Name: digital-droplet pcr to detect indels mutations in genetically modified anopheline mosquito populations
Uploaded: 2021-06-28T14:00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations at JoVE.com

O financiamento foi fornecido pela Iniciativa irvine de malária da Universidade da Califórnia. AAJ é um professor donald bren na Universidade da Califórnia, Irvine.

1. Extração de DNA
<ol><li>Prepare o EDTA/Nuclei Lysis Buffer (EDTA/NLS) com a razão de 500 μL de NLS e 120 μL de EDTA por amostra. Scale-up para várias amostras. Esfrie a mistura no gelo. NOTA: A solução ficará nublada em 2-5 min quando resfriada dependendo do volume.</li>
	<li>Homogeneize a amostra do mosquito utilizando um homogeneizador mecânico para 10-15 s em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL preenchido com 600 μL de EDTA/NLS refrigerado; Homogeneizar.</li>
	<li>Adicione 17,5 μL de 20 mg/mL de Proteinase K ao tubo e misture bem.</li>
	<li>Incubar durante a noite a 55 °C. Alternativamente, incubar a amostra a 55 °C por 3 h com agitação e vórtice a cada 1 h.</li>
	<li>Adicione 200 μL de Solução de Precipitação de Proteínas à amostra de temperatura ambiente e vórtice vigorosamente por 20 s.</li>
	<li>Esfrie a amostra por 5 minutos no gelo.</li>
	<li>Centrifugar a amostra para pelotas de proteínas a 15.890 RCF por 4 min.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente o supernasciente que contém o DNA e transfira-o para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL limpo contendo 600 μL de isopropanol.</li>
	<li>Misture suavemente a solução invertendo o tubo 5-10 vezes. Centrifugar por 1 min a 15.890 RCF. Decante cuidadosamente o supernatante preservando a pelota de DNA.</li>
	<li>Adicione 600 μL de temperatura ambiente 70% de etanol. Lave o DNA pelleted invertendo suavemente o tubo.</li>
	<li>Centrifugar por 1 min a 15.890 RCF. Remova cuidadosamente o supernatante por aspiração usando uma ponta de pipeta de vidro.</li>
	<li>Inverta o tubo em papel absorvente limpo e seque a pelota por 10-15 min.</li>
	<li>Resuspend o DNA com água de grau PCR. Use 20 μL por amostra individual de mosquito ou 100 μL para 10 mosquitos agrupados. NOTA: Os métodos de extração de DNA para amostras de mosquitos usando um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) são adaptados do DNA genômico isolante do fabricante a partir de células de cultura de tecido e protocolo de tecido animal.</li>
</ol>2. reações ddPCR e preparação da geração de gotículas
<ol><li>Quantifique o DNA usando um fluorômetro. NOTA: Para o ensaio de entrega, recomenda-se usar uma faixa de 3.000-30.000 cópias de genoma haploid por reação, que foi projetada para detectar eventos NHEJ com uma sonda de rotulagem HEX que se liga a uma sequência WT do local de corte direcionado e não será anneal (drop-off) se houver uma exclusão ou inserção no local alvo, indicando a presença de uma variante NHEJ.</li>
	<li>Calcule o número da cópia usando o peso do genoma haploide e concentração de DNA no extrato. Isso é feito multiplicando a concentração do DNA extraído pelo volume usado para obter a massa total de DNA, dividindo-a pelo peso do genoma haploide. Certifique-se de que o volume adicionado esteja entre 1-10 μL. Diluir conforme necessário para estar na faixa de cópia do genoma haploide recomendada. NOTA: Estima-se que um genoma haploide Anopheles gambiae seja de 0,27 pg por mosquito adulto10.</li>
	<li>Projete primers e sondas. Projete primers de oligonucleotídeos para a frente e invertido com uma temperatura de fusão primer (Tm) na faixa de 55-60 °C que flanqueiam as extremidades de 5'- e 3'-ends do local alvo gRNA produzindo um amplicon de 150-400 bp.<ol>
<li>HEX (Hexachloro-fluoresceína)-sonda rotulada para detecção NHEJ: Projete um oligonucleotídeo de ~15-20 bp em comprimento complementar ao local alvo e adicione a sonda HEX ao 5'-end e BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) ao final de 3'. O Tm da sonda de hidrólise deve ser 3-10 °C mais alto que o Tm dos primers.</li>
		<li>FAM (sonda de 6 carboxyfluoresceína) para referência WT: Projete um oligonucleotídeo ~15-20 bp em comprimento complementar a um local de genoma conservado distante (cerca de 25 bp) do local alvo e adicione a sonda FAM ao final de 5'-end e BHQ1 ao final de 3'. O Tm da sonda de hidrólise deve ser 3-10 °C mais alto que o Tm dos primers.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparação de reação pcr
<ol><li>Prepare 25 μL do ddPCR Sample Mix com os seguintes componentes: ddPCR supermix para sondas (sem UTP): 12,5 μL, Primers para frente e reverso (10 μM): 1 μL cada, sondas HEX/FAM (10 μM): 0,625 μL cada, DNA: 1-5 μL (3.750-37.500 cópias do genoma haploide) e água: até 25 μL.</li>
	<li>Misture bem as reações por vórtice ou pipetação de refluxo (para cima e para baixo) (20x). NOTA: Se as reações estiverem em uma placa de 96 poços, pipete todo o volume para cima e para baixo 20 vezes em vez de vórtice para evitar a formação de bolhas.</li>
	<li>Centrifufique brevemente as amostras para fixar a mistura na parte inferior do tubo ou bem. NOTA: Certifique-se de que as reações estão em temperatura ambiente para a geração de gotículas. Prepare 1x de mistura ddPCR para poços extra/não utilizados em cada cartucho (cada cartucho tem 8 poços).</li>
</ol>4. Geração de gotículas
<ol><li>Utilizando uma pipeta multicanal de 50 μL, carregue 20 μL da mistura de amostra ddPCR na linha média do cartucho(Figura 1A, superior).</li>
	<li>Coloque 70 μL do óleo na linha inferior. Carregar 20 μL de 1x ddPCR supermix em poços nãousados. NOTA: Não introduza bolhas.</li>
	<li>Coloque a junta tocando apenas as bordas, evitando a área central concavizada(Figura 1B).</li>
	<li>Coloque a placa com segurança no gerador de gotículas e feche a tampa para iniciar a corrida.</li>
	<li>Utilizando a pipeta multicanal, transfira 40 μL da mistura de emersão da linha superior do cartucho(Figura 1A, inferior) para a placa de 96 poços.<ol>
<li>Desenhe a amostra líquida para 3-5 s em um ângulo de 45-30°. Expulse a mistura lentamente por mais de 3 s em um ângulo de 45° para o lado do poço, permitindo que ela escorresse pelo lado. Não há problema em ir para a segunda parada (expulsão completa) da pipeta para expulsar todo o líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Com vedações de calor de folha, sele as placas por 5 s a 180 °C.</li>
</ol>5. PCR
<ol><li>Coloque a placa selada no termociclador (Figura 1C) e defina as condições recomendadas do PCR se seguir as diretrizes de drop-off do NHEJ da seguinte forma:<ol>
<li>Denaturação inicial a 95 °C por 10 min.</li>
		<li>Defina 40 ciclos de 94 °C para 30 s a desnaturais, 55 °C por 1 min a rúsco e 60 °C por 2 min para estender.</li>
		<li>Mantenha a 98 °C por 10 min.</li>
		<li>Mantenha a 4 °C. NOTA: A temperatura de ressarcimento para primers e conjuntos de sondas específicos pode ser otimizada usando um gradiente térmico. Use uma taxa de rampa de 2 °C/s para todas as etapas. As condições do PCR devem ser ajustadas dependendo de cada projeto experimental e configuração.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Leitura de gotícula
<ol><li>Coloque a placa com segurança no leitor de gotículas com bem A-1 no canto superior esquerdo (canto suavizada, os outros três são bordados)(Figura 1D).</li>
	<li>Configure a placa no programa: Designando fam como o canal de referência conhecido e HEX como o desconhecido (Figura 2A).</li>
	<li>Execute o experimento de leitura de Gotícula como quantificação direta. Após o término da corrida, altere o tipo de experimento para Drop-Off (DOF) para a análise(Figura 2A).</li>
</ol>7. Análise
<ol><li>Designe os parâmetros experimentais corretos(Figura 2A): Informações de amostra, SuperMix, Nome alvo (WT ou NHEJ), Tipo de Alvo (Ref ou Desconhecido), Sinal Ch1 (HEX ou FAM), Signal Ch2 (HEX ou FAM) e ajuste manualmente o limiar para contagem de gotículas (recomendo acima de 10.000 para resultados confiáveis). O software executará a maior parte da análise com o parâmetro designado.</li>
	<li>Verifique a contagem de gotículas na guia Gotícula; garantir que todos estejam acima de 10.000(Figura 2B).</li>
	<li>Verifique a amplitude 1 D para obter uma separação eficiente do sinal dos negativos.</li>
	<li>No Editor de placas,destaque toda a placa e defina o Tipo de Experimento para Cair.</li>
	<li>Defina o alvo WT como referência,designando o canal um para fam e o canal dois para HEX.</li>
	<li>Defina o alvo NHEJ como desconhecido, designando o canal um para fam e o canal dois como nenhum.</li>
	<li>Na guia de amplitude 2D, defina os limiares de cluster com as ferramentas de gráfico para cada amostra. Considere a cauda associada ao cluster WT; isso é normal para ensaios NHEJ(Figura 3A). NOTA: Na guia Proporção, clique no ícone de engrenagem do canto superior direito do gráfico. Selecione a Abundância Fracionária. O gráfico agora traçará um ponto correspondente à porcentagem de eventos NHEJ(Figura 3B).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li><li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae.">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).</li><li>Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Bo&#235;te, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agricultural+pest+control+with+CRISPR-based+gene+drive:+time+for+public+debate:+Should+we+use+gene+drive+for+pest+control.">Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control.</a> EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11, 5553 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+and+direct+Sanger+sequencing+for+the+detection+of+the+BRAFV600E+mutation+in+papillary+thyroid+carcinoma.">Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902 (2019).</li><li>Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+droplet+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+characterizing+DNA+reference+material+for+KRAS+mutation+detection.">Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9650 (2018).</li><li>Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+strategy+for+detecting+CRISPR_Cas9+induced+mutations+using+next-generation+sequencing.">A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 15 (1), 1002 (2014).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+droplet+PCR+and+IDAA+for+the+detection+of+CRISPR+indel+edits+in+the+malaria+species+Anopheles+stephensi.">Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi.</a> Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).</li><li>Holt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298 (5591), 129-149 (2002).</li></ol>

Os autores não têm revelações.

O PCR de gotícula digital é um método eficiente para determinar a presença de alelos indemais resultantes de eventos NHEJ em um sistema de unidade genética baseado em Cas/gRNA e permite quantificação da frequência desses alelos em indivíduos ou populações. Algumas etapas do protocolo precisam ser seguidas com cuidado especial para alcançar resultados confiáveis. Em primeiro lugar, a extração genômica de DNA precisa ser realizada cuidadosamente para garantir alta qualidade e quantidade suficiente. Uma boa extração permitirá a determinação precisa das cópias do genoma haploide por reação. Em nossa experiência, um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) forneceu extrações de DNA de alta qualidade consistentemente. No entanto, extrações de mosquitos individuais podem ser particularmente desafiadoras à medida que a pelota de DNA se torna difícil de visualizar e pode ser facilmente sugada com o supernante se não cuidadoso. Em segundo lugar, primers e sondas devem ser projetados cuidadosamente. Antes de completar o experimento ddPCR, certifique-se de que os primers projetados resultem em um único produto PCR, realizando primeiro um PCR tradicional e visualizando um único produto via eletroforese de gel. A sonda FAM de referência também deve ser projetada para que seja complementar a uma sequência altamente conservada. Isso garantirá detecções precisas de alelos WT em uma população diversificada. As combinações de primer/sonda para cada experimento único terão condições termocicras diferentes, e é recomendável otimizar essas condições usando um gradiente térmico.
Existem outros métodos para identificar indels, como sequenciamento de Sanger ou NGS. O sequenciamento de sanger é limitado porque tem um limite menor de detecção e baixo poder de descoberta para identificar novas variantes. O sequenciamento de sanger também é intensivo em mão-de-obra e não é de alto rendimento. Comparado ao sequenciamento de Sanger, o NGS não tem as mesmas limitações de baixa sensibilidade, poder de descoberta e throughput. Outro benefício do NGS é sua capacidade de detectar uma variedade de mutações desde o polimorfismo de nucleotídeos únicos (SNPs) até rearranjos. No entanto, o NGS é um método mais caro e demorado na aplicação da determinação de indels associados ao Cas9/gRNA, porque há apenas uma região-alvo de interesse, e é mais adequado para análises maiores em todo o genoma. Comparado com os métodos acima mencionados, o ddPCR é de alto rendimento e tem um tempo de retorno rápido. Se os materiais e instrumentos ddPCR estiverem disponíveis internamente, 96 amostras podem ser processadas dentro de 1-2 dias, tornando-a adequada para análise rápida de grandes ensaios de organismos modificados cas9/gRNA.
Embora existam muitos benefícios para o ddPCR, também existem limitações. Em primeiro lugar, o equipamento ddPCR não está frequentemente disponível em um ambiente de laboratório independente. os equipamentos ddPCR podem estar disponíveis em conjunto em instituições de pesquisa maiores, mas isso não permite a facilidade de geração e análise de dados fora da instituição. Em segundo lugar, ao contrário das alternativas, o ddPCR não fornece as sequências individuais únicas de mutações indel identificadas. O PCR de gotícula digital fornecerá a frequência de mutações indel dentro de uma população, mas sem a sequência, não se pode determinar se os indels presentes são mais propensos a conservar ou inibir a função do gene de interesse. O método ddPCR é talvez adequado para analisar populações selvagens após um teste de liberação de campo de um organismo de acionamento baseado em Cas9/gRNA, pois pode determinar eficientemente a frequência de introdução do transgene na população nativa e a geração de indels dentro da população em tempo real. Devido ao tempo de rápida retorno do DDPCR, seria viável realizar amostragem e analisar a população em uma região de ensaio de campo semanalmente se os materiais estivessem disponíveis localmente. Os custos in start-up para comprar, importar e configurar os equipamentos ddPCR seriam altos em laboratórios remotos, mas os benefícios de ser capaz de avaliar rigorosamente uma população selvagem, pois está passando por modificações de um sistema de acionamento justificaria os custos.

Os impulsos genéticos têm imenso potencial para controlar populações de insetos de relevância médica e agrícola1,2,3,4,5. Por exemplo, sistemas de acionamento genético baseados em núcleos CRISPR Cas e guia RNAs (gRNAs) podem ser usados para modificar populações de mosquitos vetoriais, introduzindo traços que conferem refractoridade a parasitas da malária levando à redução da transmissão e menosdoenças 1,4,5. O sistema de unidade genética copia a si mesmo e o traço associado de um cromossomo homólogo para outro nas células germinativas pré-meiotic, e isso garante que a maioria dos descendentes herdem o impulso e criem o potencial de modificação populacional duradoura e sustentável no campo. No entanto, uma desvantagem dos métodos baseados em Cas/gRNA é a possibilidade de gerar mutações de inserção e exclusão (indel) através de reparos de DNA não homólogos (NHEJ), resultando na geração de alelos resistentes a unidade, que quando acumulados a uma frequência alta o suficiente na população, podem impedir que o sistema de acionamento se espalhe1,2,3,4 . Este protocolo detalha um método de alto rendimento e confiável que pode determinar a prevalência e a quantidade relativa de mutações indel, tanto no nível populacional quanto individual, durante a unidade genética baseada em Cas/gRNA.
Os métodos de sequenciamento de próxima geração (NGS) fornecem resolução de sequenciamento incomparável. No entanto, os requisitos de custo e técnico associados ao NGS proíbem testes de rotina e limitam seu uso como método de alto rendimento para avaliar os indels6,7,8. Os métodos tradicionais de quantificação do PCR têm sido usados há muito tempo como procedimento de avaliação padrão para indels genoma; no entanto, esses métodos são intensivos em mão-de-obra, levam muito tempo para obter dados e têm um alto grau de variabilidade. O DIGITAL-Droplet PCR (ddPCR) tem se mostrado mais sensível na detecção de mutações do que o sequenciamento Sanger em algumas aplicações e tem um limite de detecção menor do que o NGS em outros6,7,8,9. Além disso, o custo para avaliar um conjunto amostral e tempo de retorno para a obtenção de resultados é menos caro e mais rápido, respectivamente, para ddPCR do que tanto o sequenciamento Sanger quanto o NGS9. Usando um sistema de sonda dupla, o ensaio Drop-Off identifica alelos NHEJ com base na ausência de sequência de tipo selvagem (WT) no local de corte Cas9 direcionado por gRNA. Neste ensaio, uma amplicon curta, incluindo o local de corte previsto do sistema baseado em Cas/gRNA, é amplificada com um par de primer específico. Uma sonda fluorescente foi projetada para se ligar a uma região conservada do amplicon e outra sonda fluorescente reconhece a sequência WT do local do corte. Na presença de um alelo NHEJ, este último não se ligará ao amplicon.
O uso do ddPCR fornece a capacidade de projetar primers para exclusões de alvo, diferenças e inserções de par de base única, o que permitirá o perfil NHEJ nas análises populacionais de mosquitos9. Dadas essas características atraentes, criamos um protocolo para ddPCR para detecção de indels de alto rendimento gerado a partir de um sistema de acionamento genético baseado em Cas/gRNA em mosquitos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR-grade Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any certified PCR-grade water can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K 20 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward and Reverse oligonucleotide primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital-droplet pcr to detect indels mutations in genetically modified anopheline mosquito populations

Os recentes avanços na genômica de mosquitos e tecnologias de engenharia genética têm fomentado a necessidade de métodos rápidos e eficientes para detectar a variação da sequência de DNA direcionada em larga escala. Especificamente, detectar inserções e exclusões (indels) em sites editados por genes gerados pelo guia CRISPR RNA (gRNA)/Cas9-mediado não-homólogo (NHEJ) é importante para avaliar a fidelidade da mutagênese e a frequência de alterações não intencionais. Descrevemos aqui um protocolo para PCR de gotícula digital (ddPCR) que é adequado para análise nhej de alto rendimento. Embora este método não produza dados que identifiquem a variação da sequência individual, ele fornece uma estimativa quantitativa da variação sequencial dentro de uma população. Além disso, com os recursos apropriados, este protocolo pode ser implementado em um laboratório de campo mais facilmente do que a próxima geração ou sequenciamento Sanger. O ddPCR também tem um tempo de retorno mais rápido para resultados do que qualquer um desses métodos, o que permite uma análise mais rápida e completa da variação genética em populações selvagens durante testes de campo de organismos geneticamente modificados.

Uma aplicação deste procedimento aparece em Carballar-Lejarazú et al.9. O ensaio ddPCR Drop-off utiliza duas sondas fluorescentes para discernir sequências WT e indel: Uma sonda FAM se liga a uma sequência conservada dentro do amplicon, enquanto a sonda HEX tem como alvo a sequência WT do local alvo(Figura 4A). Na presença de um indel, a sonda HEX não se ligará. Os resultados representativos podem ser encontrados na Figura 2, Tabela 1 e Tabela 2 de Carballar-Lejarazú et al.9. Usando este protocolo, foi comprovado que o ddPCR detectou uma grande variedade de eventos NHEJ induzidos pelo CRISPR-Cas9 e quantifica a frequência NHEJ em uma amostra individual ou agrupada. Quinze amostras diferentes de 10 mosquitos cada continham vários alelos NHEJ (Tabela 2 de Carballar-Lejarazú et al.9). Estes foram analisados com ddPCR utilizando o protocolo e parâmetros aqui apresentados. Os resultados da Tabela19 mostram que todas as 15 amostras carregaram alelos 100% indelés identificados pelo ensaio de entrega(Figura 4B). Em outro experimento, foram examinadas 11 amostras de mosquitos WT e mosquitos NHEJ com diferentes percentuais NHEJ (0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100%) e os resultados (Figura 2; Carballar- Lejarazú et al.9) mostraram que o percentual identificado está próximo da técnica comparada de Indel Detection by Amplicon Analysis(Figura 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig01.jpg"> Figura 1: Configuração experimental e procedimento. (A) Preparação do cartucho para a geração droplet. (Topo) As amostras são preenchidas na linha do meio do cartucho, enquanto o óleo é preenchido na linha inferior. (Inferior) Primeira fila cheia de gotículas emulsificadas após a geração de gotículas. (B) Gerador de gotícula com um cartucho cheio de amostra e coberto por uma junta no lugar. (C) placa de 96 poços coberta com vedação de papel alumínio em um Termociclador. (D) Leitor de gotas com 96-bem-placa no lugar com uma tampa de metal preso sobre a placa para fixá-lo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig02.jpg"> Figura 2: Leitura de gotícula. (A) Interface de software para leitura de gotícula. Caixas laranjas mostram poços com amostras. Caixas cinzas são poços vazios. Os parâmetros experimentais são configurados no painel Editar ferramentas (lado direito). Cada amostra pode ser editada clicando na respectiva caixa de amostra. Selecione Drop Off (DOF) para tipo experimental. Nas informações da amostra, preencha as informações apropriadas para o Nome e Tipoda amostra, bem como o SuperMix. Escolha o drop-off básico para as informações de ensaio. Para a amostra WT, escolha WT para o Nome de Destino, Ref para Tipo de Alvo, e tanto FAM quanto HEX para Signal Ch1 e Ch2, respectivamente. Para amostras de NHEJ, preencha o nome apropriado para o Nome de Destino,escolha Desconhecido para o Tipo de Destinoe escolha FAM para Signal Ch1. Deixe o Sinal Ch2 em Nenhum. (B) Resultados da contagem de gotículas para várias amostras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig03.jpg"> Figura 3: Análise do ensaio de entrega. (A) Gráfico de cluster 2D para a contagem de gotículas dos alelos WT e NHEJ. Na guia Amplitude 2D, todas as gotículas não são classificadas por padrão. Nesta figura, as cores são atribuídas manualmente para distinguir. O cluster de pontos laranjas são contagens de alelo WT obtidas pela vinculação tanto das sondas FAM quanto HEX na sequência de referência e sequência do local de destino, respectivamente. Os pontos azuis representam dezenas de gotículas que têm ligação FAM à sequência de referência, mas nenhuma vinculação HEX na sequência do local de destino (portanto, a entrega do HEX). Pontos cinzentos são gotículas vazias que não têm nem ligação FAM ou HEX. (B) Gráficos de proporção/abundância de eventos NHEJ. Na guia Proporção, selecione Abundância Fracionada para um gráfico com a porcentagem correspondente de eventos NHEJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig04.jpg"> Figura 4: Aplicação de ensaio de drop-off com ddPCR para identificação e quantificação final não homólogo na linha Anopheles stephensi transgênica, AsMCRkh1. (A) Apresentação esquemática do ensaio ddPCR Drop-Off para detectar mutações em um local de DNA direcionado com um sistema de dupla sonda. Uma amplicon de 150-400 bp é amplificada com os primers dianteiros e invertidos. Uma sonda com etiqueta FAM foi projetada para se ligar a uma sequência conservada do amplicon, enquanto uma sonda com etiqueta HEX foi projetada para se ligar ao local alvo do WT gRNA. (B) Detecção de vários tipos de indels com ddPCR. Quinze piscinas de 10 mosquitos AsMCRkh1 cada um contendo vários tipos de indel, incluindo inserção, exclusão e substituição, foram analisados com o ensaio ddPCR Drop-Off. Detalhes de mutações e sequências podem ser encontrados na Tabela 2 e Tabela S3 de Carballar et al. 9. (C) Quantificação de NHEJ em amostras mistas de mosquitos AsMCRkh1 e WT com várias razões (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 e 0:10) utilizando ddPCR e uma técnica comparada de Indel Detection by Amplicon Analysis9. Imagens adaptadas de Carballar-Lejarazú et al. Biotechniques. 68(4):172-179 (2020)9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer/Sonda</td>
			<td>Sequência (5' » 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR Forward Primer</td>
			<td>ATGATCAAATGTCGACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>primer reverso ddPCR</td>
			<td>ACCGTACTGGTTGAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>sonda DdPCR HEX (BHQ1)</td>
			<td>[HEX]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR FAM Probe (BHQ1)</td>
			<td>[6FAM]-CCACGTGGGATCGAAGG-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HEX: Hexachloro-fluoresceína, FAM: 6-carboxyfluoresceína, BHQ: Black Hole Quencher</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Sequências de primers e sondas.

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Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Este protocolo fornece os passos desde a extração de DNA até a configuração experimental para PCR de gotícula digital (ddPCR), incluindo análise para identificação e quantificação de eventos não homólogos de junção final (NHEJ) em locais-alvo após o decote Cas9 induzido pelo GRNA e reparação de DNA. Outros usos deste método incluem aplicações como detecção de polimorfismo e verificação de variantes de edição de genes.

PCR de gotícula digital para detectar mutações indelés em populações de mosquitos anofelinos geneticamente modificados

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

Este protocolo fornece uma alta produção e uma composição confiável para a análise NHEJ que pode determinar a prevalência e quantidade relativa de mutações indel em populações de mosquitos editadas por genes. Comparado com a próxima geração, ou sequenciamento Sanger, o DDPCR tem um tempo de reviravolta mais rápido para resultados, o que permite uma análise rápida e completa da variação genética para o campo para organismos geneticamente modificados. Este método deve ser geralmente aplicável a todos os sistemas experimentais.Demonstrando o procedimento estará Thai Pham, um pesquisador da equipe do laboratório de Yang. Para começar, prepare 25 microlitros da gotícula digital PCR, ou mistura de amostras ddPCR adicionando super mix ddPCR, primers avançados e reversos, sondas HEX ou FAM, DNA e água nas proporções descritas no texto. Em seguida, misture completamente a reação com vórtice.Usando uma pipeta multicanal de 50 microlitrais, carregue 20 microliters da amostra ddPCR na linha média do cartucho. Em seguida, use uma pipeta multicanal de 200 microlitrais para carregar 70 microliters do óleo na linha inferior sem gerar bolhas em toda a tubulação. Coloque a junta, tocando apenas as bordas, evitando o centro, área concavizada, e, em seguida, coloque a placa com segurança no gerador de gotículas e feche a tampa para iniciar a corrida.Para transferir a mistura de imersão da linha superior do cartucho para a placa de 96 poços, use uma pipeta multicanal e solte 40 microliters de amostra líquida por três a cinco segundos em um ângulo de 30 a 45 graus. Em seguida, expulse a mistura para o poço lentamente por mais de três segundos em um ângulo de 45 graus, permitindo que ela caia do lado, e depois vá para a segunda parada da pipeta para expulsar o líquido completamente. Usando vedações de calor de folha, sele as placas por cinco segundos a 180 graus celsius.Coloque a placa selada no termociclador e ajuste as condições de PCR para as diretrizes de queda do NHEJ, definindo a desnaturação inicial a 95 graus celsius por 10 minutos. Em seguida, defina 40 ciclos de 94 graus celsius por 30 segundos para a desnaturação, 55 graus celsius de um minuto para anneal, e 60 graus celsius por dois minutos para se estender. Após 40 ciclos, mantenha-se a 98 graus celsius por 10 minutos, e a espera final a quatro graus celsius.Use uma taxa de rampa de dois graus celsius por segundo para todas as etapas. A temperatura de ressarção varia, de acordo com as sondas ou primer utilizados. Coloque a placa com segurança no leitor de gotas com o A1 bem rotulado no canto superior esquerdo.Abra o programa e configure a placa designando o FAM como o canal de referência conhecido, e HEX como o desconhecido para cada poço. Em seguida, mude o nome para cada amostra. Execute o experimento de leitura de gotículas como quantificação direta enquanto salva o modelo.Designe os parâmetros experimentais corretos para análise de software, ou seja, informações de amostra, super mix, nome do alvo, tipo de destino, canal de sinal um e canal dois. Em seguida, defina o limite para contagem de gotículas acima de 10.000 para resultados confiáveis. Em seguida, verifique a contagem de gotículas para cada poço na aba gotícula, garantindo que todos estejam acima de 10.000.Por fim, verifique a amplitude 1D para obter uma separação eficiente do sinal dos negativos. No editor da placa, destaque toda a placa e defina o tipo de experimento para cair. Defina o alvo WT como referência, designando o canal um para fam e o canal dois para HEX.Defina o alvo NHEJ como desconhecido, designando o canal um para fam e o canal dois como nenhum. Na guia de amplitude 2D, defina os limiares de cluster com as ferramentas de gráfico para cada amostra. A cauda é normalmente associada com o cluster WT para ensaios NHEJ.Na guia de proporção, clique no ícone de engrenagem do canto superior direito do gráfico e selecione a abundância fracionária para traçar um ponto correspondente à porcentagem de eventos NHEJ. 15 diferentes amostras puxadas de 10 mosquitos cada continham vários alelos NHEJ, foram analisados e identificados utilizando o ensaio de queda, e os resultados mostraram que todas as 15 amostras carregavam 100% de alelos indel. Em outro experimento, 11 amostras retiradas de mosquitos do tipo selvagem e mosquitos NHEJ com diferentes percentuais NHEJ foram examinadas com este protocolo ddPCR.Os resultados mostraram que o percentual identificado foi relativamente próximo à detecção de Indel pela técnica de análise de amplicon. Pipeta lentamente para evitar bolhas, e permitir que todas as gotículas emulsificadas escorressem pela parede dos poços.

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