Name: digital-droplet pcr to detect indels mutations in genetically modified anopheline mosquito populations
Uploaded: 2021-06-28T14:00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations at JoVE.com

La financiación fue proporcionada por la Iniciativa de Malaria irvine de la Universidad de California. AAJ es profesor Donald Bren en la Universidad de California, Irvine.

1. Extracción de ADN
<ol><li>Preparar EDTA/Nuclei Lysis Buffer (EDTA/NLS) con la proporción de 500 μL de NLS y 120 μL de EDTA por muestra. Escalado vertical para múltiples muestras. Enfriar la mezcla sobre hielo. NOTA: La solución se volverá turbia en 2-5 minutos cuando se enfríe dependiendo del volumen.</li>
	<li>Homogeneizar la muestra de mosquito utilizando un homogeneizador mecánico para 10-15 s en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml lleno de 600 μL de EDTA/NLS refrigerado; Homogeneizar.</li>
	<li>Añadir 17,5 μL de 20 mg/ml de proteinasa K al tubo y mezclar bien.</li>
	<li>Incubar durante la noche a 55 °C. Alternativamente, incubar la muestra a 55 °C durante 3 h con agitación y vórtice la muestra cada 1 h.</li>
	<li>Agregue 200 μL de solución de precipitación de proteínas a la muestra a temperatura ambiente y vórtice vigorosamente durante 20 s.</li>
	<li>Enfriar la muestra durante 5 min sobre hielo.</li>
	<li>Centrifugar la muestra para gletizar proteínas a 15.890 RCF durante 4 min.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente el sobrenadante que contiene el ADN y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml que contenga 600 μL de isopropanol.</li>
	<li>Mezcle suavemente la solución invirtiendo el tubo 5-10 veces. Centrifugación durante 1 min a 15.890 RCF. Decanta cuidadosamente el sobrenadante mientras preserva el gránulo de ADN.</li>
	<li>Añadir 600 μL de etanol al 70% a temperatura ambiente. Lave el ADN peletizado invirtiendo suavemente el tubo.</li>
	<li>Centrifugación durante 1 min a 15.890 RCF. Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración con una punta de pipeta de vidrio.</li>
	<li>Invierta el tubo sobre papel absorbente limpio y seque al aire el pellet durante 10-15 min.</li>
	<li>Resuspend el ADN con agua de grado PCR. Use 20 μL por muestra individual de mosquito o 100 μL para 10 mosquitos agrupados. NOTA: Los métodos de extracción de ADN para muestras de mosquitos utilizando un kit disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales)se adaptan del protocolo del fabricante Aislar ADN genómico de células de cultivo de tejidos y tejidos animales.</li>
</ol>2. reacciones de ddPCR y preparación de la generación de gotas
<ol><li>Cuantificar el ADN usando un fluorómetro. NOTA: Para el ensayo de caída, se recomienda utilizar un rango de 3,000-30,000 copias del genoma haploide por reacción, que está diseñado para detectar eventos NHEJ con una sonda de etiquetado HEX que se une a una secuencia WT del sitio de corte objetivo y no se recocido (caída) si hay una deleción o inserción en el sitio objetivo, indicando la presencia de una variante nhej.</li>
	<li>Calcule el número de copias utilizando el peso del genoma haploide y la concentración de ADN en el extracto. Esto se hace multiplicando la concentración del ADN extraído por el volumen utilizado para obtener la masa total de ADN, luego dividiéndola por el peso del genoma haploide. Asegúrese de que el volumen agregado esté entre 1-10 μL. Diluya según sea necesario para estar en el rango de copia del genoma haploide recomendado. NOTA: Un genoma haploide de Anopheles gambiae se estima en 0,27 pg por mosquito adulto10.</li>
	<li>Diseñar imprimaciones y sondas. Diseñe cebadores de oligonucleótidos hacia adelante y hacia atrás con una temperatura de fusión de imprimación (Tm) en el rango de 55-60 ° C que flanqueen los extremos 5 'y 3'- del sitio objetivo de gRNA produciendo un amplicón de 150-400 pb.<ol>
<li>Sonda marcada con HEX (Hexacloro-fluoresceína) para la detección de NHEJ: Diseñe un oligonucleótido de ~ 15-20 pb de longitud complementaria al sitio objetivo y agregue la sonda HEX al extremo 5'y BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) al extremo 3'. La Tm de la sonda de hidrólisis debe ser 3-10 °C más alta que la Tm de los cebadores.</li>
		<li>Sonda marcada con FAM (6-carboxifluoresceína) para referencia WT: Diseñe un oligonucleótido de ~ 15-20 pb de longitud complementaria a un sitio del genoma conservado distante (aproximadamente 25 pb) del sitio objetivo y agregue la sonda FAM al extremo 5'-end y BHQ1 al extremo 3'. La Tm de la sonda de hidrólisis debe ser 3-10 °C más alta que la Tm de los cebadores.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparación de la reacción de PCR
<ol><li>Preparar 25 μL de la mezcla de muestras ddPCR con los siguientes componentes: supermezcla ddPCR para sondas (sin UTP): 12,5 μL, cebadores delanteros e inversos (10 μM): 1 μL cada uno, sondas HEX/FAM (10 μM): 0,625 μL cada una, ADN: 1-5 μL (3.750-37.500 copias del genoma haploide) y agua: hasta 25 μL.</li>
	<li>Mezcle bien las reacciones mediante vórtice o pipeteo por reflujo (arriba y abajo) (20x). NOTA: Si las reacciones están en una placa de 96 pocillos, pipetee todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 20 veces en lugar de vórtice para evitar la formación de burbujas.</li>
	<li>Centrifugar brevemente las muestras para asentar la mezcla en el fondo del tubo o pozo. NOTA: Asegúrese de que las reacciones estén a temperatura ambiente para la generación de gotas. Prepare 1x de mezcla ddPCR para pocillos adicionales/ no utilizados en cada cartucho (cada cartucho tiene 8 pocillos).</li>
</ol>4. Generación de gotas
<ol><li>Utilizando una pipeta multicanal de 50 μL, cargue 20 μL de la mezcla de muestras ddPCR en la fila central del cartucho(Figura 1A,arriba).</li>
	<li>Cargue 70 μL del aceite en la fila inferior. Cargue 20 μL de supermezcla 1x ddPCR en pozos no utilizados. NOTA: No introduzca burbujas.</li>
	<li>Coloque la junta tocando solo los bordes, evitando el área cóncava central (Figura 1B).</li>
	<li>Coloque la placa de forma segura en el generador de gotas y cierre la tapa para iniciar la ejecución.</li>
	<li>Usando la pipeta multicanal, transfiera 40 μL de la mezcla de emersión desde la fila superior del cartucho(Figura 1A,abajo) a la placa de 96 pocillos.<ol>
<li>Extraiga la muestra líquida durante 3-5 s en un ángulo de 45-30°. Expulse la mezcla lentamente durante más de 3 s en un ángulo de 45 ° en el lado del pozo, lo que permite que gotee por el lado. Está bien ir a la segunda parada (expulsión completa) de la pipeta para expulsar todo el líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando sellos térmicos de lámina, selle las placas durante 5 s a 180 °C.</li>
</ol>5. PCR
<ol><li>Coloque la placa sellada en el termociclador(Figura 1C)y establezca las condiciones de PCR recomendadas si sigue las pautas de entrega de NHEJ de la siguiente manera:<ol>
<li>Desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 min.</li>
		<li>Establezca 40 ciclos de 94 °C durante 30 s para desnaturalizar, 55 °C para 1 min para anneal y 60 °C para 2 min para extender.</li>
		<li>Mantener a 98 °C durante 10 min.</li>
		<li>Mantener a 4 °C. NOTA: La temperatura de recocido para cebadores y conjuntos de sondas específicos puede optimizarse utilizando un gradiente térmico. Utilice una velocidad de rampa de 2 °C/s para todos los pasos. Las condiciones de PCR deben ajustarse en función de cada diseño experimental y configuración.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Lectura de gotas
<ol><li>Coloque la placa de forma segura en el lector de gotas con el pozo A-1 en la parte superior izquierda (esquina suavizada, las otras tres están bordeadas) (Figura 1D).</li>
	<li>Configurar la placa en el programa: Designar FAM como el canal de referencia conocido y HEX como el desconocido (Figura 2A).</li>
	<li>Ejecute el experimento de lectura Droplet como cuantificación directa. Una vez finalizada la ejecución, cambie el tipo de experimento a Drop-Off (DOF) para el análisis (Figura 2A).</li>
</ol>7. Análisis
<ol><li>Designe los parámetros experimentales correctos (Figura 2A): Información de muestra, SuperMix, Nombre del objetivo (WT o NHEJ), Tipo de objetivo (Ref o Desconocido), Señal Ch1 (HEX o FAM), Señal Ch2 (HEX o FAM), y establezca manualmente el umbral para el recuento de gotas (se recomienda por encima de 10,000 para obtener resultados confiables). El software realizará la mayor parte del análisis con el parámetro designado.</li>
	<li>Compruebe el recuento de gotas en la pestaña Droplet; asegúrese de que todos estén por encima de 10.000 (Figura 2B).</li>
	<li>Compruebe la amplitud 1 D para una separación eficiente de la señal de los negativos.</li>
	<li>En el Editor de placas,resalte toda la placa y establezca el Tipo de experimento en Dejar.</li>
	<li>Establezca el objetivo WT como referencia,designando el canal uno para FAM y el canal dos para HEX.</li>
	<li>Establezca el objetivo NHEJ como desconocido, designando el canal uno para FAM y el canal dos como ninguno.</li>
	<li>En la ficha Amplitud 2D, establezca los umbrales de clúster con las herramientas de gráfico para cada muestra. Considere la cola asociada con el clúster WT; esto es normal para los ensayos NHEJ(Figura 3A). NOTA: En la pestaña Ratio, haga clic en el icono de engranaje en la parte superior derecha del gráfico. Seleccione la abundancia fraccionaria. El gráfico ahora trazará un punto correspondiente al porcentaje de eventos NHEJ(Figura 3B).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li><li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae.">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).</li><li>Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Bo&#235;te, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agricultural+pest+control+with+CRISPR-based+gene+drive:+time+for+public+debate:+Should+we+use+gene+drive+for+pest+control.">Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control.</a> EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11, 5553 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+and+direct+Sanger+sequencing+for+the+detection+of+the+BRAFV600E+mutation+in+papillary+thyroid+carcinoma.">Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902 (2019).</li><li>Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+droplet+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+characterizing+DNA+reference+material+for+KRAS+mutation+detection.">Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9650 (2018).</li><li>Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+strategy+for+detecting+CRISPR_Cas9+induced+mutations+using+next-generation+sequencing.">A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 15 (1), 1002 (2014).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+droplet+PCR+and+IDAA+for+the+detection+of+CRISPR+indel+edits+in+the+malaria+species+Anopheles+stephensi.">Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi.</a> Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).</li><li>Holt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298 (5591), 129-149 (2002).</li></ol>

Los autores no tienen revelaciones.

La PCR de gotas digitales es un método eficiente para determinar la presencia de alelos indel resultantes de eventos NHEJ en un sistema de impulsor genético basado en Cas/gRNA y permite cuantificar la frecuencia de estos alelos en individuos o poblaciones. Algunos pasos del protocolo deben seguirse con especial cuidado para lograr resultados confiables. En primer lugar, la extracción de ADN genómico debe realizarse con cuidado para garantizar una alta calidad y una cantidad suficiente. Una buena extracción permitirá la determinación precisa de las copias del genoma haploide por reacción. En nuestra experiencia, un kit disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales)proporcionó consistentemente extracciones de ADN de alta calidad. Sin embargo, las extracciones de mosquitos individuales pueden resultar particularmente desafiantes ya que el gránulo de ADN se vuelve difícil de visualizar y puede ser fácilmente absorbido con el sobrenadante si no se tiene cuidado. En segundo lugar, las imprimaciones y sondas deben diseñarse cuidadosamente. Antes de completar el experimento ddPCR, asegúrese de que los cebadores diseñados den como resultado un solo producto de PCR realizando primero una PCR tradicional y visualizando un solo producto a través de la electroforesis en gel. La sonda FAM de referencia también debe diseñarse de manera que sea complementaria a una secuencia altamente conservada. Esto garantizará detecciones precisas de alelos WT en una población diversa. Las combinaciones de imprimación / sonda para cada experimento único tendrán diferentes condiciones de termociclador, y se recomienda optimizar esas condiciones utilizando un gradiente térmico.
Existen otros métodos para identificar indels, como la secuenciación de Sanger o NGS. La secuenciación de Sanger es limitada porque tiene un límite inferior de detección y un bajo poder de descubrimiento para identificar nuevas variantes. La secuenciación de Sanger también requiere mucha mano de obra y no es de alto rendimiento. En comparación con la secuenciación de Sanger, NGS no tiene las mismas limitaciones de baja sensibilidad, poder de descubrimiento y rendimiento. Otro beneficio de NGS es su capacidad para detectar una variedad de mutaciones, desde el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) hasta los reordenamientos. Sin embargo, NGS es un método más costoso y lento en la aplicación de la determinación de indels asociados a Cas9 / gRNA porque solo hay una región objetivo de interés, y es más adecuado para análisis más grandes de todo el genoma. En comparación con los métodos mencionados anteriormente, ddPCR es de alto rendimiento y tiene un tiempo de respuesta rápido. Si los materiales e instrumentos de ddPCR están disponibles internamente, se pueden procesar 96 muestras en 1-2 días, lo que lo hace muy adecuado para el análisis rápido de grandes ensayos de organismos modificados con Cas9 / gRNA.
Si bien existen muchos beneficios para ddPCR, también existen limitaciones. En primer lugar, el equipo ddPCR no está frecuentemente disponible en un entorno de laboratorio independiente. El equipo de ddPCR puede estar disponible comunitariamente en instituciones de investigación más grandes, pero esto no permite facilitar la generación y el análisis de datos fuera de la institución. En segundo lugar, a diferencia de las alternativas, ddPCR no proporciona las secuencias únicas individuales de mutaciones indel identificadas. La PCR de gotas digitales proporcionará la frecuencia de mutaciones indel dentro de una población, pero sin la secuencia, no se puede determinar si los indels presentes tienen más probabilidades de conservar o inhibir la función del gen de interés. El método ddPCR es quizás el más adecuado para analizar poblaciones silvestres después de un ensayo de liberación de campo de un organismo impulsor basado en Cas9 / gRNA porque puede determinar de manera eficiente la frecuencia de introducción del transgén en la población nativa y la generación de indels dentro de la población casi en tiempo real. Debido al rápido tiempo de respuesta de ddPCR, sería factible realizar muestreos y analizar semanalmente la población en una región de prueba de campo si los materiales estuvieran disponibles localmente. Los costos iniciales para comprar, importar y configurar el equipo ddPCR serían altos en laboratorios remotos, pero los beneficios de poder evaluar rigurosamente una población silvestre, ya que está siendo modificada desde un sistema de accionamiento justificarían los costos.

Los impulsores genéticos tienen un inmenso potencial para controlar las poblaciones de insectos de relevancia médica y agrícola1,2,3,4,5. Por ejemplo, los sistemas de impulsores genéticos basados en nucleasas CRISPR Cas y ARN guía (ARNg) se pueden utilizar para modificar las poblaciones de mosquitos vectores mediante la introducción de rasgos que confieren refractariedad a los parásitos de la malaria que conducen a una transmisión reducida y menos enfermedades1,4,5. El sistema de impulsor genético se copia a sí mismo y al rasgo asociado de un cromosoma homólogo a otro en las células germinales premeióticas, y esto asegura que la mayoría de la descendencia herede el impulso y cree el potencial para una modificación de la población duradera y sostenible en el campo. Sin embargo, una desventaja de los métodos basados en Cas/gRNA es la posibilidad de generar mutaciones de inserción y deleción (indel) a través de la reparación del ADN de unión final no homóloga (NHEJ), lo que resulta en la generación de alelos resistentes a la unidad, que cuando se acumulan a una frecuencia lo suficientemente alta en la población, pueden evitar que el sistema de accionamiento se propague1,2,3,4 . Este protocolo detalla un método confiable y de alto rendimiento que puede determinar la prevalencia y la cantidad relativa de mutaciones indel, tanto a nivel poblacional como individual, durante el impulso genético basado en Cas / gRNA.
Los métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) proporcionan una resolución de secuenciación sin precedentes. Sin embargo, el costo y los requisitos técnicos asociados con NGS prohíben las pruebas de rutina y limitan su uso como un método de alto rendimiento para evaluar los indels6,7,8. Los métodos tradicionales de cuantificación por PCR se han utilizado durante mucho tiempo como el procedimiento de evaluación estándar para los indels del genoma; sin embargo, estos métodos requieren mucha mano de obra, tardan mucho tiempo en obtener datos y tienen un alto grado de variabilidad. Se ha demostrado que la PCR digital-droplet (ddPCR) es más sensible a la detección de mutaciones que la secuenciación de Sanger en algunas aplicaciones y tiene un límite de detección más bajo que NGS en otras6,7,8,9. Además, el costo de evaluar un conjunto de muestras y el tiempo de respuesta para obtener resultados es menos costoso y más rápido, respectivamente, para ddPCR que la secuenciación de Sanger o NGS9. Utilizando un sistema de doble sonda, el ensayo Drop-Off identifica los alelos NHEJ en función de la ausencia de secuencia de tipo salvaje (WT) en el sitio de corte Cas9 del objetivo dirigido por gRNA. En este ensayo, un amplicón corto que incluye el sitio de corte predicho del sistema basado en Cas / gRNA se amplifica con un par de cebadores específicos. Una sonda fluorescente está diseñada para unirse a una región conservada del amplicón y otra sonda fluorescente reconoce la secuencia WT del sitio de corte. En presencia de un alelo NHEJ, este último no se unirá al amplicón.
El uso de ddPCR proporciona la capacidad de diseñar cebadores para apuntar a deleciones, diferencias de par de bases individuales e inserciones, lo que permitirá el perfil de NHEJ en análisis de población de mosquitos9. Dadas estas características atractivas, creamos un protocolo para ddPCR para la detección de alto rendimiento de indels generados a partir de un sistema de impulsor genético basado en Cas / gRNA en mosquitos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR-grade Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any certified PCR-grade water can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K 20 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward and Reverse oligonucleotide primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital-droplet pcr to detect indels mutations in genetically modified anopheline mosquito populations

Los recientes avances en genómica de mosquitos y tecnologías de ingeniería genética han fomentado la necesidad de métodos rápidos y eficientes para detectar la variación de la secuencia de ADN dirigida a gran escala. Específicamente, la detección de inserciones y deleciones (indels) en sitios editados genéticamente generados por CRISPR guía RNA (gRNA) / Cas9-mediated non-homologous end-joining (NHEJ) es importante para evaluar la fidelidad de la mutagénesis y la frecuencia de cambios no deseados. Describimos aquí un protocolo para PCR de gotas digitales (ddPCR) que es muy adecuado para el análisis NHEJ de alto rendimiento. Si bien este método no produce datos que identifiquen la variación de secuencia individual, proporciona una estimación cuantitativa de la variación de secuencia dentro de una población. Además, con los recursos adecuados, este protocolo se puede implementar en un entorno de laboratorio de campo más fácilmente que la secuenciación de próxima generación o Sanger. ddPCR también tiene un tiempo de respuesta más rápido para los resultados que cualquiera de esos métodos, lo que permite un análisis más rápido y completo de la variación genética en poblaciones silvestres durante los ensayos de campo de organismos genéticamente modificados.

Una aplicación de este procedimiento aparece en Carballar-Lejarazú et al.9. El ensayo ddPCR Drop-off utiliza dos sondas fluorescentes para discernir secuencias WT e indel: una sonda FAM se une a una secuencia conservada dentro del amplicón, mientras que la sonda HEX se dirige a la secuencia WT del sitio objetivo(Figura 4A). En presencia de un indel, la sonda HEX no se unirá. Los resultados representativos se pueden encontrar en la Figura 2,Tabla 1 y Tabla 2 de Carballar-Lejarazú et al.9. Utilizando este protocolo, se ha demostrado que ddPCR detecta una amplia variedad de eventos NHEJ inducidos por CRISPR-Cas9 y cuantifica la frecuencia de NHEJ en una muestra individual o agrupada. Quince muestras agrupadas diferentes de 10 mosquitos contenían cada una varios alelos NHEJ (Tabla 2 de Carballar-Lejarazú et al.9). Estos fueron analizados con ddPCR utilizando el protocolo y los parámetros aquí presentados. Los resultados de la Tabla1 9 muestran que las 15 muestras portaban alelos 100% indel identificados por el ensayo Drop-off(Figura 4B). En otro experimento, se examinaron 11 muestras agrupadas de mosquitos WT y mosquitos NHEJ con diferentes porcentajes de NHEJ (0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100%) con este protocolo ddPCR, y los resultados (Figura 2; Carballar- Lejarazú et al.9) mostraron que el porcentaje identificado es cercano a la técnica comparada de Detección Indel por Análisis de Amplicon(Figura 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig01.jpg"> Figura 1: Configuración y procedimiento experimental. (A) Preparación de cartuchos para la generación de gotas. (Arriba) Las muestras se llenan en la fila central del cartucho, mientras que el aceite se llena en la fila inferior. (Abajo) Fila superior llena de gotas emulsionadas después de la generación de gotas. (B) Generador de gotas con un cartucho lleno de muestra y cubierto por una junta en su lugar. (C) Placa de 96 pocillos cubierta con sello de lámina en un termociclador. (D) Lector de gotas con placa de 96 pozos en su lugar con una cubierta de metal enganchada sobre la placa para asegurarla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig02.jpg"> Figura 2: Lectura de gotas. (A) Interfaz de software para la lectura de gotas. Las cajas naranjas muestran pozos con muestras. Las cajas grises son pozos vacíos. Los parámetros experimentales se configuran en el panel Editar herramientas (lado derecho). Cada muestra se puede editar haciendo clic en el cuadro de muestra respectivo. Seleccione Drop Off (DOF) para Tipo experimental. En la información de la muestra, rellene la información adecuada para el Nombre y tipode la muestra, así como SuperMix. Elija la Entrega básica para la información del ensayo. Para el ejemplo WT, elija WT para el nombre de destino, Ref para tipo de destinoy FAM y HEX para Signal Ch1 y Ch2, respectivamente. Para las muestras de NHEJ, rellene el nombre apropiado para el nombre de destino, elija Desconocido para el tipo de destinoy elija FAM para Señal Ch1. Deje signal ch2 en ninguno. (B) Resultados del recuento de gotas para múltiples muestras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig03.jpg"> Figura 3: Análisis de ensayo de entrega. (A) Diagrama de racimo 2D para el recuento de gotas de los alelos WT y NHEJ. En la pestaña Amplitud 2D, todas las gotas no están clasificadas de forma predeterminada. En esta figura, los colores se asignan manualmente para distinguir. El clúster de puntos naranjas son recuentos de alelos WT obtenidos mediante la unión de sondas FAM y HEX en la secuencia de referencia y la secuencia del sitio objetivo, respectivamente. Los puntos azules representan decenas de gotas que tienen unión FAM a la secuencia de referencia, pero no unión HEX en la secuencia del sitio de destino (por lo tanto, la caída de HEX). Los puntos grises son gotas vacías que no tienen enlace FAM o HEX. (B) Gráficos de relación/abundancia de eventos NHEJ. En la pestaña Ratio, seleccione Abundancia fraccionaria para obtener un gráfico con el porcentaje correspondiente de eventos NHEJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig04.jpg"> Figura 4: Aplicación del ensayo Drop-Off con ddPCR para la identificación y cuantificación de la unión final no homóloga en la línea transgénica Anopheles stephensi, AsMCRkh1. (A) Presentación esquemática del ensayo ddPCR Drop-Off para detectar mutaciones en un sitio de ADN dirigido con un sistema de doble sonda. Un amplicón de 150-400 pb se amplifica con los cebadores hacia adelante y hacia atrás. Una sonda marcada con FAM está diseñada para unirse a una secuencia conservada del amplicón, mientras que una sonda con etiqueta HEX está diseñada para unirse al sitio objetivo de WT gRNA. (B) Detección de varios tipos de indels con ddPCR. Quince grupos de 10 mosquitos AsMCRkh1 cada uno que contenía varios tipos de indel, incluyendo inserción, deleción y sustitución, se analizaron con el ensayo ddPCR Drop-Off. Los detalles de las mutaciones y secuencias se pueden encontrar en la Tabla 2 y la Tabla S3 de Carballar et al. 9. (C) Cuantificación de NHEJ en muestras mixtas de mosquitos AsMCRkh1 y WT con varias proporciones (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 y 0:10) utilizando ddPCR y una técnica comparada de detección Indel por análisis de amplicon9. Imágenes adaptadas de Carballar-Lejarazú et al. Biotechniques. 68(4):172-179 (2020)9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Imprimación/sonda</td>
			<td>Secuencia (5' » 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imprimación delantera ddPCR</td>
			<td>ATGATCAAATGTCGACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imprimación inversa ddPCR</td>
			<td>ACCGTACTGGTTGAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonda ddPCR HEX (BHQ1)</td>
			<td>[HEX]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonda ddPCR FAM (BHQ1)</td>
			<td>[6FAM]-CCACGTGGGATCGAAGG-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HEX: Hexacloro-fluoresceína, FAM: 6-carboxifluoresceína, BHQ: Black Hole Quencher</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Secuencias de cebadores y sondas.

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Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Este protocolo proporciona los pasos desde la extracción de ADN hasta la configuración experimental para la PCR digital de gotas (ddPCR), incluido el análisis para la identificación y cuantificación de eventos de unión final no homólogos (NHEJ) en sitios objetivo después de la escisión Cas9 inducida por gRNA y la reparación del ADN. Otros usos de este método incluyen aplicaciones como la detección de polimorfismo y la verificación de variantes de edición de genes.

PCR de gotas digitales para detectar mutaciones de Indels en poblaciones de mosquitos anofelinos modificados genéticamente

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

Este protocolo proporciona un alto rendimiento y una composición confiable para el análisis de NHEJ que puede determinar la prevalencia y la cantidad relativa de mutaciones de Indel en poblaciones de mosquitos editados genéticamente. En comparación con la próxima generación, o secuenciación de Sanger, ddPCR tiene un tiempo de respuesta más rápido para los resultados, lo que permite un análisis rápido y completo de la variación genética en el campo para organismos genéticamente modificados. Este método debe ser generalmente aplicable a todos los sistemas experimentales.La demostración del procedimiento será Thai Pham, un investigador asociado del personal del laboratorio de Yang. Para empezar, prepare 25 microlitros de la PCR de gota digital, o mezcla de muestras de ddPCR agregando súper mezcla de ddPCR, imprimaciones hacia adelante y hacia atrás, sondas HEX o FAM, ADN y agua en las proporciones descritas en el texto. Luego mezcle bien la reacción mediante vórtice.Usando una pipeta multicanal de 50 microlitros, cargue 20 microlitros de la mezcla de muestras ddPCR en la fila central del cartucho. Luego use una pipeta multicanal de 200 microlitros para cargar 70 microlitros de aceite en la fila inferior sin generar burbujas en toda la pipeta. Coloque la junta, tocando solo los bordes, evitando el centro, el área cóncava, y luego coloque la placa de forma segura en el generador de gotas, y cierre la cubierta para iniciar la carrera.Para transferir la mezcla de inmersión desde la fila superior del cartucho a la placa de 96 pocillos, use una pipeta multicanal y deje caer 40 microlitros de muestra líquida durante tres a cinco segundos en un ángulo de 30 a 45 grados. Luego expulse la mezcla en el pozo lentamente durante más de tres segundos en un ángulo de 45 grados, lo que permite que caiga desde un lado, y luego vaya a la segunda parada de la pipeta para expulsar el líquido por completo. Usando sellos térmicos de lámina, selle las placas durante cinco segundos a 180 grados centígrados.Coloque la placa sellada en el termociclador y establezca las condiciones de PCR para las pautas de entrega de NHEJ estableciendo la desnaturalización inicial a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Luego, establezca 40 ciclos de 94 grados celsius durante 30 segundos para desnaturalizarse, 55 grados celsius de un minuto a anneal y 60 grados celsius durante dos minutos para extenderse. Después de 40 ciclos, manténgalo a 98 grados centígrados durante 10 minutos y manténgalo final a cuatro grados centígrados.Use una velocidad de rampa de dos grados centígrados por segundo para todos los pasos. La temperatura de recocido variará, según las sondas o imprimación utilizada. Coloque la placa de forma segura en el lector de gotas con el A1 bien etiquetado en la parte superior izquierda.Abra el programa y configure la placa designando FAM como el canal de referencia conocido, y HEX como el desconocido para cada pozo. A continuación, cambie el nombre de cada muestra. Ejecute el experimento de lectura de gotas como cuantificación directa mientras guarda la plantilla.Designe los parámetros experimentales correctos para el análisis de software, a saber, información de muestra, supermezcla, nombre de destino, tipo de objetivo, canal de señal uno y canal dos. Luego, establezca el umbral para el recuento de gotas por encima de 10, 000 para obtener resultados confiables. A continuación, verifique el recuento de gotas para cada pozo en la pestaña de gotas, asegurándose de que todos estén por encima de 10, 000.Finalmente, verifique la amplitud 1D para una separación eficiente de la señal de los negativos. En el editor de placas, resalte toda la placa y configure el tipo de experimento para que se caiga. Establezca el objetivo WT como referencia, designando el canal uno para FAM y el canal dos para HEX.Establezca el objetivo NHEJ como desconocido, designando el canal uno para FAM y el canal dos como ninguno. En la ficha Amplitud 2D, establezca los umbrales de clúster con las herramientas de gráfico para cada muestra. La cola normalmente se asocia con el grupo WT para los ensayos NHEJ.En la pestaña de relación, haga clic en el icono de engranaje en la parte superior derecha del gráfico y seleccione la abundancia fraccional para trazar un punto correspondiente al porcentaje de eventos NHEJ. 15 muestras diferentes extraídas de 10 mosquitos cada una contenía varios alelos NHEJ, fueron analizadas e identificadas utilizando el ensayo de caída, y los resultados mostraron que las 15 muestras llevaban alelos 100% Indel. En otro experimento, se examinaron 11 muestras extraídas de mosquitos de tipo silvestre y mosquitos NHEJ con diferentes porcentajes de NHEJ con este protocolo ddPCR.Los resultados mostraron que el porcentaje identificado fue comparativamente cercano a la técnica de análisis de detección por amplicon de Indel. Pipetear lentamente para evitar burbujas, y dejar que todas las gotas emulsionadas goteen por la pared de los pozos.

Research

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