Name: digital-droplet pcr to detect indels mutations in genetically modified anopheline mosquito populations
Uploaded: 2021-06-28T14:00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations at JoVE.com

Finansman Kaliforniya Üniversitesi Irvine Sıtma Girişimi tarafından sağlandı. AAJ, Irvine Kaliforniya Üniversitesi'nde Donald Bren Profesörüdür.

1. DNA ekstraksiyonu
<ol><li>Numune başına 500 μL NLS ve 120 μL EDTA oranına sahip EDTA/Nuclei Lizis Tamponu (EDTA/NLS) hazırlayın. Birden çok örnek için ölçeklendirin. Karışımı buzda soğutun. NOT: Çözelti, ses seviyesine bağlı olarak soğuduğunda 2-5 dakika içinde bulanıklaşır.</li>
	<li>Sivrisinek örneğini 600 μL soğutulmuş EDTA/NLS ile doldurulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 10-15 sn için mekanik bir homojenizatör kullanarak homojenize edin; iyice karıştırın.</li>
	<li>Tüpe 17,5 μL 20 mg/mL Proteinaz K ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
	<li>55 °C'de gece boyunca kuluçkaya yaslanın. Alternatif olarak, numuneyi 55 °C'de 3 saat boyunca her 1 saat sallama ve girdap ile kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Oda sıcaklığı örneğine 200 μL Protein Çökeltme Çözeltisi ekleyin ve 20 sn boyunca güçlü bir şekilde girdap ekleyin.</li>
	<li>Numuneyi buzda 5 dakika soğutun.</li>
	<li>Numuneyi 4 dakika boyunca 15.890 RCF'de pelet proteinlerine santrifüj edin.</li>
	<li>DNA'yı içeren süpernatantı dikkatlice emiş ve 600 μL izopropanol içeren temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Tüpü 5-10 kez ters çevirerek çözeltiyi hafifçe karıştırın. 15.890 RCF'de 1 dakika santrifüj. DNA peletini korurken süpernatantı dikkatlice dekante edin.</li>
	<li>600 μL oda sıcaklığı %70 etanol ekleyin. Peletlenmiş DNA'yı tüpü hafifçe ters çevirerek yıkayın.</li>
	<li>15.890 RCF'de 1 dakika santrifüj. Cam pipet ucu kullanarak aspirasyon yaparak süpernatant dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Tüpü temiz emici kağıda ters çevirin ve peletin havayla 10-15 dakika kurulayın.</li>
	<li>DNA'yı PCR sınıfı suyla yeniden kullanın. Bireysel sivrisinek örneği başına 20 μL veya 10 havuzlu sivrisinek için 100 μL kullanın. NOT: Piyasada bulunan bir kit kullanan sivrisinek örnekleri için DNA çıkarma yöntemleri (bkz. Malzeme Tablosu),üreticinin Doku Kültürü Hücrelerinden ve Hayvan Dokusu protokolünden izole edilen Genomik DNA'sından uyarlanmıştır.</li>
</ol>2. ddPCR reaksiyonları ve damlacık üretimi hazırlığı
<ol><li>Bir florometre kullanarak DNA'yı ölçün. NOT: Bırakma tahlilleri için, reaksiyon başına 3.000-30.000 haploid genom kopyası kullanılması önerilir, bu da NHEJ olaylarını hedeflenen kesim bölgesinin WT dizisine bağlanan ve hedef bölgeye bir silme veya ekleme varsa tavlama (bırakma) yapmayan bir HEX etiketleme probu ile tespit etmek için tasarlanmıştır. bir NHEJ varyantının varlığını gösterir.</li>
	<li>Fotokopi genom ağırlığını ve ekstrakttaki DNA konsantrasyonu kullanarak kopya numarasını hesaplayın. Bu, çıkarılan DNA'nın konsantrasyonunun toplam DNA kütlesini elde etmek için kullanılan hacimle çarparak ve daha sonra haploid genom ağırlığına bölünmesiyle yapılır. Eklenen hacmin 1-10 μL arasında olduğundan emin olun. NOT: Bir Anopheles gambiae haploid genomun yetişkin sivrisinek başına 0.27 pg olduğu tahmin edilmektedir10.</li>
	<li>Astarlar ve problar tasarlayin. 150-400 bp'lik bir amplicon üreten gRNA hedef bölgesinin 5've 3'uçlarını kuşatan 55-60 °C aralığında astar Erime Sıcaklığı (Tm) ile ileri ve geri oligonükleotid astarlar tasarlayın.<ol>
<li>NHEJ algılaması için HEX (Hexachloro-floresan) etiketli prob: Hedef bölgeye tamamlayıcı olarak ~15-20 bp uzunluğunda bir oligonükleotid tasarlayın ve HEX-probu 5'uç ve BHQ1'e (BLack Hole Quencher 1) 3' uca ekleyin. Hidroliz probunun Tm'si astarların Tm'sinden 3-10 °C daha yüksek olmalıdır.</li>
		<li>Referans WT için FAM (6-karboksifluorescein) etiketli prob: Hedef bölgeden uzak korunmuş bir genom alanına (yaklaşık 25 bp) tamamlayıcı bir oligonükleotid ~15-20 bp uzunluğunda bir tasarım ve FAM-prob'u 5'uç ve BHQ1'i 3' uca ekleyin. Hidroliz probunun Tm'si astarların Tm'sinden 3-10 °C daha yüksek olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PCR reaksiyon hazırlığı
<ol><li>Aşağıdaki bileşenlerle 25 μL ddPCR Numune Karışımı hazırlayın: problar için ddPCR supermix (UTP yok): 12,5 μL, ileri ve ters astarlar (10 μM): Her biri 1 μL, HEX/FAM probları (10 μM): her biri 0,625 μL, DNA: 1-5 μL (3.750-37.500 haploid genom kopyası) ve su: 25 μL'ye kadar.</li>
	<li>Reaksiyonları girdaplama veya reflü pipetleme (yukarı ve aşağı) (20x) ile iyice karıştırın. NOT: Reaksiyonlar 96 kuyulu bir plakadaysa, kabarcık oluşumunu önlemek için girdap yerine tüm ses seviyesini 20 kez yukarı ve aşağı pipetlayın.</li>
	<li>Karışımı tüpün altına veya kuyuya yerleştirmek için numuneleri kısaca santrifüjleyin. NOT: Damlacık üretimi için reaksiyonların oda sıcaklığında olduğundan emin olun. Her kartuşta ekstra/kullanılmayan kuyular için 1x ddPCR karışımı hazırlayın (her kartuşta 8 kuyu vardır).</li>
</ol>4. Damlacık üretimi
<ol><li>50 μL çok kanallı pipet kullanarak, ddPCR numune karışımının 20 μL'lik kısmını kartuşun orta sırasına yükleyin(Şekil 1A, üst).</li>
	<li>Yağın 70 μL'yi alt sıraya yükleyin. Kullanılmayan kuyulara 20 μL 1x ddPCR supermix yükleyin. NOT: Kabarcıkları tanıtmayın.</li>
	<li>Contayı sadece kenarlara dokunarak, orta konik alandan kaçınarak yerleştirin(Şekil 1B).</li>
	<li>Plakayı damlacık jeneratörüne güvenli bir şekilde yerleştirin ve çalıştırmayı başlatmak için kapağı kapatın.</li>
	<li>Çok kanallı pipeti kullanarak, emersion karışımının 40 μL'lik kısmını kartuşun üst sırasından(Şekil 1A, altta) 96 kuyu plakasına aktarın.<ol>
<li>45-30° açıyla 3-5 sn için sıvı numunesi çekin. Karışımı 3 sn'nin üzerinde yavaşça kuyunun kenarına 45° açıyla atın ve yan tarafa damlamasını sağlar. Tüm sıvıyı dışarı çıkarmak için pipetin ikinci durağına (tamamen atılma) gitmek sorun değildir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Folyo ısı contalarını kullanarak plakaları 180 °C'de 5 sn kapatın.</li>
</ol>5. PCR
<ol><li>Sızdırmaz plakayı termositlere yerleştirin (Şekil 1C) ve NHEJ Bırakma yönergelerini aşağıdaki gibi takip ediyorsanız önerilen PCR koşullarını ayarlayın:<ol>
<li>10 dakika boyunca 95 °C'de ilk denatürasyon.</li>
		<li>Denatüre etmek için 30 sn için 94 °C, tavlama için 1 dakika için 55 °C ve 2 dakika uzatmak için 60 °C 40 döngü ayarlayın.</li>
		<li>98 °C'de 10 dakika bekletin.</li>
		<li>4 °C'de tutun. NOT: Belirli astarlar ve prob setleri için tavlama sıcaklığı termal gradyan kullanılarak optimize edilebilir. Tüm adımlar için 2 °C/s rampa hızı kullanın. PCR koşulları her deneysel tasarıma ve kuruluma bağlı olarak ayarlanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Damlacık okuma
<ol><li>Plakayı sol üstte iyi A-1 ile damlacık okuyucuya güvenli bir şekilde yerleştirin (düzleştirilmiş köşe, diğer üçü kenarlı) (Şekil 1D).</li>
	<li>Programdaki plakayı ayarlayın: FAM'ı bilinen referans kanalı ve HEX'i bilinmeyen kanal olarak belirleme (Şekil 2A).</li>
	<li>Damlacık okuma deneyini doğrudan niceleme olarak çalıştırın. Çalıştırma bittikten sonra, analiz için Deneme türünü Bırakma (DOF) olarak değiştirin (Şekil 2A).</li>
</ol>7. Analiz
<ol><li>Doğru deneysel parametreleri belirleyin (Şekil 2A): Örnek Bilgi, SuperMix, Hedef Adı (WT veya NHEJ), Hedef Türü (Ref veya Unknown), Signal Ch1 (HEX veya FAM), Signal Ch2 (HEX veya FAM) ve damlacık sayısı eşiğini manuel olarak ayarlayın (güvenilir sonuçlar için 10.000'in üzerine önerin). Yazılım, analizin çoğunu belirlenen parametreyle gerçekleştirecektir.</li>
	<li>Damlacık sekmesinde damlacık sayısını kontrol edin; hepsinin 10.000'in üzerinde olduğundan emin olun (Şekil 2B).</li>
	<li>Negatiflerden etkili sinyal ayırma için 1 D genliği kontrol edin.</li>
	<li>Plaka Düzenleyicisi'nde, tüm plakayı vurgulayın ve Deneme Türünü Bırak olarak ayarlayın.</li>
	<li>WT hedefini Başvuruolarak ayarlayın, FAM için kanal 1 ve HEX için kanal ikiyi belirleyin.</li>
	<li>NHEJ hedefini bilinmiyor olarak ayarlayın, FAM için kanal 1 ve kanal 2'yi yok olarak belirleyin.</li>
	<li>2D genlik sekmesinde, her örnek için grafik araçlarıyla Küme Eşiklerini ayarlayın. WT kümesiyle ilişkili kuyruğu göz önünde bulundurun; Bu NHEJ tahlilleri için normaldir (Şekil 3A). NOT: Oran sekmesinin altında, grafiğin sağ üst kısmındaki Dişli Simgesi'ne tıklayın. Kesirli Bolluk 'useçin. Grafik şimdi NHEJ olaylarının yüzdesine karşılık gelen bir nokta çizecektir (Şekil 3B).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li><li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae.">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).</li><li>Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Bo&#235;te, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agricultural+pest+control+with+CRISPR-based+gene+drive:+time+for+public+debate:+Should+we+use+gene+drive+for+pest+control.">Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control.</a> EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11, 5553 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+droplet+digital+PCR+and+direct+Sanger+sequencing+for+the+detection+of+the+BRAFV600E+mutation+in+papillary+thyroid+carcinoma.">Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902 (2019).</li><li>Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+droplet+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+characterizing+DNA+reference+material+for+KRAS+mutation+detection.">Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9650 (2018).</li><li>Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screening+strategy+for+detecting+CRISPR_Cas9+induced+mutations+using+next-generation+sequencing.">A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 15 (1), 1002 (2014).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+droplet+PCR+and+IDAA+for+the+detection+of+CRISPR+indel+edits+in+the+malaria+species+Anopheles+stephensi.">Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi.</a> Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).</li><li>Holt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298 (5591), 129-149 (2002).</li></ol>

Yazarların hiçbir açıklaması yok.

Dijital damlacık PCR, Cas/gRNA tabanlı bir gen tahrik sisteminde NHEJ olaylarından kaynaklanan indel alellerinin varlığını belirlemek için etkili bir yöntemdir ve bireylerde veya popülasyonlarda bu alellerin sıklığının ölçülmesini sağlar. Güvenilir sonuçlar elde etmek için protokolün bazı adımlarının özel bir dikkatle takip edilmesi gerekir. Öncelikle, genomik DNA ekstraksiyonu, yüksek kalite ve yeterli miktarda sağlamak için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. İyi bir ekstraksiyon, reaksiyon başına haploid genom kopyalarının doğru bir şekilde belirlenmesini sağlayacaktır. Deneyimlerimize göre, piyasada bulunan bir kit (bkz. Malzeme Tablosu)sürekli olarak yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonları sağladı. Bununla birlikte, bireysel sivrisineklerin ekstraksiyonları, DNA peletinin görselleştirilmesi zorlaştığından ve dikkatli olmazsa süpernatant ile kolayca emilebileceğinden özellikle zor olabilir. İkincisi, astarlar ve problar dikkatlice tasarlanmalıdır. DDPCR deneyini tamamlamadan önce, tasarlanan astarların önce geleneksel bir PCR gerçekleştirerek ve jel elektroforez yoluyla tek bir ürünü görselleştirerek tek bir PCR ürünüyle sonuçlandığından emin olun. Başvuru FAM probu da yüksek oranda korunmuş bir sıranın tamamlayıcısı olacak şekilde tasarlanmalıdır. Bu, farklı bir popülasyon boyunca WT alellerinin doğru şekilde algılanmasını sağlayacaktır. Her benzersiz deney için astar/prob kombinasyonları farklı termosikleyici koşullarına sahip olacaktır ve bu koşulların bir termal degrade kullanılarak optimize edilmesiniz önerilir.
Sanger dizilimi veya NGS gibi indelleri tanımlamak için başka yöntemler de vardır. Sanger dizilimi sınırlıdır, çünkü yeni varyantları tanımlamak için daha düşük bir algılama sınırına ve düşük keşif gücüne sahiptir. Sanger dizilimi de emek yoğundur ve yüksek verim değildir. Sanger dizilimi ile karşılaştırıldığında, NGS düşük hassasiyet, keşif gücü ve aktarım hızı ile aynı sınırlamalara sahip değildir. NGS'nin bir diğer faydası da tek nükleotid polimorfizmden (SNP' ler) yeniden yapılanmalara kadar çeşitli mutasyonları tespit edebilmesidir. Bununla birlikte, NGS Cas9/gRNA ile ilişkili indellerin belirlenmesi uygulamasında daha maliyetli ve zaman alıcı bir yöntemdir, çünkü ilgi çekici tek bir hedef bölge vardır ve daha büyük genom çapında analizler için en uygun yöntemdir. Yukarıda belirtilen yöntemlerle karşılaştırıldığında, ddPCR yüksek aktarım hızına sahiptir ve hızlı bir dönüş süresine sahiptir. DdPCR malzemeleri ve aletleri şirket içinde mevcutsa, 96 numune 1-2 gün içinde işlenebilir, bu da Cas9 / gRNA modifiye organizmaların büyük denemelerinin hızlı analizi için çok uygundur.
ddPCR için birçok avantaj olsa da sınırlamalar da vardır. İlk olarak, ddPCR ekipmanı bağımsız bir laboratuvar ortamında sıkça bulunmaz. ddPCR ekipmanı daha büyük araştırma kurumlarında ortaklaşa mevcut olabilir, ancak bu, kurum dışında veri oluşturma ve analiz kolaylığına izin vermez. İkincisi, alternatiflerin aksine, ddPCR tanımlanan indel mutasyonlarının bireysel benzersiz dizilerini sağlamaz. Dijital damlacık PCR, bir popülasyondaki indel mutasyonlarının sıklığını sağlayacaktır, ancak dizi olmadan, mevcut indellerin ilgi geninin işlevini koruma veya engelleme olasılığının daha fazla olup olmadığını belirleyemez. DdPCR yöntemi, Cas9/gRNA tabanlı bir tahrik organizmasının alan serbest bırakma denemesinden sonra vahşi popülasyonları analiz etmek için belki de en uygun olanıdır, çünkü transjenin yerli popülasyona giriş sıklığını ve popülasyon içindeki indellerin neslini gerçek zamanlıya yakın bir şekilde verimli bir şekilde belirleyebilir. DdPCR hızlı dönüş süresi nedeniyle, malzemeler yerel olarak mevcutsa, bir saha deneme bölgesinde popülasyonu haftalık olarak örneklemek ve analiz etmek mümkün olacaktır. DdPCR ekipmanını satın almak, ithal etmek ve kurmak için başlangıç maliyetleri uzak laboratuvarlarda yüksek olacaktır, ancak bir tahrik sisteminden değişiklik gördüğü için vahşi bir popülasyonu titizlikle değerlendirebilmenin yararları maliyetleri haklı çıkaracaktır.

Gen tahrikleri, tıbbi ve tarımsal alaka düzeyi 1 , 2 ,3,4,5böcek popülasyonlarını kontrol etmek için muazzam birpotansiyelesahiptir. Örneğin, CRISPR Cas nükleaslarına ve kılavuz RNA'lara (gRNA'lar) dayanan gen tahrik sistemleri, daha az bulaşma ve daha az hastalığa yol açan sıtma parazitlerine refrakterlik sağlayan özellikleri getirerek vektör sivrisinek popülasyonlarını değiştirmek için kullanılabilir1,4,5. Gen tahrik sistemi kendini ve ilişkili özelliği meiotik mikrop öncesi hücrelerde bir homolog kromozomdan diğerine kopyalar ve bu, yavruların çoğunluğunun sürücüyü devralmasını ve alanda uzun süreli ve sürdürülebilir popülasyon modifikasyonu potansiyeli yaratmasını sağlar. Bununla birlikte, Cas/gRNA tabanlı yöntemlerin bir dezavantajı, homolog olmayan son birleştirici (NHEJ) DNA onarımı yoluyla ekleme ve silme (indel) mutasyonları üretme olasılığıdır, bu da popülasyonda yeterince yüksek bir frekansa biriktiğinde tahrik sistemininyayılmasını durdurabilen sürücüye dayanıklı alellerin üretilmesine neden olur. . Bu protokol, Cas/gRNA tabanlı gen güdüsü sırasında hem popülasyon hem de bireysel düzeyde indel mutasyonlarının yaygınlığını ve göreceli miktarını belirleyebilen yüksek verimli ve güvenilir bir yöntemi detaylandırıyor.
Yeni nesil sıralama (NGS) yöntemleri benzersiz sıralama çözünürlüğü sağlar. Bununla birlikte, NGS ile ilişkili maliyet ve teknik gereksinimler rutin testleri yasaklar veindels 6,7,8'ideğerlendirmek için yüksek verimli bir yöntem olarak kullanımını sınırlar. Geleneksel PCR nicelleştirme yöntemleri uzun zamandır genom indelleri için standart değerlendirme prosedürü olarak kullanılmaktadır; ancak, bu yöntemler emek yoğundur, veri temini uzun zaman alır ve yüksek derecede değişkenliğe sahiptir. Digital-Droplet PCR (ddPCR) bazı uygulamalarda Sanger diziliminden daha hassas mutasyonları tespit etme konusunda daha hassas olduğu kanıtlanmıştır ve diğerlerinde NGS'den daha düşük bir algılama sınırına sahiptir6,7,8,9. Ayrıca, bir örnek seti değerlendirmenin maliyeti ve sonuç elde etmek için dönüş süresi, ddPCR için Sanger diziliminden veya NGS9'dandaha az pahalı ve daha hızlıdır. Çift problu bir sistem kullanan Bırakma tahlili, gRNA tarafından yönlendirilen hedef Cas9 kesim yerinde vahşi tip (WT) sırasının yokluğuna bağlı olarak NHEJ alellerini tanımlar. Bu testte, Cas/gRNA tabanlı sistemin öngörülen kesim bölgesini içeren kısa bir amplicon belirli bir astar çifti ile yükseltilir. Bir floresan prob amplicon'un korunmuş bir bölgesine bağlanmak için tasarlanmıştır ve başka bir floresan prob kesim bölgesinin WT sırasını tanır. Bir NHEJ alelesinin varlığında, ikincisi amplicon'a bağlanmaz.
DdPCR kullanımı, sivrisinek popülasyon analizlerinde NHEJ profillemesine izin verecek olan silmeleri, tek baz çifti farklılıklarını ve eklemeleri hedeflemek için astarlar tasarlama yeteneği sağlar9. Bu çekici özellikler göz önüne alındığında, sivrisineklerde Cas/gRNA tabanlı gen tahrik sisteminden oluşturulan indellerin yüksek verimli tespiti için ddPCR için bir protokol oluşturduk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR-grade Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any certified PCR-grade water can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K 20 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward and Reverse oligonucleotide primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td>Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital-droplet pcr to detect indels mutations in genetically modified anopheline mosquito populations

Sivrisinek genomik ve genetik mühendisliği teknolojilerindeki son gelişmeler, hedeflenen DNA dizi varyasyonlarını büyük ölçekte tespit etmek için hızlı ve verimli yöntemlere duyulan ihtiyacı teşvik etti. Özellikle, CRISPR kılavuzu RNA (gRNA)/Cas9 aracılı homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) tarafından oluşturulan gen düzenlemeli sitelerdeki eklemelerin ve silmelerin (indels) tespiti, mutajeninzin doğruluğunu ve istenmeyen değişikliklerin sıklığını değerlendirmek için önemlidir. Burada, yüksek verimli NHEJ analizi için çok uygun olan dijital damlacık PCR (ddPCR) için bir protokol açıklıyoruz. Bu yöntem, tek tek sıra varyasyonlarını tanımlayan veriler üretmese de, bir popülasyon içindeki sıra varyasyonunun nicel bir tahminini sağlar. Ayrıca, uygun kaynaklarla, bu protokol bir alan alanı laboratuvar ortamında yeni nesil veya Sanger diziliminden daha kolay uygulanabilir. ddPCR ayrıca, genetik olarak tasarlanmış organizmaların saha denemeleri sırasında vahşi popülasyonlardaki genetik varyasyonun daha hızlı ve eksiksiz bir analizini sağlayan bu yöntemlerin her ikisinden de daha hızlı bir dönüş süresine sahiptir.

Bu prosedürün bir uygulaması Carballar-Lejarazú ve ark.9'da görünür. DDPCR Bırakma tahlili, WT ve indel dizilerini ayırt etmek için iki floresan prob kullanır: BIR FAM probu amplicon içinde korunmuş bir diziye bağlanırken, HEX probu hedeflenen sitenin WT dizisini hedefler (Şekil 4A). Bir indel varlığında, HEX probu bağlanmaz. Temsili sonuçlar Şekil 2, Tablo 1 ve Tablo 2'de Carballar-Lejarazú veark. Bu protokolü kullanarak, ddPCR'nin çok çeşitli CRISPR-Cas9 kaynaklı NHEJ olaylarını tespit ettiği ve tek bir veya havuza alınan örnekte NHEJ frekansını ölçtği kanıtlanmıştır. Her biri çeşitli NHEJ alelleri içeren 10 sivrisinekten oluşan on beş farklı havuzlu örnek (Carballar-Lejarazú ve ark.9'unTablo 2). Bunlar burada sunulan protokol ve parametreler kullanılarak ddPCR ile analiz edildi. Tablo 19'dan elde edilen sonuçlar, 15 numunenin tümünü Drop-off testinde tanımlanan % 100 indel alelleri taşıdığını göstermektedir (Şekil 4B). Başka bir deneyde, farklı NHEJ yüzdelerine sahip 11 adet havuzlu WT sivrisinek ve NHEJ sivrisinek örneği (%0, %10, %20, %30, %40, %50, %60, %70, %80, %90 ve %100) bu ddPCR protokolü ile incelenmiştir ve sonuçlar (Şekil 2; Carballar- Lejarazú vd.9) tanımlanan yüzdenin Amplicon Analizi ile Indel Algılama tekniğine yakın olduğunu göstermiştir (Şekil 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig01.jpg"> Şekil 1: Deneysel kurulum ve prosedür. (A) Damlacık üretimi için kartuş hazırlığı. (Üstte) Numuneler kartuşun orta satırına doldurulurken, yağ alt sıraya doldurulur. (Alt) Damlacık oluşturmadan sonra emülsifiye damlacıklarla dolu üst sıra. (B) Numune ile doldurulmuş ve yerinde bir conta ile kaplanmış bir kartuş ile damlacık jeneratörü. (C) Bir Termo-Cycler folyo conta ile kaplı 96 kuyu plakası. (D) 96-well plakalı damlacık okuyucu, sabitlemek için plakanın üzerine metal bir kapak tutturmuş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig02.jpg"> Şekil 2: Damlacık okuma. (A) Damlacık okuma için yazılım arayüzü. Turuncu kutular örneklerin olduğu kuyuları gösterir. Gri kutular boş kuyulardır. Deneysel parametreler Araçları Düzenle panelinde (sağ tarafta) ayarlanır. Her örnek, ilgili örnek kutusuna tıklayarak düzenlenebilir. Deneysel Tür için Bırakma (DOF) seçeneğini belirleyin. Örnek bilgilerde, örneğin Adı ve Türüve SuperMixiçin uygun bilgileri doldurun. Tahlil Bilgileri için Temel Bırakma 'yıseçin. WT örneği için sırasıyla Hedef Adıiçin WT , Hedef Türüiçin Ref ve Ch1 ve Ch2 Sinyali için hem FAM hem de HEX'i seçin. NHEJ örnekleri için, Hedef Adıiçin uygun adı doldurun, Hedef Türüiçin Bilinmiyor 'u seçin ve Ch1 Sinyaliiçin FAM 'ı seçin. Signal Ch2'i Yok'ta bırakın. (B) Birden fazla örnek için damlacık sayısı sonuçları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig03.jpg"> Şekil 3: Bırakma tahlil analizi. (A) WT ve NHEJ alellerinin damlacık sayısı için Küme 2D çizimi. 2D Genlik sekmesinde, tüm damlacıklar varsayılan olarak sınıflandırılmaz. Bu şekilde, renkler ayırt etmek için el ile atanır. Turuncu noktalar kümesi, sırasıyla referans sırası ve hedef site dizisinde hem FAM hem de HEX problarının bağlanmasıyla elde edilen WT alaşım sayılarıdır. Mavi noktalar, başvuru sırasına FAM bağlaması olan ancak hedef site dizisinde HEX bağlaması olmayan damlacıkların puanlarını temsil eder (bu nedenle HEX'in bırakması). Gri noktalar, FAM veya HEX bağlaması olmayan boş damlacıklardır. (B) NHEJ olaylarının oran/bolluk grafikleri. Oran sekmesinin altında, NHEJ olaylarının muhabir yüzdesine sahip bir grafik için Kesirli Bolluk'u seçin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig04.jpg"> Şekil 4: Transgenik Anopheles stephensi hattında homolog olmayan son birleştirme tanımlaması ve nicelemesi için ddPCR ile Bırakma tahlilinin uygulanması, AsMCRkh1. (A) Çift prob sistemine sahip hedeflenen bir DNA yerindeki mutasyonları tespit etmek için ddPCR Bırakma testinin şematik sunumu. 150-400 bp'lik bir amplicon ileri ve ters astarlarla yükseltilir. FAM etiketli bir prob amplicon'un korunmuş bir dizisine bağlanmak için tasarlanmıştır, HEX etiketli bir prob ise WT gRNA hedeflenen bölgeye bağlanmak için tasarlanmıştır. (B) DdPCR ile çeşitli indel türlerinin tespiti. Her biri ekleme, silme ve değiştirme dahil olmak üzere çeşitli türde indel içeren 10 AsMCRkh1 sivrisinekten oluşan 15 havuz, ddPCR Drop-Off test ile analiz edildi. Mutasyonların ve dizilerin ayrıntıları Tablo 2 ve Tablo S3'te bulunabilir. 9. (C) AsMCRkh1 ve WT sivrisineklerinin çeşitli oranlarda karışık örneklerinde NHEJ'nin nicelemesi (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 ve 0:10) ddPCR ve Amplicon Analysis9ile karşılaştırılan bir Indel Algılama tekniği kullanarak. Carballar-Lejarazú ve ark. Biotechniques'tenuyarlanmış görüntüler. 68(4):172-179 (2020)9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Astar/Prob</td>
			<td>Sıra (5' » 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR İleri Astar</td>
			<td>ATGATCAAATGTCGACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR Ters Astar</td>
			<td>ACCGTACTGGTTGAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR HEX Probu (BHQ1)</td>
			<td>[HEX]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddPCR FAM Sondası (BHQ1)</td>
			<td>[6FAM]-CCACGTGGGATCGAAGG-[BHQ1]</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HEX: Hexachloro-floresan, FAM: 6-carboxyfluorescein, BHQ: Kara Delik Quencher</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Astar ve prob dizileri.

Watch this Scientific Journal Video about Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations at JoVE.com

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Bu protokol, gRNA kaynaklı Cas9 bölünmesi ve DNA onarımının ardından hedef sahalarda homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) olaylarının tanımlanması ve nicelleştirilmesi için analiz de dahil olmak üzere DNA ekstraksiyonundan dijital damlacık PCR (ddPCR) için deneysel kuruluma kadar adımları sağlar. Bu yöntemin diğer kullanımları arasında polimorfizm tespiti ve gen düzenleme varyant doğrulaması gibi uygulamalar yer almaktadır.

Genetiği Değiştirilmiş Anopheline Sivrisinek Popülasyonlarındaki Indels Mutasyonlarını Tespit Etmek için Dijital Damlacık PCR

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

Bu protokol, gen tarafından düzenlenen sivrisinek popülasyonlarında Indel mutasyonlarının yaygınlığını ve göreceli miktarını belirleyebilen NHEJ analizi için yüksek verim ve güvenilir bir makyaj sağlar. Bir sonraki nesil veya Sanger dizilimi ile karşılaştırıldığında, ddPCR, genetik varyasyonun genetiği değiştirilmiş organizmalar için hızlı ve eksiksiz bir şekilde analiz edilmesine izin veren sonuçlar için daha hızlı geri dönüş süresine sahiptir. Bu yöntem genel olarak tüm deneysel sistemler için geçerli olmalıdır.Prosedürü gösteren, Yang'ın laboratuvarından bir personel araştırma görevlisi olan Thai Pham olacak. Başlangıç olarak, metinde açıklanan oranlarda ddPCR süper karışım, ileri ve ters astarlar, HEX veya FAM probları, DNA ve su ekleyerek dijital damlacık PCR veya ddPCR örnek karışımının 25 mikrolitresini hazırlayın. Daha sonra girdapla reaksiyonun iyice karıştırılması.50 mikrolitrelik çok kanallı pipet kullanarak, ddPCR numune karışımının 20 mikrolitresini kartuşun orta sırasına yükleyin. Daha sonra pipetleme boyunca kabarcıklar üretmeden yağın 70 mikrolitresini alt sıraya yüklemek için 200 mikrolitrelik çok kanallı bir pipet kullanın. Contayı sadece kenarlara dokunarak, merkezden, betondan bölgeden kaçınarak yerleştirin ve ardından plakayı damlacık jeneratörüne güvenli bir şekilde yerleştirin ve çalıştırmayı başlatmak için kapağı kapatın.Daldırma karışımını kartuşun üst sırasından 96 kuyu plakasına aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve 30 ila 45 derecelik bir açıyla üç ila beş saniye boyunca 40 mikrolitre sıvı numune bırakın. Daha sonra karışımı 45 derecelik bir açıyla üç saniyeden fazla yavaşça kuyuya atın, yandan aşağı düşmesine izin verin ve ardından sıvıyı tamamen dışarı atmak için pipetin ikinci durağına gidin. Folyo ısı contalarını kullanarak plakaları 180 santigrat derecede beş saniye kapatın.Mühürlü plakayı termositlere yerleştirin ve ilk denatürasyonu 10 dakika boyunca 95 santigrat dereceye ayarlayarak NHEJ bırakma yönergeleri için PCR koşullarını ayarlayın. Ardından, denatüre etmek için 30 saniye boyunca 94 santigrat derecelik 40 döngü, bir dakikadan tavlaya 55 santigrat derece ve uzatmak için iki dakika boyunca 60 santigrat derece ayarlayın. 40 döngüden sonra, 10 dakika boyunca 98 santigrat derecede tutun ve dört santigrat derecede son tutuş yapın.Tüm adımlar için saniyede iki santigrat derecelik bir rampa hızı kullanın. Tavlama sıcaklığı, kullanılan problara veya astara göre değişecektir. Plakayı, sol üstte iyi etiketlenmiş A1 ile damlacık okuyucuya güvenli bir şekilde yerleştirin.Programı açın ve FAM'ı bilinen referans kanalı ve HEX'i her kuyu için bilinmeyen kanal olarak belirleyerek plakayı ayarlayın. Ardından, her örneğin adını değiştirin. Şablonu kaydederken damlacık okuma deneyini doğrudan niceleme olarak çalıştırın.Yazılım analizi için doğru deneysel parametreleri belirleyin, yani örnek bilgiler, süper karışım, hedef adı, hedef türü, sinyal kanalı bir ve kanal iki. Ardından, güvenilir sonuçlar için damlacık sayısı eşiğini 10.000'in üzerine ayarlayın. Ardından, damlacık sekmesindeki her kuyu için damlacık sayısını kontrol edin ve hepsinin 10.000'in üzerinde olduğundan emin olun.Son olarak, negatiflerden verimli sinyal ayırma için 1D genliği kontrol edin. Plaka düzenleyicisinde, tüm plakayı vurgulayın ve deneme türünü bırakacak şekilde ayarlayın. WT hedefini referans olarak ayarlayın, FAM için kanal 1 ve HEX için kanal 2'yi belirleyin.NHEJ hedefini bilinmiyor olarak ayarlayın, FAM için kanal 1 ve kanal 2'yi yok olarak belirleyin. 2D genlik sekmesinde, her örnek için grafik araçlarıyla küme eşiklerini ayarlayın. Kuyruk normalde NHEJ tahlilleri için WT kümesi ile ilişkilidir.Oran sekmesinin altında, grafiğin sağ üst kısmındaki dişli simgesine tıklayın ve NHEJ olaylarının yüzdesine karşılık gelen bir noktayı çizmek için kesirli bolluğu seçin. Her biri çeşitli NHEJ alelleri içeren 10 sivrisinekten oluşan 15 farklı çekilmiş örnek, bırakma tahlilleri kullanılarak analiz edildi ve tespit edildi ve sonuçlar 15 örneğin tamamının% 100 Indel alelleri taşıdığını gösterdi. Başka bir deneyde, farklı NHEJ yüzdelerine sahip 11 çekilmiş yabani tip sivrisinek ve NHEJ sivrisinek örneği bu ddPCR protokolü ile incelendi.Sonuçlar, tanımlanan yüzdenin amplicon analiz tekniği ile Indel tespitine nispeten yakın olduğunu göstermiştir. Kabarcıkları önlemek için yavaşça pipet ve tüm emülsifiye damlacıkların kuyuların duvarından damlamasına izin verin.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Mutlak ve Bağıl Kantitatif PCR Veri birleştirme STAT3 Splice Varyant Dökümünü belirlememize

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Yüzey koloniler Mikrobiyal Populasyonlarında Mekansal Ayrışma İzleme

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Pirinç Bir TILLING Popülasyonyüksek Çözünürlükte Erime mutasyonları belirlenmesi

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Yüksek Verimli Üretimi için Dondurulmuş Çözülmüş Embriyoların Kullanımı

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Miyokard Enfarktüsü Fare Modelinde Modifiye mRNA Teslimi

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...