Name: digital-droplet pcr to detect indels mutations in genetically modified anopheline mosquito populations
Uploaded: 2021-06-28T14:00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations at JoVE.com

Il finanziamento è stato fornito dalla University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ è donald bren professor presso l'Università della California, Irvine.

1. Estrazione del DNA
<ol><li>Preparare edTA/nuclei Lysis Buffer (EDTA/NLS) con il rapporto di 500 μL di NLS e 120 μL di EDTA per campione. Scalabilità verticale per più campioni. Raffreddare il composto sul ghiaccio. NOTA: la soluzione diventerà torbida in 2-5 minuti quando raffreddata a seconda del volume.</li>
	<li>Omogeneizzare il campione di zanzara utilizzando un omogeneizzatore meccanico per 10-15 s in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL riempito con 600 μL di EDTA/NLS refrigerato; mescolare accuratamente.</li>
	<li>Aggiungere 17,5 μL di 20 mg/mL di proteinasi K al tubo e mescolare accuratamente.</li>
	<li>Incubare durante la notte a 55 °C. In alternativa, incubare il campione a 55 °C per 3 ore scuotendo e ruotando il campione ogni 1 ora.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di soluzione di precipitazione proteica al campione a temperatura ambiente e vortice vigorosamente per 20 s.</li>
	<li>Raffreddare il campione per 5 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Centrifugare il campione in proteine pellet a 15.890 RCF per 4 min.</li>
	<li>Aspirare accuratamente il surnatante che contiene il DNA e trasferirlo in un tubo microcentrifuga pulito da 1,5 mL contenente 600 μL di isopropanolo.</li>
	<li>Mescolare delicatamente la soluzione invertendo il tubo 5-10 volte. Centrifuga per 1 min a 15.890 RCF. Decantare accuratamente il surnatante preservando il pellet di DNA.</li>
	<li>Aggiungere 600 μL di etanolo al 70% a temperatura ambiente. Lavare il DNA pellettato invertendo delicatamente il tubo.</li>
	<li>Centrifuga per 1 min a 15.890 RCF. Rimuovere con attenzione il surnatante aspirando utilizzando una punta di pipetta di vetro.</li>
	<li>Capovolgere il tubo su carta assorbente pulita e asciugare all'aria il pellet per 10-15 minuti.</li>
	<li>Risospesci il DNA con acqua di grado PCR. Utilizzare 20 μL per singolo campione di zanzara o 100 μL per 10 zanzare in pool. NOTA: i metodi di estrazione del DNA per i campioni di zanzara utilizzando un kit disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali)sono adattati dal protocollo Isolating Genomic DNA from Tissue Culture Cells and Animal Tissue del produttore.</li>
</ol>2. Reazioni ddPCR e preparazione alla generazione di goccioline
<ol><li>Quantificare il DNA usando un fluorometro. NOTA: per il test drop-off, si consiglia di utilizzare un intervallo di 3.000-30.000 copie del genoma aploide per reazione, progettato per rilevare eventi NHEJ con una sonda di etichettatura HEX che si lega a una sequenza WT del sito di taglio mirato e non si ricottura (drop-off) se vi è una cancellazione o un inserimento nel sito di destinazione, indicando la presenza di una variante NHEJ.</li>
	<li>Calcola il numero di copie usando il peso del genoma aploide e la concentrazione di DNA nell'estratto. Questo viene fatto moltiplicando la concentrazione del DNA estratto per il volume utilizzato per ottenere la massa totale del DNA, quindi dividendolo per il peso del genoma aploide. Assicurarsi che il volume aggiunto sia compreso tra 1-10 μL. Diluire se necessario per essere nell'intervallo di copia del genoma aploide raccomandato. NOTA: Un genoma aploide di Anopheles gambiae è stimato in 0,27 pg per zanzara adulta10.</li>
	<li>Progettare primer e sonde. Progettare primer oligonucleotidici in avanti e inversi con una temperatura di fusione del primer (Tm) nell'intervallo 55-60 °C che fiancheggiano le estremità 5'- e 3' del sito bersaglio del gRNA producendo un amplicon di 150-400 bp.<ol>
<li>Sonda marcata HEX (Hexachloro-fluorescein) per il rilevamento di NHEJ: progettare un oligonucleotide di ~ 15-20 bp di lunghezza complementare al sito target e aggiungere la sonda HEX all'estremità 5'-end e BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) all'estremità 3'. Il Tm della sonda di idrolisi deve essere superiore di 3-10 °C rispetto al Tm dei primer.</li>
		<li>Sonda marcata con FAM (6-carbossifluoresceina) per riferimento WT: Progettare un oligonucleotide ~ 15-20 bp di lunghezza complementare a un sito del genoma conservato distante (circa 25 bp) dal sito target e aggiungere la sonda FAM all'estremità 5'-end e BHQ1 all'estremità 3'. Il Tm della sonda di idrolisi deve essere superiore di 3-10 °C rispetto al Tm dei primer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparazione della reazione PCR
<ol><li>Preparare 25 μL della miscela di campioni ddPCR con i seguenti componenti: supermix ddPCR per sonde (senza UTP): 12,5 μL, primer avanti e indietro (10 μM): 1 μL ciascuno, sonde HEX/FAM (10 μM): 0,625 μL ciascuna, DNA: 1-5 μL (3.750-37.500 copie del genoma aploide) e acqua: fino a 25 μL.</li>
	<li>Mescolare accuratamente le reazioni mediante vortice o pipettaggio di reflusso (su e giù) (20x). NOTA: se le reazioni sono in una piastra a 96 pozzetti, pipettare l'intero volume su e giù 20 volte piuttosto che vorticare per evitare la formazione di bolle.</li>
	<li>Centrifugare brevemente i campioni per depositare la miscela sul fondo del tubo o del pozzo. NOTA: Assicurarsi che le reazioni siano a temperatura ambiente per la generazione di goccioline. Preparare 1x di miscela ddPCR per pozzetti extra/inutilizzati in ogni cartuccia (ogni cartuccia ha 8 pozzetti).</li>
</ol>4. Generazione di goccioline
<ol><li>Utilizzando una pipetta multicanale da 50 μL, caricare 20 μL della miscela di campioni ddPCR nella riga centrale della cartuccia (Figura 1A, in alto).</li>
	<li>Caricare 70 μL di olio nella fila inferiore. Caricare 20 μL di 1x supermix ddPCR in pozzi inutilizzati. NOTA: non introdurre bolle.</li>
	<li>Posizionare la guarnizione toccando solo i bordi, evitando l'area concava centrale (Figura 1B).</li>
	<li>Posizionare saldamente la piastra nel generatore di gocce e chiudere il coperchio per avviare la corsa.</li>
	<li>Utilizzando la pipetta multicanale, trasferire 40 μL della miscela di emersione dalla fila superiore della cartuccia(Figura 1A,in basso) alla piastra a 96 pozzetti.<ol>
<li>Prelevare un campione liquido per 3-5 s con un angolo di 45-30 °. Espellere lentamente la miscela per oltre 3 s con un angolo di 45 ° nel lato del pozzo, permettendogli di gocciolare lungo il lato. Va bene andare alla seconda fermata (espulsione completa) della pipetta per espellere tutto il liquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando termosalde a foglio, sigillare le piastre per 5 s a 180 °C.</li>
</ol>5. PCR
<ol><li>Posizionare la piastra sigillata nel termociclatore (Figura 1C) e impostare le condizioni PCR raccomandate se si seguono le linee guida NHEJ Drop-Off come segue:<ol>
<li>Denaturazione iniziale a 95 °C per 10 min.</li>
		<li>Impostare 40 cicli di 94 °C per 30 s da denaturare, 55 °C per 1 min da ricottura e 60 °C per 2 minuti da estendere.</li>
		<li>Tenere a 98 °C per 10 min.</li>
		<li>Tenere a 4 °C. NOTA: la temperatura di ricottura per primer e set di sonde specifici può essere ottimizzata utilizzando un gradiente termico. Utilizzare una velocità di rampa di 2 °C/s per tutti i passaggi. Le condizioni della PCR devono essere regolate in base a ciascun progetto sperimentale e configurazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Lettura droplet
<ol><li>Posizionare saldamente la piastra nel lettore di gocce con un pozzetto A-1 in alto a sinistra (angolo levigato, gli altri tre sono bordati) (Figura 1D).</li>
	<li>Impostare la piastra nel programma: designazione di FAM come canale di riferimento noto e HEX come quello sconosciuto (Figura 2A).</li>
	<li>Eseguire l'esperimento di lettura Droplet come quantificazione diretta. Al termine dell'esecuzione, modificare il tipo di esperimento in Drop-Off (DOF) per l'analisi (Figura 2A).</li>
</ol>7. Analisi
<ol><li>Designare i parametri sperimentali corretti (Figura 2A): Sample Information, SuperMix, Target Name (WT o NHEJ), Target Type (Ref or Unknown), Signal Ch1 (HEX o FAM), Signal Ch2 (HEX o FAM) e impostare manualmente la soglia per il conteggio delle goccioline (consigliare oltre 10.000 per risultati affidabili). Il software eseguirà la maggior parte dell'analisi con il parametro designato.</li>
	<li>Controllare il conteggio dei droplet nella scheda Droplet; assicurarsi che tutti siano superiori a 10.000 (Figura 2B).</li>
	<li>Controllare l'ampiezza 1 D per una separazione efficiente del segnale dai negativi.</li>
	<li>Nell'Editor piastre, evidenziate l'intera piastra e impostate il tipo di esperimento su Drop off.</li>
	<li>Impostare la destinazione WT come riferimento,designando il canale uno per FAM e il canale due per HEX.</li>
	<li>Impostare la destinazione NHEJ come sconosciuta, designando il canale uno per FAM e il canale due come nessuno.</li>
	<li>Nella scheda Ampiezza 2D, impostare Soglie cluster con gli strumenti grafico per ogni campione. Si consideri la coda associata al cluster WT; questo è normale per i saggi NHEJ (Figura 3A). NOTA: nella scheda Rapporto, fai clic sull'icona a forma di ingranaggio in alto a destra del grafico. Selezionate l'abbondanza frazionaria. Il grafico traccerà ora un punto corrispondente alla percentuale di eventi NHEJ (Figura 3B).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li><li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae.">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).</li><li>Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Bo&#235;te, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agricultural+pest+control+with+CRISPR-based+gene+drive:+time+for+public+debate:+Should+we+use+gene+drive+for+pest+control.">Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control.</a> EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11, 5553 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+and+direct+Sanger+sequencing+for+the+detection+of+the+BRAFV600E+mutation+in+papillary+thyroid+carcinoma.">Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902 (2019).</li><li>Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+droplet+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+characterizing+DNA+reference+material+for+KRAS+mutation+detection.">Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9650 (2018).</li><li>Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+strategy+for+detecting+CRISPR_Cas9+induced+mutations+using+next-generation+sequencing.">A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 15 (1), 1002 (2014).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+droplet+PCR+and+IDAA+for+the+detection+of+CRISPR+indel+edits+in+the+malaria+species+Anopheles+stephensi.">Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi.</a> Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).</li><li>Holt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298 (5591), 129-149 (2002).</li></ol>

Gli autori non hanno divulgazioni.

La PCR a goccioline digitali è un metodo efficace per determinare la presenza di alleli indel derivanti da eventi NHEJ in un sistema di gene-drive basato su Cas/gRNA e consente la quantificazione della frequenza di questi alleli in individui o popolazioni. Alcuni passaggi del protocollo devono essere seguiti con particolare attenzione per ottenere risultati affidabili. In primo luogo, l'estrazione del DNA genomico deve essere eseguita con attenzione per garantire un'alta qualità e una quantità sufficiente. Una buona estrazione consentirà una determinazione accurata delle copie del genoma aploide per reazione. Nella nostra esperienza, un kit disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali)ha fornito estrazioni di DNA costantemente di alta qualità. Tuttavia, le estrazioni di singole zanzare possono rivelarsi particolarmente impegnative in quanto il pellet di DNA diventa difficile da visualizzare e può essere facilmente risucchiato con il surnatante se non attenzione. In secondo luogo, primer e sonde devono essere progettati con attenzione. Prima di completare l'esperimento ddPCR, assicurarsi che i primer progettati si traducano in un singolo prodotto PCR eseguendo prima una PCR tradizionale e visualizzando un singolo prodotto tramite elettroforesi su gel. Anche la sonda FAM di riferimento deve essere progettata in modo da essere complementare a una sequenza altamente conservata. Ciò garantirà rilevamenti accurati degli alleli WT in una popolazione diversificata. Le combinazioni primer/sonda per ogni esperimento unico avranno condizioni di termociclatore diverse e si consiglia di ottimizzare tali condizioni utilizzando un gradiente termico.
Esistono altri metodi per identificare gli indel, come il sequenziamento Sanger o NGS. Il sequenziamento con metodo Sanger è limitato perché ha un limite inferiore di rilevamento e un basso potere di scoperta per identificare nuove varianti. Anche il sequenziamento con metodo Sanger richiede un uso intensivo del lavoro e non è ad alta produttività. Rispetto al sequenziamento Sanger, NGS non ha le stesse limitazioni di bassa sensibilità, potenza di scoperta e throughput. Un altro vantaggio di NGS è la sua capacità di rilevare una varietà di mutazioni dal polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) ai riarrangiamenti. Tuttavia, NGS è un metodo più costoso e dispendioso in termini di tempo nell'applicazione della determinazione degli indel associati a Cas9 / gRNA perché esiste solo una regione target di interesse ed è più adatto per analisi più ampie a livello di genoma. Rispetto ai metodi di cui sopra, ddPCR è ad alto throughput e ha un tempo di risposta rapido. Se i materiali e gli strumenti ddPCR sono disponibili internamente, 96 campioni possono essere elaborati entro 1-2 giorni, rendendolo adatto per l'analisi rapida di grandi prove di organismi modificati Cas9 / gRNA.
Mentre esistono molti vantaggi per ddPCR ci sono anche limitazioni. In primo luogo, l'apparecchiatura ddPCR non è spesso disponibile in un ambiente di laboratorio indipendente. Le apparecchiature ddPCR possono essere disponibili in comune presso istituti di ricerca più grandi, ma ciò non consente una facile generazione e analisi dei dati al di fuori dell'istituzione. In secondo luogo, a differenza delle alternative, la ddPCR non fornisce le singole sequenze uniche di mutazioni indel identificate. La PCR a goccioline digitali fornirà la frequenza delle mutazioni indel all'interno di una popolazione, ma senza la sequenza, non si può determinare se gli indel presenti hanno maggiori probabilità di conservare o inibire la funzione del gene di interesse. Il metodo ddPCR è forse più adatto per analizzare le popolazioni selvatiche dopo una prova sul campo di rilascio di un organismo di guida basato su Cas9 / gRNA perché può determinare in modo efficiente la frequenza di introduzione del transgene nella popolazione nativa e la generazione di indels all'interno della popolazione quasi in tempo reale. A causa del rapido tempo di risposta ddPCR, sarebbe possibile eseguire il campionamento e analizzare la popolazione in una regione di prova sul campo settimanalmente se i materiali fossero disponibili localmente. I costi di avviamento per l'acquisto, l'importazione e l'installazione dell'apparecchiatura ddPCR sarebbero elevati nei laboratori remoti, ma i vantaggi di essere in grado di valutare rigorosamente una popolazione selvatica in quanto è in fase di modifica da un sistema di azionamento giustificherebbero i costi.

I gene drive hanno un immenso potenziale per controllare le popolazioni di insetti di rilevanza medica e agricola1,2,3,4,5. Ad esempio, i sistemi di gene-drive basati su nucleasi CRISPR Cas e RNA guida (gRNA) possono essere utilizzati per modificare le popolazioni di zanzare vettori introducendo tratti che conferiscono refrattarietà ai parassiti della malaria portando a una ridotta trasmissione e meno malattie1,4,5. Il sistema di gene-drive copia se stesso e il tratto associato da un cromosoma omologo a un altro nelle cellule germinali pre-meiotiche, e questo assicura che la maggior parte della prole erediti l'unità e crei il potenziale per una modifica duratura e sostenibile della popolazione sul campo. Tuttavia, uno svantaggio dei metodi basati su Cas/gRNA è la possibilità di generare mutazioni di inserzione e delezione (indel) attraverso la riparazione del DNA non omologo (NHEJ), con conseguente generazione di alleli resistenti all'unità, che se accumulati ad una frequenza abbastanza elevata nella popolazione, possono impedire al sistema di azionamento di diffondersi1,2,3,4 . Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo affidabile e ad alto rendimento in grado di determinare la prevalenza e la quantità relativa di mutazioni indel, sia a livello di popolazione che individuale, durante il gene drive basato su Cas / gRNA.
I metodi di sequenziamento di nuova generazione (NGS) forniscono una risoluzione di sequenziamento senza precedenti. Tuttavia, i costi e i requisiti tecnici associati all'NGS vietano i test di routine e ne limitano l'uso come metodo ad alto rendimento per valutare gli indels6,7,8. I metodi tradizionali di quantificazione pcr sono stati a lungo utilizzati come procedura di valutazione standard per gli indel del genoma; tuttavia, questi metodi sono laboriosi, richiedono molto tempo per procurarsi i dati e hanno un alto grado di variabilità. La Digital-Droplet PCR (ddPCR) ha dimostrato di essere più sensibile nel rilevare le mutazioni rispetto al sequenziamento Sanger in alcune applicazioni e ha un limite di rilevazione inferiore rispetto all'NGS in altre6,7,8,9. Inoltre, il costo per valutare un set di campioni e il tempo di risposta per ottenere risultati è meno costoso e più veloce, rispettivamente, per la ddPCR rispetto al sequenziamento Sanger o NGS9. Utilizzando un sistema a doppia sonda, il test Drop-Off identifica gli alleli NHEJ in base all'assenza di sequenza wild-type (WT) nel sito di taglio Cas9 bersaglio diretto al gRNA. In questo test, un breve amplicon che include il sito di taglio previsto del sistema basato su Cas / gRNA viene amplificato con una coppia di primer specifica. Una sonda fluorescente è progettata per legarsi a una regione conservata dell'amplicon e un'altra sonda fluorescente riconosce la sequenza WT del sito di taglio. In presenza di un allele NHEJ, quest'ultimo non si legherà all'amplicon.
L'uso di ddPCR fornisce la possibilità di progettare primer per delezioni mirate, differenze e inserzioni di singole coppie di basi, che consentiranno la profilazione NHEJ nelle analisi della popolazione di zanzare9. Date queste caratteristiche interessanti, abbiamo creato un protocollo per ddPCR per il rilevamento ad alto rendimento di indels generati da un sistema di gene-drive basato su Cas / gRNA nelle zanzare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR-grade Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any certified PCR-grade water can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K 20 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward and Reverse oligonucleotide primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital-droplet pcr to detect indels mutations in genetically modified anopheline mosquito populations

I recenti progressi nella genomica delle zanzare e nelle tecnologie di ingegneria genetica hanno favorito la necessità di metodi rapidi ed efficienti per rilevare variazioni mirate della sequenza di DNA su larga scala. In particolare, il rilevamento di inserzioni e delezioni (indels) in siti geneticamente modificati generati da CRISPR guide RNA (gRNA)/Cas9-mediated non-omologo end-joining (NHEJ) è importante per valutare la fedeltà della mutagenesi e la frequenza dei cambiamenti non intenzionali. Descriviamo qui un protocollo per la PCR a goccia digitale (ddPCR) che è adatto per l'analisi NHEJ ad alto rendimento. Sebbene questo metodo non produca dati che identifichino la variazione della singola sequenza, fornisce una stima quantitativa della variazione della sequenza all'interno di una popolazione. Inoltre, con risorse appropriate, questo protocollo può essere implementato in un ambiente di laboratorio sul campo più facilmente rispetto al sequenziamento di nuova generazione o Sanger. ddPCR ha anche un tempo di risposta più rapido per i risultati rispetto a uno di questi metodi, che consente un'analisi più rapida e completa della variazione genetica nelle popolazioni selvatiche durante le prove sul campo di organismi geneticamente modificati.

Un'applicazione di questa procedura appare in Carballar-Lejarazú et al.9. Il ddPCR Drop-off assay utilizza due sonde fluorescenti per discernere le sequenze WT e indel: una sonda FAM si lega a una sequenza conservata all'interno dell'amplicon, mentre la sonda HEX prende di mira la sequenza WT del sito bersaglio (Figura 4A). In presenza di un indel, la sonda HEX non si lega. I risultati rappresentativi possono essere trovati in Figura 2,Tabella 1 e Tabella 2 di Carballar-Lejarazú et al.9. Utilizzando questo protocollo, ddPCR ha dimostrato di rilevare un'ampia varietà di eventi NHEJ indotti da CRISPR-Cas9 e quantificare la frequenza NHEJ in un campione individuale o aggregato. Quindici diversi campioni raggruppati di 10 zanzare contenevano ciascuno vari alleli NHEJ (Tabella 2 di Carballar-Lejarazú et al.9). Questi sono stati analizzati con ddPCR utilizzando il protocollo e i parametri qui presentati. I risultati della Tabella 19 mostrano che tutti i 15 campioni portavano alleli indel al 100% come identificato dal test Drop-off (Figura 4B). In un altro esperimento, 11 campioni aggregati di zanzare WT e zanzare NHEJ con diverse percentuali di NHEJ (0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100%) sono stati esaminati con questo protocollo ddPCR e i risultati (Figura 2; Carballar- Lejarazú et al.9) hanno mostrato che la percentuale identificata è vicina alla tecnica di confronto di Indel Detection by Amplicon Analysis (Figura 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig01.jpg"> Figura 1: Impostazione e procedura sperimentale. (A) Preparazione della cartuccia per la generazione di goccioline. (In alto) I campioni vengono riempiti nella fila centrale della cartuccia, mentre l'olio viene riempito nella riga inferiore. (In basso) Fila superiore riempita con goccioline emulsionate dopo la generazione di goccioline. B)Generatore di gocce con una cartuccia riempita di campione e coperta da una guarnizione in posizione. (C) Piastra a 96 pozzetti ricoperta di guarnizione di alluminio in un termociclatore. (D) Lettore di goccioline con piastra a 96 pozzetti in posizione con un coperchio metallico agganciato sopra la piastra per fissarla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig02.jpg"> Figura 2: Lettura droplet. (A) Interfaccia software per la lettura di droplet. Le scatole arancioni mostrano pozzi con campioni. Le scatole grigie sono pozzi vuoti. I parametri sperimentali sono impostati nel pannello Strumenti di modifica (lato destro). Ogni campione può essere modificato facendo clic sulla rispettiva casella di campionamento. Selezionare Drop Off (DOF) per Tipo sperimentale. Nelle informazioni di esempio, inserire le informazioni appropriate per il nome e il tipodell'esempio , nonché SuperMix. Scegliere il drop-off di base per le informazioni sul test. Per l'esempio WT, scegliere WT per il nome di destinazione, Ref per tipo di destinazionee FAM e HEX per il segnale Ch1 e Ch2, rispettivamente. Per gli esempi NHEJ, inserire il nome appropriato per il nome di destinazione, scegliere Sconosciuto per il tipo di destinazionee scegliere FAM per segnale Ch1. Lasciare Signal Ch2 a Nessuno. (B) Risultati del conteggio delle goccioline per più campioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig03.jpg"> Figura 3: Analisi del saggio drop-off. (A) Cluster 2D plot per il conteggio delle goccioline degli alleli WT e NHEJ. Nella scheda Ampiezza 2D, tutti i droplet non sono classificati per impostazione predefinita. In questa figura, i colori vengono assegnati manualmente per la distinzione. Il cluster di punti arancioni sono conteggi di alleli WT ottenuti legando sia le sonde FAM che HEX rispettivamente alla sequenza di riferimento e alla sequenza del sito target. I punti blu rappresentano decine di goccioline con legame FAM alla sequenza di riferimento ma nessun legame HEX nella sequenza del sito di destinazione (quindi drop-off di HEX). I punti grigi sono goccioline vuote che non hanno né FAM né binding HEX. (B) Grafici di rapporto/abbondanza degli eventi NHEJ. Nella scheda Rapporto, selezionare Abbondanza frazionaria per un grafico con la percentuale corrispondente di eventi NHEJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig04.jpg"> Figura 4: Applicazione del test Drop-Off con ddPCR per l'identificazione e la quantificazione della giunzione finale non omologa nella linea transgenica Anopheles stephensi, AsMCRkh1. (A) Presentazione schematica del saggio ddPCR Drop-Off per rilevare mutazioni in un sito di DNA mirato con un sistema a doppia sonda. Un amplicon di 150-400 bp è amplificato con i primer avanti e indietro. Una sonda con etichetta FAM è progettata per legarsi a una sequenza conservata dell'amplicone, mentre una sonda con etichetta HEX è progettata per legarsi al sito bersaglio del gRNA WT. (B) Rilevazione di vari tipi di indels con ddPCR. Quindici pool di 10 zanzare AsMCRkh1 contenenti ciascuno vari tipi di indel, tra cui inserimento, delezione e sostituzione, sono stati analizzati con il test ddPCR Drop-Off. I dettagli delle mutazioni e delle sequenze possono essere trovati nella Tabella 2 e nella Tabella S3 di Carballar et al. 9. (C) Quantificazione di NHEJ in campioni misti di zanzare AsMCRkh1 e WT con vari rapporti (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 e 0:10) utilizzando ddPCR e una tecnica comparativa di Indel Detection di Amplicon Analysis9. Immagini adattate da Carballar-Lejarazú et al. Biotechniques. 68(4):172-179 (2020)9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer/Sonda</td>
			<td>Sequenza (5' » 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR Forward Primer</td>
			<td>ATGATCAAATGTCGACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR Primer inverso</td>
			<td>ACCGTACTGGTTGAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonda ddPCR HEX (BHQ1)</td>
			<td>[ESADECIMALE]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonda ddPCR FAM (BHQ1)</td>
			<td>[6FAM]-CCACGTGGGATCGAAGG-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HEX: Esacloro-fluoresceina, FAM: 6-carbossifluoresceina, BHQ: Black Hole Quencher</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Sequenze di primer e sonde.

Watch this Scientific Journal Video about Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations at JoVE.com

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Questo protocollo fornisce le fasi dall'estrazione del DNA al set-up sperimentale per la PCR a goccia digitale (ddPCR), compresa l'analisi per l'identificazione e la quantificazione di eventi di giunzione finale non omologa (NHEJ) nei siti bersaglio a seguito di scissione Cas9 indotta da gRNA e riparazione del DNA. Altri usi di questo metodo includono applicazioni come il rilevamento del polimorfismo e la verifica delle varianti di modifica genetica.

Digital-Droplet PCR per rilevare mutazioni di Indels in popolazioni di zanzare anofeline geneticamente modificate

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

Questo protocollo fornisce un elevato throughput e un trucco affidabile per l'analisi NHEJ in grado di determinare la prevalenza e la quantità relativa di mutazioni Indel nelle popolazioni di zanzare geneticamente modificate. Rispetto alla generazione successiva, o sequenziamento Sanger, ddPCR ha tempi di risposta più rapidi per i risultati, che consente un'analisi rapida e completa della variazione genetica sul campo per gli organismi geneticamente modificati. Questo metodo dovrebbe essere generalmente applicabile a tutti i sistemi sperimentali.A dimostrare la procedura sarà Thai Pham, un ricercatore associato del laboratorio di Yang. Per cominciare, preparare 25 microlitri della PCR a goccia digitale o del mix di campioni ddPCR aggiungendo ddPCR super mix, primer avanti e indietro, sonde HEX o FAM, DNA e acqua nelle proporzioni descritte nel testo. Quindi mescolare accuratamente la reazione vorticosamente.Utilizzando una pipetta multicanale da 50 microlitri, caricare 20 microlitri della miscela di campioni ddPCR nella fila centrale della cartuccia. Quindi utilizzare una pipetta multicanale da 200 microlitri per caricare 70 microlitri dell'olio nella fila inferiore senza generare bolle in tutta la pipetta. Posizionare la guarnizione, toccando solo i bordi, evitando il centro, l'area concava, quindi posizionare saldamente la piastra nel generatore di gocce e chiudere il coperchio per avviare la corsa.Per trasferire la miscela ad immersione dalla fila superiore della cartuccia alla piastra a 96 pozzetti, utilizzare una pipetta multicanale e far cadere 40 microlitri di campione liquido per tre-cinque secondi con un angolo compreso tra 30 e 45 gradi. Quindi espellere la miscela nel pozzo lentamente per oltre tre secondi con un angolo di 45 gradi, permettendogli di cadere di lato, quindi andare alla seconda fermata della pipetta per espellere completamente il liquido. Utilizzando i termosaldai in lamina, sigillare le piastre per cinque secondi a 180 gradi Celsius.Posizionare la piastra sigillata nel termociclatore e impostare le condizioni PCR per le linee guida di caduta NHEJ impostando la denaturazione iniziale a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, impostare 40 cicli di 94 gradi Celsius per 30 secondi per denaturare, 55 gradi Celsius da un minuto alla ricottura e 60 gradi Celsius per due minuti per estendere. Dopo 40 cicli, impostare la tenuta a 98 gradi Celsius per 10 minuti e la tenuta finale a quattro gradi Celsius.Utilizzare una velocità di rampa di due gradi Celsius al secondo per tutti i passaggi. La temperatura di ricottura varierà, a seconda delle sonde o del primer utilizzato. Posizionare saldamente la piastra nel lettore di gocce con l'A1 etichettato bene in alto a sinistra.Aprire il programma e impostare la piastra designando FAM come canale di riferimento noto e HEX come quello sconosciuto per ciascun pozzetto. Quindi, modificare il nome per ogni campione. Eseguire l'esperimento di lettura droplet come quantificazione diretta durante il salvataggio del modello.Designare i parametri sperimentali corretti per l'analisi del software, ovvero informazioni sul campione, super mix, nome del target, tipo di target, canale del segnale uno e canale due. Quindi, impostare la soglia per il conteggio delle goccioline superiore a 10.000 per risultati affidabili. Quindi, controlla il conteggio delle gocce per ogni pozzetto nella scheda dei droplet, assicurandoti che tutti siano superiori a 10.000.Infine, controlla l'ampiezza 1D per un'efficiente separazione del segnale dai negativi. Nell'editor di piastre, evidenziate l'intera piastra e impostate il tipo di esperimento in modo che venga eliminato. Impostare la destinazione WT come riferimento, designando il canale uno per FAM e il canale due per HEX.Impostare la destinazione NHEJ come sconosciuta, designando il canale uno per FAM e il canale due come nessuno. Nella scheda Ampiezza 2D, impostare le soglie del cluster con gli strumenti grafico per ogni campione. La coda è normalmente associata al cluster WT per i saggi NHEJ.Nella scheda rapporto, fai clic sull'icona a forma di ingranaggio in alto a destra del grafico e seleziona l'abbondanza frazionaria per tracciare un punto corrispondente alla percentuale di eventi NHEJ. 15 diversi campioni estratti di 10 zanzare contenevano ciascuno vari alleli NHEJ, sono stati analizzati e identificati utilizzando il test di caduta e i risultati hanno mostrato che tutti i 15 campioni trasportavano alleli Indel al 100%. In un altro esperimento, 11 campioni estratti di zanzare selvatiche e zanzare NHEJ con diverse percentuali di NHEJ sono stati esaminati con questo protocollo ddPCR.I risultati hanno mostrato che la percentuale identificata era relativamente vicina al rilevamento Indel mediante la tecnica di analisi amplicon. Pipettare lentamente per evitare bolle e lasciare che tutte le goccioline emulsionate gocciolino lungo la parete dei pozzetti.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

La fusione assoluta e relativa PCR quantitativa dei dati per quantificare STAT3 Splice Variant Trascrizioni

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Ricerca

Genetica

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Il monitoraggio spaziale segregazione in superficie Colonizzare microbiche Popolazioni

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Unicellulare espressione genica Utilizzando Multiplex RT-qPCR per caratterizzare eterogeneità delle rare popolazioni linfoidi

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Wild-type Blocco PCR Combinato con sequenziamento diretto come un metodo altamente sensibile per il rilevamento di bassa frequenza di mutazioni somatiche

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identificare le mutazioni con lo scioglimento ad alta risoluzione in una popolazione di riso TILLING

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

Uso di embrioni congelati per la produzione ad alta efficienza di topi geneticamente modificati

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Consegna di mRNA modificato in un modello di topo di infarto miocardico

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Introduzione di mutazioni puntiformi nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando l'editing del genoma senza soluzione di continuità

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...