Name: digital-droplet pcr to detect indels mutations in genetically modified anopheline mosquito populations
Uploaded: 2021-06-28T14:00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations at JoVE.com

Finansieringen ble gitt av University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ er professor i Donald Bren ved University of California, Irvine.

1. DNA-ekstraksjon
<ol><li>Forbered EDTA/Nuclei Lysis Buffer (EDTA/NLS) med forholdet 500 μL NLS og 120 μL EDTA per prøve. Oppskalering for flere prøver. Kjøl blandingen på is. MERK: Oppløsningen blir overskyet om 2-5 minutter når den er avkjølt, avhengig av volumet.</li>
	<li>Homogeniser myggprøven ved hjelp av en mekanisk homogenisator for 10-15 s i et 1,5 ml mikrosenterrør fylt med 600 μL kjølt EDTA / NLS; blande grundig.</li>
	<li>Tilsett 17,5 μL 20 mg/ml Proteinase K i røret og bland grundig.</li>
	<li>Inkuber over natten ved 55 °C. Alternativt inkuber prøven ved 55 °C i 3 timer med risting og virvelprøven hver 1 time.</li>
	<li>Tilsett 200 μL proteinutfellingsløsning i romtemperaturprøven og virvel kraftig i 20 s.</li>
	<li>Kjøl prøven i 5 min på is.</li>
	<li>Sentrifuger prøven til pelletsproteiner ved 15 890 RCF i 4 min.</li>
	<li>Aspirer forsiktig supernatanten som inneholder DNA-et og overfør det til et rent 1,5 ml mikrosenterrør som inneholder 600 μL isopropanol.</li>
	<li>Bland oppløsningen forsiktig ved å invertere røret 5-10 ganger. Sentrifuge i 1 min på 15,890 RCF. Dekanter supernatanten forsiktig mens du bevarer DNA-pelletsen.</li>
	<li>Tilsett 600 μL romtemperatur 70% etanol. Vask det pelleterte DNA-et ved å invertere røret forsiktig.</li>
	<li>Sentrifuge i 1 min på 15,890 RCF. Fjern forsiktig supernatanten ved aspirasjon ved hjelp av en glasspipettespiss.</li>
	<li>Snu røret på rent absorberende papir og lufttørk pelletsen i 10-15 min.</li>
	<li>Resuspend DNA med PCR-grade vann. Bruk 20 μL per individuell myggprøve eller 100 μL for 10 samlede mygg. MERK: DNA-ekstraksjonsmetoder for myggprøver ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett (se Materialfortegnelser) er tilpasset produsentens isolerende genomiske DNA fra vevskulturceller og dyrevevsprotokoll.</li>
</ol>2. ddPCR reaksjoner og dråpe generasjon forberedelse
<ol><li>Kvantifisere DNA ved hjelp av et fluorometer. MERK: For drop-off-analysen anbefales det å bruke en rekkevidde på 3000-30 000 haploide genomkopier per reaksjon, som er designet for å oppdage NHEJ-hendelser med en HEX-merkingssonde som binder seg til en WT-sekvens av det målrettede kuttestedet og ikke vil anneal (drop-off) hvis det er en sletting eller innsetting på målstedet, indikerer tilstedeværelsen av en NHEJ-variant.</li>
	<li>Beregn kopinummeret ved hjelp av haploid genomvekt og konsentrasjon av DNA i ekstraktet. Dette gjøres ved å multiplisere konsentrasjonen av det ekstraherte DNA-et med volumet som brukes til å oppnå den totale DNA-massen, og deretter dele den med haploid genomvekten. Forsikre deg om at volumet som tilsettes er mellom 1-10 μL. Fortynn etter behov for å være i det anbefalte haploide genomkopiområdet. MERK: En Anopheles gambiae haploid genom er anslått til å være 0,27 pg per voksen mygg10.</li>
	<li>Design primere og sonder. Design fremover og omvendt oligonukleotidprimere med en Primer Smeltetemperatur (Tm) i området 55-60 °C som flankerer de 5' og 3'-endene av gRNA-målstedet som produserer en amplikon på 150-400 bp.<ol>
<li>HEX (Hexachloro-fluorescein)-merket sonde for NHEJ-deteksjon: Design en oligonukleotid på ~ 15-20 bp i lengde komplementært til målstedet og legg HEX-sonden til 5'-end og BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) til 3' enden. Tm av hydrolysesonden skal være 3-10 °C høyere enn primernes Tm.</li>
		<li>FAM (6-karboksyfluorescein)-merket sonde for referanse WT: Design en oligonukleotid ~ 15-20 bp i lengde komplementær til et bevart genomsted fjernt (ca. 25 bp) fra målstedet og legg FAM-sonden til 5'-end og BHQ1 til 3' enden. Tm av hydrolysesonden skal være 3-10 °C høyere enn primernes Tm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PCR reaksjon forberedelse
<ol><li>Klargjør 25 μL av ddPCR-prøveblandingen med følgende komponenter: ddPCR supermix for sonder (ingen UTP): 12,5 μL, fremover og bakover primere (10 μM): 1 μL hver, HEX/FAM-sonder (10 μM): 0,625 μL hver, DNA: 1-5 μL (3750-37 500 haploide genomkopier) og vann: opptil 25 μL.</li>
	<li>Bland reaksjonene grundig ved å virvelere eller refluks pipettering (opp og ned) (20x). MERK: Hvis reaksjonene er i en 96-brønns plate, pipette hele volumet opp og ned 20 ganger i stedet for virveling for å unngå bobledannelse.</li>
	<li>Sentrifuger prøvene kort for å avgjøre blandingen på bunnen av røret eller brønnen. MERK: Sørg for at reaksjonene er ved romtemperatur for dråpegenereringen. Forbered 1x ddPCR-blanding for ekstra/ubrukte brønner i hver patron (hver patron har 8 brønner).</li>
</ol>4. Dråpegenerering
<ol><li>Bruk en 50 μL flerkanals pipette til å laste 20 μL av ddPCR-prøveblandingen inn i den midterste raden på patronen (Figur 1A, øverst).</li>
	<li>Legg 70 μL av oljen i den nederste raden. Last 20 μL 1x ddPCR supermix inn i ubrukte brønner. MERK: Ikke innfør bobler.</li>
	<li>Plasser pakningen bare ved å berøre kantene, og unngå det midtre konkave området (Figur 1B).</li>
	<li>Plasser platen godt i dråpegeneratoren og lukk dekselet for å starte kjøringen.</li>
	<li>Bruk flerkanalspipetten til å overføre 40 μL av emersionblandingen fra den øverste raden på patronen (figur 1A, nederst) til 96-brønnsplaten.<ol>
<li>Tegn væskeprøve for 3-5 s i en 45-30° vinkel. Utvis blandingen langsomt i over 3 s i en 45° vinkel inn i siden av brønnen, slik at den kan dryppe ned på siden. Det er greit å gå til den andre stoppen (fullstendig utvisning) av pipetten for å utvise all væsken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bruk folievarmetetninger til å forsegle platene i 5 s ved 180 °C.</li>
</ol>5. PCR
<ol><li>Plasser den forseglede platen i termosykleren (figur 1C) og still inn de anbefalte PCR-betingelsene hvis du følger NHEJ-avleveringsretningslinjene som følger:<ol>
<li>Første denaturering ved 95 °C i 10 minutter.</li>
		<li>Sett 40 sykluser på 94 °C i 30 s til protese, 55 °C i 1 min til anneal og 60 °C i 2 minutter for å forlenge.</li>
		<li>Hold ved 98 °C i 10 minutter.</li>
		<li>Hold ved 4 °C. MERK: Glødetemperaturen for bestemte primere og sondesett kan optimaliseres ved hjelp av en termisk gradient. Bruk en rampehastighet på 2 °C/s for alle trinnene. PCR-forholdene bør justeres avhengig av hver eksperimentelle design og oppsett.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Dråpeavlesning
<ol><li>Plasser platen sikkert i dråpeleseren med brønn A-1 øverst til venstre (glattet hjørne, de tre andre er kantet) (Figur 1D).</li>
	<li>Sett opp platen i programmet: Angi FAM som den kjente referansekanalen og HEX som den ukjente (Figur 2A).</li>
	<li>Kjør dråpelesingseksperimentet som direkte kvantifisering. Når kjøringen er fullført, endrer du Eksperimentering -typen til Avlevering (DOF) for analysen (Figur 2A).</li>
</ol>7. Analyse
<ol><li>Angi de riktige eksperimentelle parametrene (Figur 2A): Eksempelinformasjon, SuperMix, Målnavn (WT eller NHEJ), Måltype (Ref eller Ukjent), Signal Ch1 (HEX eller FAM), Signal Ch2 (HEX eller FAM), og angi manuelt terskelen for droplet count (anbefal over 10 000 for pålitelige resultater). Programvaren vil utføre det meste av analysen med den angitte parameteren.</li>
	<li>Kontroller antall dråper i kategorien Slippverktøy . påse at alle er over 10 000 (figur 2B).</li>
	<li>Kontroller 1 D amplitude for effektiv signalseparasjon fra negativer.</li>
	<li>Merk hele platen i Plateredigering, og sett Eksperimenteringstype til Avlevering.</li>
	<li>Angi WT-målet som en referanse, og angi kanal én for FAM og kanal to for HEX.</li>
	<li>Angi NHEJ-målet som ukjent, og angi kanal én for FAM og kanal to som ingen.</li>
	<li>I kategorien 2D-amplitude angir du klyngeterskler med diagramverktøyene for hvert utvalg. Vurder halen som er knyttet til WT-klyngen. Dette er normalt for NHEJ-analyser (Figur 3A). MERK: Under Forhold-fanen klikker du på Tannhjulikonet øverst til høyre i grafen. Velg Brøkoverflod. Grafen vil nå tegne inn et punkt som tilsvarer prosentandelen NHEJ-hendelser (Figur 3B).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li><li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae.">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).</li><li>Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Bo&#235;te, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agricultural+pest+control+with+CRISPR-based+gene+drive:+time+for+public+debate:+Should+we+use+gene+drive+for+pest+control.">Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control.</a> EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11, 5553 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+and+direct+Sanger+sequencing+for+the+detection+of+the+BRAFV600E+mutation+in+papillary+thyroid+carcinoma.">Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902 (2019).</li><li>Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+droplet+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+characterizing+DNA+reference+material+for+KRAS+mutation+detection.">Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9650 (2018).</li><li>Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+strategy+for+detecting+CRISPR_Cas9+induced+mutations+using+next-generation+sequencing.">A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 15 (1), 1002 (2014).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+droplet+PCR+and+IDAA+for+the+detection+of+CRISPR+indel+edits+in+the+malaria+species+Anopheles+stephensi.">Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi.</a> Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).</li><li>Holt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298 (5591), 129-149 (2002).</li></ol>

Forfatterne har ingen avsløringer.

Digital-droplet PCR er en effektiv metode for å bestemme tilstedeværelsen av indel alleler som følge av NHEJ hendelser i en Cas / gRNA-basert gen-drive system og tillater kvantifisering av frekvensen av disse allelene i enkeltpersoner eller populasjoner. Noen trinn i protokollen må følges med spesiell forsiktighet for å oppnå pålitelige resultater. For det første må den genomiske DNA-ekstraksjonen utføres nøye for å sikre høy kvalitet og tilstrekkelig mengde. En god ekstraksjon vil tillate nøyaktig bestemmelse av haploide genomkopier per reaksjon. Vår erfaring er at et kommersielt tilgjengelig sett (se Materialfortegnelser) har gitt konsekvent DNA-ekstraksjoner av høy kvalitet. Imidlertid kan ekstraksjoner av individuelle mygg vise seg å være spesielt utfordrende, da DNA-pellet blir vanskelig å visualisere og lett kan suges opp med supernatanten hvis ikke forsiktig. For det andre må primere og sonder utformes nøye. Før du fullfører ddPCR-eksperimentet, må du sørge for at de designede primerne resulterer i et enkelt PCR-produkt ved først å utføre en tradisjonell PCR og visualisere et enkelt produkt via gelelektroforese. Referansen FAM-sonde må også utformes slik at den suppleres med en svært konservert sekvens. Dette vil sikre nøyaktige deteksjoner av WT-alleler i en mangfoldig befolkning. Primer/sondekombinasjonene for hvert unike eksperiment vil ha forskjellige termosirkuleringsforhold, og det anbefales å optimalisere disse forholdene ved hjelp av en termisk gradient.
Det finnes andre metoder for å identifisere indels, for eksempel Sanger-sekvensering eller NGS. Sangersekvensering er begrenset fordi den har en lavere grense for deteksjon og lav oppdagelseskraft for å identifisere nye varianter. Sangersekvensering er også arbeidskrevende og er ikke høy gjennomstrømning. Sammenlignet med Sanger-sekvensering har ikke NGS de samme begrensningene for lav følsomhet, oppdagelseskraft og gjennomstrømning. En annen fordel med NGS er dens evne til å oppdage en rekke mutasjoner fra enkelt nukleotidpolymorfisme (SNPer) til omorganiseringer. NGS er imidlertid en mer kostbar og tidkrevende metode for å bestemme Cas9/gRNA-tilknyttede indels fordi det bare er ett målområde av interesse, og det er best egnet for større genomomfattende analyser. Sammenlignet med de nevnte metodene, er ddPCR høy gjennomstrømning og har en rask snutid. Hvis ddPCR-materialene og instrumentene er tilgjengelige internt, kan 96 prøver behandles innen 1-2 dager, noe som gjør det godt egnet for rask analyse av store studier av Cas9 / gRNA-modifiserte organismer.
Mens det finnes mange fordeler for ddPCR, er det også begrensninger. For det første er ddPCR-utstyret ikke ofte tilgjengelig i et uavhengig laboratoriemiljø. ddPCR-utstyr kan være tilgjengelig i fellesskap ved større forskningsinstitusjoner, men dette åpner ikke for enkel datagenerering og analyse utenfor institusjonen. For det andre, i motsetning til alternativene, gir ddPCR ikke de individuelle unike sekvensene av identifiserte indelmutasjoner. Digital-droplet PCR vil gi frekvensen av indel mutasjoner i en populasjon, men uten sekvensen kan man ikke avgjøre om de indels tilstede er mer sannsynlig å bevare eller hemme funksjonen til genet av interesse. ddPCR-metoden er kanskje best egnet til å analysere ville populasjoner etter en feltutgivelsesstudie av en Cas9/gRNA-basert drivorganisme fordi den effektivt kan bestemme hyppigheten av innføring av transgene i den innfødte befolkningen og genereringen av indels i befolkningen i nær sanntid. På grunn av ddPCR rask snutid, ville det være mulig å utføre prøvetaking og analysere befolkningen i et feltforsøksområde ukentlig hvis materialer var tilgjengelige lokalt. Oppstartskostnadene for å kjøpe, importere og sette opp ddPCR-utstyret ville være høyt i eksterne laboratorier, men fordelene ved å kunne vurdere strengt en vill befolkning da det gjennomgår modifikasjon fra et drivsystem, vil rettferdiggjøre kostnadene.

Genstasjoner har et enormt potensial for å kontrollere insektpopulasjoner av medisinsk og landbruksrelevans1,2,3,4,5. For eksempel kan gen-drivsystemer basert på CRISPR Cas-nukleaser og guide RNAer (gRNAer) brukes til å modifisere vektor myggpopulasjoner ved å introdusere egenskaper som gir ildfasthet til malariaparasitter som fører til redusert overføring og mindre sykdom1,4,5. Gendriftssystemet kopierer seg selv og det tilhørende trekket fra ett homologt kromosom til et annet i de premetiotiske bakteriecellene, og dette sikrer at flertallet av avkomene arver stasjonen og skaper potensial for langvarig og bærekraftig befolkningsendring i feltet. En ulempe ved cas/gRNA-baserte metoder er imidlertid muligheten for å generere innsettings- og slettingsmutasjoner (indel) gjennom ikke-homolog end-joining (NHEJ) DNA-reparasjon, noe som resulterer i generering av stasjonsbestandige alleler, som når de akkumuleres til en høy nok frekvens i befolkningen, kan stoppe stasjonssystemet fra å spreseg 1,2,3,4 . Denne protokollen beskriver en høy gjennomstrømnings- og pålitelig metode som kan bestemme utbredelsen og den relative mengden indelmutasjoner, både på befolknings- og individnivå, under Cas/gRNA-basert gendrift.
Neste generasjons sekvenseringsmetoder (NGS) gir enestående sekvenseringsoppløsning. Kostnads- og tekniske krav knyttet til NGS forbyr imidlertid rutinemessig testing og begrenser bruken som en metode for høy gjennomstrømning for å vurdere indels6,7,8. Tradisjonelle PCR-kvantifiseringsmetoder har lenge vært brukt som standard evalueringsprosedyre for genom indels; Disse metodene er imidlertid arbeidskrevende, tar lang tid å skaffe data og har en høy grad av variasjon. Digital-Droplet PCR (ddPCR) har vist seg å være mer følsom for å oppdage mutasjoner enn Sanger-sekvensering i noen programmer og har en lavere deteksjonsgrense enn NGS i andre6,7,8,9. Dessuten er kostnaden for å vurdere et utvalgssett og snutid for å oppnå resultater billigere og raskere, henholdsvis for ddPCR enn enten Sanger-sekvensering eller NGS9. Ved hjelp av et dobbeltsondesystem identifiserer Drop-Off-analysen NHEJ-alleler basert på fraværet av wild-type (WT) sekvens på gRNA-rettet mål Cas9-kuttet sted. I denne analysen forsterkes en kort amplikon, inkludert det anslåtte kuttestedet til det Cas/gRNA-baserte systemet, med et bestemt primerpar. En fluorescerende sonde er designet for å binde seg til en bevart region av amfinen, og en annen fluorescerende sonde gjenkjenner WT-sekvensen på kuttstedet. I nærvær av et NHEJ-allel vil sistnevnte ikke binde seg til amfinen.
Bruken av ddPCR gir muligheten til å designe primere for å målrette slettinger, enkelt base-par forskjeller og innsettinger, noe som vil tillate NHEJ profilering i myggpopulasjonsanalyser9. Gitt disse attraktive funksjonene, opprettet vi en protokoll for ddPCR for høygjennomstrømningsdeteksjon av indels generert fra et Cas / gRNA-basert gendriftssystem i mygg.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR-grade Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any certified PCR-grade water can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K 20 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward and Reverse oligonucleotide primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital-droplet pcr to detect indels mutations in genetically modified anopheline mosquito populations

Nylige fremskritt innen mygggenomikk og genteknologi har fremmet et behov for raske og effektive metoder for å oppdage målrettet DNA-sekvensvariasjon i stor skala. Spesielt er det viktig å oppdage innsettinger og slettinger (indels) på genredigerte steder generert av CRISPR-guiden RNA (gRNA)/Cas9-mediert ikke-homolog sluttkobling (NHEJ) for å vurdere gjengivelsen av mutagenesen og hyppigheten av utilsiktede endringer. Vi beskriver her en protokoll for digital-droplet PCR (ddPCR) som er godt egnet for NHEJ-analyse med høy gjennomstrømning. Selv om denne metoden ikke produserer data som identifiserer individuell sekvensvariasjon, gir den et kvantitativt estimat av sekvensvariasjonen i en populasjon. I tillegg, med passende ressurser, kan denne protokollen implementeres i et feltstedslaboratorium enklere enn neste generasjons eller Sanger-sekvensering. ddPCR har også en raskere snutid for resultater enn en av disse metodene, noe som gir en raskere og fullstendig analyse av genetisk variasjon i ville populasjoner under feltforsøk av genetisk konstruerte organismer.

En anvendelse av denne prosedyren vises i Carballar-Lejarazú et al.9. DdPCR Drop-off-analysen bruker to fluorescerende sonder for å skjelne WT- og indelsekvenser: En FAM-sonde binder seg til en konservert sekvens i amfinen, mens HEX-sonden retter seg mot WT-sekvensen til det målrettede stedet (figur 4A). I nærvær av en indel vil HEX-sonden ikke binde seg. Du finner representative resultater i figur 2, tabell 1 og tabell 2 i Carballar-Lejarazú et al.9. Ved hjelp av denne protokollen har ddPCR vist seg å oppdage et bredt utvalg av CRISPR-Cas9-induserte NHEJ-hendelser og kvantifisere NHEJ-frekvensen i en individuell eller samlet prøve. Femten forskjellige samlede prøver på 10 mygg inneholdt hver forskjellige NHEJ-alleler (Tabell 2 av Carballar-Lejarazú et al.9). Disse ble analysert med ddPCR ved hjelp av protokollen og parametrene som presenteres her. Resultater fra tabell 19 viser at alle de 15 prøvene hadde 100 % indel alleler som identifisert av drop-off-analysen (Figur 4B). I et annet eksperiment ble 11 samlede prøver av WT-mygg og NHEJ-mygg med forskjellige NHEJ-prosenter (0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% og 100%) undersøkt med denne ddPCR-protokollen, og resultatene (Figur 2; Carballar- Lejarazú et al.9) viste at den identifiserte prosentandelen er nær den sammenlignede teknikken for Indel Detection ved Amplicon Analysis (Figur 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig01.jpg"> Figur 1: Eksperimentelt oppsett og prosedyre. (A) Klargjøring av patron for dråpegenerering. (Øverst) Prøver fylles ut i den midterste raden på patronen, mens olje fylles i den nederste raden. (Nederst) Øverste rad fylt med emulgert dråper etter dråpegenerering. (B) Dråpegenerator med en patron fylt med prøve og dekket av en pakning på plass. (C) 96-brønnsplate dekket med folietetning i en thermo-cycler. (D) Dråpeleser med 96-brønnsplate på plass med et metalldeksel festet over platen for å feste den. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig02.jpg"> Figur 2: Dråpeavlesning. (A) Programvaregrensesnitt for dråpelesing. Oransje bokser viser brønner med prøver. Grå bokser er tomme brønner. Eksperimentelle parametere er satt opp i Rediger verktøy-panelet (høyre side). Hvert eksempel kan redigeres ved å klikke på den respektive eksempelboksen. Velg Leveringslevering (DOF) for Eksperimentell type. I eksempelinformasjon fyller du ut riktig informasjon for eksemplets Navn og type, i tillegg til SuperMix. Velg den grunnleggende leveringen for analyseinformasjonen. For WT-eksemplet velger du WT for henholdsvis Målnavn, Ref for Måltypeog både FAM og HEX for henholdsvis Signal Ch1 og Ch2. For NHEJ-eksempler fyller du ut det aktuelle navnet på målnavnet, velger Ukjent for måltypenog velger FAM for Signal ch1. La Signal Ch2 stå på Ingen. (B) Resultater av antall slippverktøy for flere eksempler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig03.jpg"> Figur 3: Analyse av frafallsanalyse. (A) Cluster 2D-plott for dråpeantallet for WT- og NHEJ-allelene. I kategorien 2D-amplitude er alle slippverktøy uklassifisert som standard. I denne figuren tilordnes farger manuelt for å skille. Den oransje prikkklyngen er WT-alleleantall oppnådd ved binding av henholdsvis FAM- og HEX-sonder ved referansesekvensen og målområdesekvensen. Blå prikker representerer resultater av dråper som har FAM-binding til referansesekvensen, men ingen HEX-binding på målområdesekvensen (derav frafall av HEX). Grå prikker er tomme dråper som ikke har verken FAM- eller HEX-binding. (B) Forhold/overflod grafer av NHEJ hendelser. Velg Brøkoverflod for en graf med korrespondentprosenten for NHEJ-hendelser på Forhold-fanen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig04.jpg"> Figur 4: Anvendelse av drop-off analyse med ddPCR for ikke-homolog slutt-sammenføyning identifikasjon og kvantifisering i transgene Anopheles stephensi linje, AsMCRkh1. (A) Skjematisk presentasjon av ddPCR Drop-Off-analysen for å oppdage mutasjoner på et målrettet DNA-sted med et dobbeltsondesystem. En amplikon på 150-400 bp forsterkes med de fremre og omvendte primerne. En FAM-merket sonde er designet for å binde seg til en konservert sekvens av amfinen, mens en HEX-merket sonde er designet for å binde seg til WT gRNA-målrettet sted. (B) Påvisning av ulike typer indels med ddPCR. Femten bassenger med 10 AsMCRkh1 mygg som hver inneholder ulike typer indel, inkludert innsetting, sletting og substitusjon, ble analysert med ddPCR Drop-Off-analysen. Detaljer om mutasjoner og sekvenser finnes i tabell 2 og tabell S3 i Carballar et al. 9. (C) Kvantifisering av NHEJ i blandede prøver av AsMCRkh1 og WT mygg med ulike forhold (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 og 0:10) ved hjelp av ddPCR og en sammenlignet teknikk for Indel Detection av Amplicon Analysis9. Bilder tilpasset fra Carballar-Lejarazú et al. Biotechniques. 68(4):172-179 (2020)9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer/probe</td>
			<td>Sekvens (5' » 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR fremover primer</td>
			<td>ATGATCAAATGTCGACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR omvendt primer</td>
			<td>AKKUMULERTGGTTGAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR HEX-probe (BHQ1)</td>
			<td>[HEX]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR FAM-sonde (BHQ1)</td>
			<td>[6FAM]-CCACGTGGGATCGAAGG-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HEX: Hexachloro-fluorescein, FAM: 6-karboksyfluorescein, BHQ: Black Hole Quencher</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Sekvenser av primere og sonder.

Watch this Scientific Journal Video about Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations at JoVE.com

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Denne protokollen gir trinnene fra DNA-ekstraksjon til eksperimentelt oppsett for digital dråpe PCR (ddPCR), inkludert analyse for identifisering og kvantifisering av ikke-homologe slutt-sammenføyningshendelser (NHEJ) på målsteder etter gRNA-indusert Cas9-spalting og DNA-reparasjon. Andre bruksområder for denne metoden inkluderer applikasjoner som polymorfismedeteksjon og genredigeringsvariantverifisering.

Digital-Droplet PCR for å oppdage indelsmutasjoner i genetisk modifiserte anopheline myggpopulasjoner

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

Denne protokollen gir en høy gjennomstrømning og pålitelig sminke for NHEJ-analyse som kan bestemme utbredelsen og den relative mengden Indel-mutasjoner i genredigerte myggpopulasjoner. Sammenlignet med neste generasjon, eller Sanger-sekvensering, har ddPCR raskere behandlingstid for resultater, noe som muliggjør rask og fullstendig analyse av genetisk variasjon til felt for genetisk modifiserte organismer. Denne metoden bør generelt gjelde for alle eksperimentelle systemer.Å demonstrere prosedyren vil være Thai Pham, en stabsforskningsmedarbeider fra Yangs laboratorium. Til å begynne med kan du klargjøre 25 mikroliter av den digitale dråpe-PCR- eller ddPCR-prøveblandingen ved å legge til ddPCR supermiks, fremover og bakover primere, HEX- eller FAM-sonder, DNA og vann i proporsjonene som er beskrevet i teksten. Bland deretter reaksjonen grundig ved virveling.Bruk en 50 mikroliter flerkanals pipette til å laste 20 mikroliter av ddPCR-prøveblandingen inn i den midterste raden på patronen. Bruk deretter en 200 mikroliter flerkanals pipette for å laste 70 mikrolitere av oljen inn i den nederste raden uten å generere bobler gjennom pipetten. Plasser pakningen, bare berøre kantene, unngå midten, konkavt område, og plasser deretter platen sikkert i dråpegeneratoren, og lukk dekselet for å starte kjøringen.For å overføre nedsenkningsblandingen fra den øverste raden på patronen til 96-brønnsplaten, bruk en flerkanals pipette og slipp 40 mikroliter væskeprøve i tre til fem sekunder i en vinkel på 30 til 45 grader. Deretter utviser du blandingen sakte inn i brønnen i over tre sekunder i en 45 graders vinkel, slik at den kan falle ned fra siden, og deretter gå til pipettens andre stopp for å utvise væsken helt. Bruk folie varmetetninger, forsegle platene i fem sekunder ved 180 grader celsius.Plasser den forseglede platen i termosykleren, og still inn PCR-betingelsene for NHEJ-avleveringsretningslinjer ved å angi innledende denaturering ved 95 grader celsius i 10 minutter. Sett deretter 40 sykluser på 94 grader celsius i 30 sekunder til protese, 55 grader celsius fra ett minutt til anneal, og 60 grader celsius i to minutter for å forlenge. Etter 40 sykluser, sett hold på 98 grader celsius i 10 minutter, og siste hold på fire grader celsius.Bruk en rampehastighet på to grader celsius per sekund for alle trinn. Glødetemperaturen vil variere, i henhold til sondene eller primeren som brukes. Plasser platen godt i dråpeleseren med A1 merket godt øverst til venstre.Åpne programmet og sett opp platen ved å angi FAM som den kjente referansekanalen, og HEX som den ukjente for hver brønn. Deretter endrer du navnet på hvert eksempel. Kjør dråpelesingseksperimentet som direkte kvantifisering mens du lagrer malen.Angi de riktige eksperimentelle parametrene for programvareanalyse, nemlig eksempelinformasjon, supermiks, målnavn, måltype, signalkanal en og kanal to. Deretter angir du terskelen for slippverktøyantall over 10 000 for pålitelige resultater. Deretter kontrollerer du dråpeantallet for hver brønn i dråpefanen, og sikrer at alle er over 10.000.Til slutt, sjekk 1D amplitude for effektiv signalseparasjon fra negativer. I plateredigereren markerer du hele platen og angir eksperimenttypen som skal leveres. Angi WT-målet som en referanse, og angi kanal én for FAM og kanal to for HEX.Angi NHEJ-målet som ukjent, og angi kanal én for FAM og kanal to som ingen. I kategorien 2D-amplitude angir du klyngeterskler med diagramverktøyene for hvert utvalg. Halen er normalt forbundet med WT-klyngen for NHEJ-analyser.Under forholdsfanen klikker du på tannhjulikonet øverst til høyre i grafen, og velger brøkdelen av overflod for å plotte et punkt som tilsvarer prosentandelen NHEJ-hendelser. 15 forskjellige trukket prøver av 10 mygg hver inneholdt ulike NHEJ alleler, ble analysert og identifisert ved hjelp av drop off analyse, og resultatene viste at alle 15 prøver hadde 100% Indel alleles. I et annet eksperiment ble 11 trukket prøver av mygg av vill type og NHEJ mygg med forskjellige NHEJ-prosenter undersøkt med denne ddPCR-protokollen.Resultatene viste at den identifiserte prosentandelen var relativt nær Indel-deteksjonen ved amplikonanalyseteknikk. Pipette sakte for å unngå bobler, og la alle de emulgerte dråpene dryppe ned i brønnens vegg.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Sammenslåing absolutt og relativ Kvantitativ PCR data for å kvantifisere Stat3 spleisevariant Avskrifter

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Overvåking Spatial Segregering i Surface kolon mikrobepopulasjoner

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Encellede Gene Expression Bruke Multiplex RT-qPCR å karakter heterogenitet av sjeldne lymfoide populasjoner

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Villtype Blokkering PCR Kombinert med direkte sekvensering som en svært følsom metode for påvisning av lavfrekvent somatiske mutasjoner

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Eneste dråpe digitale polymerasekjedereaksjons omfattende og samtidige deteksjon av mutasjoner i Hotspot regioner

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identifisering av mutasjoner ved høy oppløsning smelting i en TILLING befolkning på Rice

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

Bruk av frysetinte embryoer for høyeffektivitetsproduksjon av genmodifiserte mus

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Levering av modifisert mRNA i en hjerteinfarkt mus modell

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Vi introduserer punktmutasjoner i menneskelige pluripotente stamceller ved hjelp av sømløs genomredigering

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...