden echter routinetests en beperken het gebruik ervan als een methode met hoge doorvoer om indels6,7,8te beoordelen. Traditionele PCR-kwantificeringsmethoden worden al lang gebruikt als de standaardevaluatieprocedure voor genoomindels; deze methoden zijn echter arbeidsintensief, duren lang om gegevens te verkrijgen en hebben een hoge mate van variabiliteit. Het is bewezen dat Digital-Droplet PCR (ddPCR) gevoeliger is voor het detecteren van mutaties dan Sanger-sequencing in sommige toepassingen en heeft een lagere detectielimiet dan NGS in andere6,7,8,9. Bovendien zijn de kosten voor het beoordelen van een steekproefset en de doorlooptijd voor het verkrijgen van resultaten respectievelijk goedkoper en sneller voor ddPCR dan Sanger-sequencing of NGS9. Met behulp van een dual-probe-systeem identificeert de Drop-Off-test NHEJ-allelen op basis van de afwezigheid van wild-type (WT) -sequentie op de gRNA-gerichte doel Cas9-cut-site. In deze test wordt een korte amplicon inclusief de voorspelde snijplaats van het Cas/gRNA-gebaseerde systeem versterkt met een specifiek primerpaar. Eén fluorescerende sonde is ontworpen om te binden aan een geconserveerd gebied van het amplicon en een andere fluorescerende sonde herkent de WT-sequentie van de snijplaats. In aanwezigheid van een NHEJ-allel zal dit laatste niet binden aan het amplicon.
Het gebruik van ddPCR biedt de mogelijkheid om primers te ontwerpen om deleties, verschillen in enkele basenparen en inserties te targeten, waardoor NHEJ-profilering in muggenpopulatieanalyses mogelijk wordt9. Gezien deze aantrekkelijke eigenschappen hebben we een protocol voor ddPCR gemaakt voor high-throughput detectie van indels gegenereerd uit een op Cas /gRNA gebaseerd gene-drive systeem in muggen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR-grade Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any certified PCR-grade water can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K 20 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward and Reverse oligonucleotide primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital-droplet pcr to detect indels mutations in genetically modified anopheline mosquito populations

Recente ontwikkelingen in muggengennomica en genetische manipulatietechnologieën hebben de behoefte aan snelle en efficiënte methoden voor het detecteren van gerichte DNA-sequentievariatie op grote schaal bevorderd. Met name het detecteren van inserties en deleties (indels) op gen-bewerkte plaatsen gegenereerd door CRISPR-gids RNA (gRNA) / Cas9-gemedieerde niet-homologe eindverbinding (NHEJ) is belangrijk voor het beoordelen van de betrouwbaarheid van de mutagenese en de frequentie van onbedoelde veranderingen. We beschrijven hier een protocol voor digital-droplet PCR (ddPCR) dat zeer geschikt is voor nhej-analyse met hoge doorvoer. Hoewel deze methode geen gegevens produceert die individuele sequentievariatie identificeren, biedt het een kwantitatieve schatting van de sequentievariatie binnen een populatie. Bovendien kan dit protocol met de juiste middelen gemakkelijker worden geïmplementeerd in een laboratoriumomgeving op veldlocatie dan de volgende generatie of Sanger-sequencing. ddPCR heeft ook een snellere doorlooptijd voor resultaten dan een van deze methoden, wat een snellere en volledigere analyse van genetische variatie in wilde populaties mogelijk maakt tijdens veldproeven met genetisch gemanipuleerde organismen.

Een toepassing van deze procedure komt voor in Carballar-Lejarazú et al.9. De ddPCR Drop-off assay maakt gebruik van twee fluorescerende sondes om WT- en indelsequenties te onderscheiden: een FAM-sonde bindt aan een geconserveerde sequentie in het amplicon, terwijl de HEX-sonde zich richt op de WT-sequentie van de beoogde site(Figuur 4A). In aanwezigheid van een indel zal de HEX-sonde niet binden. Representatieve resultaten zijn te vinden in figuur 2,tabel 1 en tabel 2 van Carballar-Lejarazú et al.9. Met behulp van dit protocol is bewezen dat ddPCR een breed scala aan CRISPR-Cas9-geïnduceerde NHEJ-gebeurtenissen detecteert en de NHEJ-frequentie in een individueel of gepoold monster kwantificeert. Vijftien verschillende gepoolde monsters van 10 muggen bevatten elk verschillende NHEJ-allelen (tabel 2 van Carballar-Lejarazú et al.9). Deze werden geanalyseerd met ddPCR met behulp van het protocol en de parameters die hier worden gepresenteerd. Uit de resultaten van tabel1 9 blijkt dat alle 15 monsters 100% indel-allelen bevatten zoals geïdentificeerd door de Drop-off-test (figuur 4B). In een ander experiment werden 11 gepoolde monsters van WT-muggen en NHEJ-muggen met verschillende NHEJ-percentages (0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% en 100%) onderzocht met dit ddPCR-protocol en de resultaten (Figuur 2; Carballar- Lejarazú et al.9) toonden aan dat het geïdentificeerde percentage dicht bij de vergeleken techniek van indeldetectie door Amplicon-analyse ligt(figuur 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig01.jpg"> Figuur 1: Experimentele opzet en procedure. (A) Cartridge voorbereiding voor druppelgeneratie. (Naar boven) Monsters worden gevuld in de middelste rij van de patroon, terwijl olie wordt gevuld in de onderste rij. (Onder) Bovenste rij gevuld met geëmulgeerde druppels na druppelgeneratie. (B) Druppelgenerator met een patroon gevuld met monster en bedekt met een pakking op zijn plaats. (C) 96-well plaat bedekt met folieafdichting in een Thermo-Cycler. (D) Druppellezer met 96-goed-plaat op zijn plaats met een metalen deksel over de plaat om deze vast te zetten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig02.jpg"> Figuur 2: Druppel aflezen. (A) Software-interface voor druppeluitlezing. Oranje dozen tonen putten met monsters. Grijze dozen zijn lege putten. Experimentele parameters worden ingesteld in het deelvenster Gereedschappen bewerken (rechterkant). Elk monster kan worden bewerkt door op het betreffende voorbeeldvak te klikken. Selecteer Drop Off (DOF) voor Experimenteel type. Vul in de voorbeeldinformatie de juiste informatie in voor de naam en het typevan het monster en supermix. Kies de basic drop-off voor de testinformatie. Kies voor het WT-voorbeeld WT voor respectievelijk de doelnaam,Ref voor doeltypeen zowel FAM als HEX voor signaal Ch1 en Ch2. Voor NHEJ-monsters vult u de juiste naam in voor de doelnaam,kiest u Onbekend voor het doeltypeen kiest u FAM voor signaal Ch1. Laat signaal Ch2 op Geen staan. (B) Druppeltelling resultaten voor meerdere monsters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig03.jpg"> Figuur 3: Drop-Off assay analyse. (A) Cluster 2D plot voor het druppeltelling van de WT- en NHEJ-allelen. Op het tabblad 2D-amplitude worden alle druppels standaard niet geclassificeerd. In deze afbeelding worden kleuren handmatig toegewezen om te onderscheiden. De oranje stippencluster zijn WT-alleltellingen verkregen door binding van zowel FAM- als HEX-sondes op respectievelijk de referentiesequentie en doelplaatssequentie. Blauwe stippen vertegenwoordigen scores van druppels die FAM-binding hebben aan de referentiesequentie, maar geen HEX-binding op de doelplaatssequentie (vandaar drop-off van HEX). Grijze stippen zijn lege druppels die geen FAM- of HEX-binding hebben. (B) Verhouding/Abundantie grafieken van NHEJ gebeurtenissen. Selecteer op het tabblad Ratio de optie Fractionele Abundantie voor een grafiek met het corresponderende percentage NHEJ-gebeurtenissen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig04.jpg"> Figuur 4: Toepassing van drop-off assay met ddPCR voor niet-homologe end-joining identificatie en kwantificering in de transgene Anopheles stephensi lijn, AsMCRkh1. (A) Schematische presentatie van de ddPCR Drop-Off assay om mutaties te detecteren op een gerichte DNA-site met een dual-probe systeem. Een amplicon van 150-400 bp wordt versterkt met de voorwaartse en achterwaartse primers. Een FAM-gelabelde sonde is ontworpen om te binden aan een geconserveerde sequentie van het amplicon, terwijl een HEX-gelabelde sonde is ontworpen om te binden aan de WT-gRNA-gerichte site. (B) Detectie van verschillende soorten indels met ddPCR. Vijftien zwembaden van 10 AsMCRkh1-muggen die elk verschillende soorten indel bevatten, waaronder insertie, deletie en substitutie, werden geanalyseerd met de ddPCR Drop-Off-test. Details van mutaties en sequenties zijn te vinden in tabel 2 en tabel S3 van Carballar et al. 9. (C) Kwantificering van NHEJ in gemengde monsters van AsMCRkh1- en WT-muggen met verschillende verhoudingen (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 en 0:10) met behulp van ddPCR en een vergeleken techniek van indeldetectie door ampliconanalyse9. Afbeeldingen overgenomen van Carballar-Lejarazú et al. Biotechniques. 68(4):172-179 (2020)9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer/Sonde</td>
			<td>Volgorde (5' » 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR Voorwaartse Primer</td>
			<td>ATGATCAAATGTCGACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR Omgekeerde Primer</td>
			<td>ACCGTACTGGTTGAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR HEX Sonde (BHQ1)</td>
			<td>[HEX]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR FAM Sonde (BHQ1)</td>
			<td>[6FAM]-CCACGTGGGATCGAAGG-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HEX: Hexachloor-fluoresceïne, FAM: 6-carboxyfluoresceïne, BHQ: Black Hole Quencher</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Sequenties van primers en probes.

Watch this Scientific Journal Video about Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations at JoVE.com

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Dit protocol biedt de stappen van DNA-extractie tot experimentele opstelling voor digitale druppel PCR (ddPCR), inclusief analyse voor de identificatie en kwantificering van niet-homologe end-joining (NHEJ) gebeurtenissen op doellocaties na gRNA-geïnduceerde Cas9-splitsing en DNA-reparatie. Andere toepassingen van deze methode zijn toepassingen zoals polymorfismedetectie en genbewerkingsvariantverificatie.

Digital-Droplet PCR om indels mutaties in genetisch gemodificeerde anopheline muggenpopulaties te detecteren

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

Dit protocol biedt een hoge doorvoer en betrouwbare samenstelling voor NHEJ-analyse die de prevalentie en relatieve hoeveelheid indelmutaties in gen-bewerkte muggenpopulaties kan bepalen. In vergelijking met de volgende generatie, of Sanger-sequencing, heeft ddPCR een snellere doorlooptijd voor resultaten, waardoor een snelle en volledige analyse van genetische variatie naar veld voor genetisch gemodificeerde organismen mogelijk is. Deze methode moet algemeen toepasbaar zijn op alle experimentele systemen.De procedure wordt gedemonstreerd door Thai Pham, een stafonderzoeksmedewerker van het yang-lab. Bereid om te beginnen 25 microliter van de digitale druppel PCR of ddPCR-monstermix door ddPCR-supermix, voorwaartse en omgekeerde primers, HEX- of FAM-sondes, DNA en water toe te voegen in de verhoudingen die in de tekst worden beschreven. Meng vervolgens de reactie grondig door vortexing.Gebruik een meerkanaalspifflp van 50 microliter om 20 microliter van het ddPCR-monstermengsel in de middelste rij van de patroon te plaatsen. Gebruik vervolgens een meerkanaalspion van 200 microliter om 70 microliter van de olie in de onderste rij te laden zonder bubbels te genereren tijdens het pipetteren. Plaats de pakking, raak alleen de randen aan, vermijd het midden, het geconcavedeerde gebied en plaats de plaat vervolgens stevig in de druppelgenerator en sluit het deksel om de run te starten.Om het onderdompelingsmengsel van de bovenste rij van de patroon over te brengen naar de 96-putplaat, gebruikt u een meerkanaalspipet en laat u 40 microliter vloeistofmonster gedurende drie tot vijf seconden onder een hoek van 30 tot 45 graden vallen. Laat het mengsel vervolgens gedurende meer dan drie seconden langzaam in de put vallen in een hoek van 45 graden, zodat het vanaf de zijkant naar beneden kan vallen, en ga dan naar de tweede stop van de pipet om de vloeistof volledig te verdrijven. Gebruik folie heat seals, sluit de platen gedurende vijf seconden af op 180 graden Celsius.Plaats de verzegelde plaat in de thermocycler en stel de PCR-voorwaarden voor NHEJ-afgifterichtlijnen in door de initiële denaturatie gedurende 10 minuten op 95 graden Celsius in te stellen. Stel vervolgens 40 cycli van 94 graden celsius gedurende 30 seconden in om te denatureren, 55 graden celsius van één minuut om te gloeien en 60 graden celsius gedurende twee minuten om uit te breiden. Na 40 cycli zet je de hold op 98 graden celsius gedurende 10 minuten en de laatste hold op vier graden celsius.Gebruik een hellingssnelheid van twee graden celsius per seconde voor alle stappen. De gloeitemperatuur zal variëren, afhankelijk van de gebruikte sondes of primer. Plaats de plaat stevig in de druppellezer met de A1 goed gelabeld linksboven.Open het programma en stel de plaat in door FAM aan te wijzen als het bekende referentiekanaal en HEX als het onbekende kanaal voor elke put. Wijzig vervolgens de naam voor elk voorbeeld. Voer het druppelleesexperiment uit als directe kwantificering terwijl u de sjabloon opslaat.Wijs de juiste experimentele parameters aan voor software-analyse, namelijk voorbeeldinformatie, supermix, doelnaam, doeltype, signaalkanaal één en kanaal twee. Stel vervolgens de drempel voor het aantal druppels in boven 10.000 voor betrouwbare resultaten. Controleer vervolgens het aantal druppels voor elke put in het druppeltabblad en zorg ervoor dat ze allemaal boven de 10.000 zijn.Controleer ten slotte de 1D-amplitude voor een efficiënte signaalscheiding van negatieven. Markeer in de plaateditor de hele plaat en stel het experimenttype in op drop-off. Stel het WT-doel in als referentie en geef kanaal één aan voor FAM en kanaal twee voor HEX.Stel het NHEJ-doel in als onbekend en wijs kanaal één aan voor FAM en kanaal twee als geen. Stel op het tabblad 2D-amplitude de clusterdrempels in met de grafiekgereedschappen voor elk monster. De staart wordt normaal gesproken geassocieerd met het WT-cluster voor NHEJ-assays.Klik onder het tabblad Verhouding op het tandwielpictogram in de rechterbovenhoek van de grafiek en selecteer de fractionele abundantie om een punt uit te zetten dat overeenkomt met het percentage NHEJ-gebeurtenissen. 15 verschillende getrokken monsters van 10 muggen bevatten elk verschillende NHEJ-allelen, werden geanalyseerd en geïdentificeerd met behulp van de drop-off-test en de resultaten toonden aan dat alle 15 monsters 100% Indel-allelen droegen. In een ander experiment werden 11 getrokken monsters van wilde muggen en NHEJ-muggen met verschillende NHEJ-percentages onderzocht met dit ddPCR-protocol.De resultaten toonden aan dat het geïdentificeerde percentage relatief dicht bij de indeldetectie door ampliconanalysetechniek lag. Pipetteer langzaam om bubbels te voorkomen en laat alle geëmulgeerde druppels langs de wand van de putten druppelen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Het samenvoegen van absolute en relatieve kwantitatieve PCR gegevens te kwantificeren STAT3 Splice Variant Afschriften

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Monitoring ruimtelijke segregatie in Surface Kolonisatie microbiële populaties

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Eencellige genexpressie met behulp van Multiplex RT-qPCR heterogeniteit van Rare lymfoïde populaties karakteriseren

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Wild-blokkering van PCR In combinatie met Direct Sequencing als een zeer gevoelige detectiemethode voor Low-Frequency somatische mutaties

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identificeren van mutaties door een hoge resolutie smelting in een TILLING populatie van rijst

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Levering van gemodificeerd mRNA in een myocardikoesmodel

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...