Name: visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

نشكر الدكتورة ماريا رايشنباخ والدكتور كريستيان هيبن على دعمهما لنظام التدفق، وإليانور فوكس ويونيون شياو على قراءة المخطوطة بشكل نقدي. تم تمويل P-L.M من قبل مدرسة ماكس بلانك الدولية للأبحاث IMPRS-البيولوجيا والحساب (IMPRS-BAC). تلقى PK التمويل من قبل DFG-SFB1444. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.

1. خلية الثقافة والتعرض الإجهاد القص السوائل
ملاحظة: استخدمت مركبات ECs الوريدية السرية البشرية (HUVECs) كمثال لدراسة التفاعل المستحث من SS لل SMADs. يمكن تطبيق البروتوكول الموضح أدناه على كل نوع خلية استجابة SS.
<ol><li>معطف 6 قناة الشريحة مع 0.1٪ هلام الجلد porcine في برنامج تلفزيوني لمدة 30 ...

<ol>
	<li>Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+BMP+receptors:+Specificity,+activation+and+inhibition.">Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).</li><li>Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling.">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li><li>Hiepen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPR2+acts+as+a+gatekeeper+to+protect+endothelial+cells+from+increased+TGF&#946;+responses+and+altered+cell+mechanics.">BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGF&#946; responses and altered cell mechanics.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).</li><li>Hildebrandt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ActivinA+induced+SMAD1/5+Signaling+in+an+iPSC+derived+EC+model+of+Fibrodysplasia+Ossificans+Progressiva+(FOP)+can+be+rescued+by+the+drug+candidate+saracatinib.">ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+activation+state+of+the+endothelium+via+two+distinct+TGF-beta+type+I+receptors.">Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+receptor-like+kinase+(ALK)1+is+an+antagonistic+mediator+of+lateral+TGFbeta/ALK5+signaling.">Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling.</a> Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).</li><li>Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta-induced+Smad1/5+phosphorylation+in+epithelial+cells+is+mediated+by+novel+receptor+complexes+and+is+essential+for+anchorage-independent+growth.">Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).</li><li>Ramachandran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+uses+a+novel+mode+of+receptor+activation+to+phosphorylate+SMAD1/5+and+induce+epithelial-to-mesenchymal+transition.">TGF-&#946; uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition.</a> eLife. 7, 31756 (2018).</li><li>Flanders, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brightfield+proximity+ligation+assay+reveals+both+canonical+and+mixed+transforming+growth+factor-&#946;/bone+morphogenetic+protein+Smad+signaling+complexes+in+tissue+sections.">Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-&#946;/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).</li><li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).</li><li>Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+in+vascular+homeostasis+and+disease.">Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).</li><li>Cai, J., Pardali, E., S&#225;nchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+vascular+diseases.">BMP signaling in vascular diseases.</a> FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).</li><li>Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulated+TGF-&#946;/BMP+signaling+in+vascular+malformations.">Deregulated TGF-&#946;/BMP signaling in vascular malformations.</a> Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).</li><li>MacCarrick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loeys-Dietz+syndrome:+a+primer+for+diagnosis+and+management.">Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management.</a> Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Min, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Smad+2/3+signaling+by+low+shear+stress+mediates+artery+inward+remodeling.">Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling.</a> bioRxiv. , 691980 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+receptor-integrin+interaction+mediates+responses+of+vascular+endothelial+Smad1/5+and+proliferation+to+disturbed+flow.">BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-specific+activation+of+Smad1/5+regulates+vascular+endothelial+cell+cycle+progression+in+response+to+disturbed+flow.">Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).</li><li>van Dijk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+TGF-&#946;+and+BMP+signaling+in+human+atherosclerosis:+A+histological+evaluation+based+on+Smad+activation.">Visualizing TGF-&#946; and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation.</a> Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).</li><li>Derwall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+bone+morphogenetic+protein+signaling+reduces+vascular+calcification+and+atherosclerosis.">Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Alam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+Assay+(PLA).">Proximity Ligation Assay (PLA).</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).</li><li>Application Note 03: Growing Cells in &#181;-Channels. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf</a> (2012)</li><li>Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf</a> (2019)</li><li>ibidi. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Note+31:+Instructions+&#181;-Slide+VI+0.4.">Application Note 31: Instructions &#181;-Slide VI 0.4.</a> ibidi. , (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reichenbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+impact+of+fluid+shear+stress+and+YAP/TAZ+on+BMP/TGF-&#946;+induced+osteogenic+target+genes.">Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-&#946; induced osteogenic target genes.</a> Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).</li><li>Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+takes+two+to+tango:+Endothelial+TGF&#946;/BMP+signaling+crosstalk+with+mechanobiology.">It takes two to tango: Endothelial TGF&#946;/BMP signaling crosstalk with mechanobiology.</a> Cells. 9 (9), 1965 (2020).</li></ol>

يوفر البروتوكول القائم على جيش التحرير الشعبي الموصوف هنا طريقة فعالة لتحديد القرب من بروتينين (على سبيل المثال، تفاعلهما المباشر) في البلدان النامية المعرضة لضغوط القص بدقة كمية ومكانية. باستخدام الشرائح تدفق مع قنوات متوازية متعددة، يمكن فحص العديد من التفاعلات البروتين مختلفة في نفس ...

بروتينات عوامل النمو التحويلية بيتا (TGFа) superfamily هي السيتوكينات ذات الجليوتروبيك مع مجموعة متنوعة من الأعضاء، بما في ذلك TGFβs، والبروتينات مورفوجينية العظام (BMPs)، وActivins1،2. ملزمة ليغاند يحفز تشكيل أوليغومرات مستقبلات مما يؤدي إلى الفوسفور، وبالتالي، تفعيل SMAD التنظيمية الخلوية (R-SMAD). اعتمادا على العائلة الفرعية من ligands، يتم تنشيط R-SMADs مختلفة1،2. في حين أن TGFβs وActivins تحفز أساسا الفوسفور من SMAD2/3، BMPs حث SMAD1/5/8 الفوسفور. ومع ذلك، هناك أدلة متراكمة على أن BMPs و TGFβs/Activins ينشطون أيضا R-SMADs من الأسرة الفرعية الأخرى المعنية، في عملية تسمى "الإشارات الجانبية" 3،4،5،6،7،8 وأن هناك مجمعات SMAD مختلطة تتكون من كليهما، SMAD1/5 و SMAD2/3، Members3,9 . اثنين من تنشيط R-SMADs شكل مجمعات ثلاثية في وقت لاحق مع SMAD4 الوسيط المشترك. ثم تكون مجمعات عوامل النسخ هذه قادرة على الانتقال إلى النواة وتنظيم نسخ الجينات المستهدفة. يمكن أن تتفاعل SMADs مع مجموعة متنوعة من المنشطات المشاركة النسخية المختلفة والمقمعات المشتركة ، مما يؤدي إلى تنويع إمكانيات تنظيم الجينات المستهدفة10. ولإلغاء القيود التنظيمية على إشارات الأمراض التي تسببها الأمراض الحادة آثار خطيرة في مجموعة متنوعة من الأمراض. وتمشيا مع هذا، قد يؤدي إشارات TGFβ/BMP غير المتوازنة إلى أمراض الأوعية الدموية الحادة، مثل ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي، أو التهاب الأوعية الدموية النزفي الوراثي، أو تصلب الشرايين3،11،12،13،14.
تشكل الخلايا البطانية (ECs) الطبقة الأعمق من الأوعية الدموية ، وبالتالي ، فهي معرضة لإجهاد القص (SS) ، وهي قوة احتكاك يمارسها التدفق اللزج للدم. ومن المثير للاهتمام، يتم الاحتفاظ ECs المقيمين في أجزاء من الأوعية الدموية، والتي تتعرض لمستويات عالية من موحدة، صفح SS، في حالة الهوستاتيكية والكئيب. وعلى النقيض من ذلك، فإن المركبات ECs التي تعاني من انخفاض مستوى SS غير الموحد، على سبيل المثال، عند التشعبات أو الانحناء الأقل للقوس الأبهري، تنتشر وتفعيل المسارات الالتهابية15. وفي المقابل، فإن مواقع المركبات الإلكترونية المختلة معرضة للإصابة بالتصلب الشرايين. ومن المثير للاهتمام، أن المركبات الإلكترونية في هذه المناطق من أثيروبرون تعرض مستويات عالية بشكل شاذ من SMAD2/3 المنشط وSMAD1/516,17,18. وفي هذا السياق، تبين أن الإشارات المعززة TGFβ/BMP حدث مبكر في تطور الآفات تصلب الشرايين19 ووجد أن التداخل مع إشارات BMP يقلل بشكل ملحوظ من التهاب الأوعية الدموية، وتكوين الورم الحراري، والتكلس المرتبط به20.
القرب ربط المقايسة (جيش التحرير الشعبى الصينى) هو تقنية بيوكيميائية لدراسة التفاعلات البروتين البروتين في الموقع21،22. وهو يعتمد على خصوصية الأجسام المضادة من مختلف الأنواع التي يمكن أن تربط البروتينات المستهدفة ذات الاهتمام، مما يسمح بالكشف بشكل محدد للغاية عن تفاعلات البروتين الذاتية على مستوى الخلية الواحدة. هنا ، يجب على الأجسام المضادة الأولية أن ترتبط ب epitope الهدف على مسافة أقل من 40 نانومتر للسماح بالكشف23. لذلك ، فإن جيش التحرير الشعبي مفيد إلى حد كبير على النهج التقليدية للمناعة المشتركة ، حيث هناك حاجة إلى عدة ملايين من الخلايا للكشف عن التفاعلات البروتينية الذاتية. في جيش التحرير الشعبي، تربط الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأنواع، المرتبطة بشكل متناقض بشظايا الحمض النووي (التي يطلق عليها مسابير Plus و Minus)، الأجسام المضادة الأولية وإذا تفاعلت البروتينات ذات الاهتمام، فإن مسابير Plus و Minus تأتي على مقربة. يتم ربط الحمض النووي في الخطوة التالية ويتم تكبير الدائرة المتداول للحمض النووي الدائري. أثناء التضخيم ، ترتبط أوليغونوكليوتيدات الفلورسنتات التكميلية بالحمض النووي المركب ، مما يسمح بتصور هذه التفاعلات البروتينية عن طريق المجهر الفلوري التقليدي.
البروتوكول الموصوف هنا يمكن العلماء من مقارنة عدد مجمعات نسخ SMAD النشطة كميا في ظروف SS atheroprotective و atheroprone في المختبر باستخدام PLA. يتم إنشاء SS عن طريق نظام مضخة هوائية قابلة للبرمجة التي هي قادرة على توليد تدفق صفح أحادي الاتجاه من مستويات محددة ويسمح زيادات تدريجية من معدلات التدفق. تسمح هذه الطريقة للكشف عن التفاعلات بين SMAD1/5 أو SMAD2/3 مع SMAD4، وكذلك المجمعات المختلطة R-SMAD. يمكن توسيعه بسهولة لتحليل تفاعلات SMADs مع المنظمين المشاركين النسخي أو إلى مجمعات عوامل النسخ بخلاف SMADs. ويبين الشكل 1 الخطوات الرئيسية للبروتوكول المعروضة أدناه.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> الشكل 1: التمثيل التخطيطي للبروتوكول الموصوف. (أ) تتعرض الخلايا المصنفة في شرائح من 6 قنوات لإجهاد القص باستخدام نظام مضخة هوائية. (ب) تستخدم الخلايا الثابتة لتجربة جيش التحرير الشعبي أو لظروف التحكم. (ج) يتم الحصول على صور لتجارب جيش التحرير الشعبي مع المجهر الفلوري ويتم تحليلها باستخدام برنامج تحليل ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80606</td>
			<td>6-channel slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K298.1</td>
			<td>Quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.4</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stain DNA/Nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td>PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>MINUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>PLUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>PLA wash buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium (ECGS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf Serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4% buffered</td>
			<td>KLINIPATH/VWR</td>
			<td>VWRK4186.BO1</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&#160; 25 &#181;g/mL Hep +&#160;&#160; 50 &#181;g/mL ECGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, Type A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td>Use 0.1% in PBS for coating of flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v.7</td>
			<td>GarphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Program used for the Plots and statistical calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>supplement for medium (Hep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVECs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Mounting Medium</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Liquid mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Pump System</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>pneumatic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-80100</td>
			<td>supplement for medium (L-Glu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2154</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53745</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD2/3 Antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610843</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with CST 9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mousee anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Sanata Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7966</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>supplement for medium (P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set WHITE</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10963</td>
			<td>Tubings used for 1 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set YELLOW and GREEN</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Tubings used for 30 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9516</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>8685</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9515</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with BD 610843</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial Connector for &#181;-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10830</td>
			<td>serial connection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6683.1</td>
			<td>Permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay

تحويل عامل النمو β (TGFа) / العظام Morphogenetic البروتين (BMP) الإشارات هو تنظيم محكم ومتوازنة أثناء تطوير وتوازن الأوعية الدموية النظام وبالتالي، إلغاء الضوابط التنظيمية في هذا المسار الإشارات يؤدي إلى أمراض الأوعية الدموية الحادة، مثل ارتفاع ضغط الدم الشريان الرئوي، وtelangiectasia النزفية الوراثية، وتصلب الشرايين. تتعرض الخلايا البطانية (ECs)، باعتبارها الطبقة الأعمق من الأوعية الدموية، باستمرار لإجهاد القص السائل (SS). وقد ثبت أنماط غير طبيعية من السائل SS لتعزيز إشارات TGFβ / BMP، والتي، جنبا إلى جنب مع غيرها من المحفزات، والحث على تكوين الشرايين. وفيما يتعلق بهذا, atheroprone, تم العثور على انخفاض صفح SS لتعزيز TGFβ/ BMP الإشارات في حين atheroprotective, ارتفاع صفح SS, يقلل من هذه الإشارات. لتحليل كفاءة تفعيل هذه المسارات، قمنا بتصميم سير العمل للتحقيق في تشكيل مجمعات عامل النسخ تحت SS صفح منخفضة وظروف SS صفح عالية باستخدام نظام مضخة هوائية متاحة تجاريا وقربها اختبار الربط (جيش التحرير الشعبى الصينى).
يتطلب إشارات TGFβ/BMP النشطة تكوين مجمعات SMAD ثلاثية الأطراف تتكون من اثنين من الأنظمة SMAD (R-SMAD)؛ SMAD2/3 و SMAD1/5/8 للإشارات TGFβ وBMP، على التوالي) مع وسيط مشترك SMAD (شارك SMAD؛ SMAD4). باستخدام PLA استهداف وحدات فرعية مختلفة من مجمع SMAD ثلاثية، أي R-SMAD/co-SMAD أو R-SMAD/R-SMAD، يمكن قياس تشكيل مجمعات عامل النسخ SMAD النشطة كميا ومكانيا باستخدام المجهر الفلوري.
استخدام الشرائح تدفق مع 6 قنوات متوازية صغيرة، التي يمكن توصيلها في سلسلة، ويسمح للتحقيق في تشكيل عامل النسخ المعقدة وإدراج الضوابط اللازمة. 
يمكن تكييف سير العمل الموضح هنا بسهولة للدراسات التي تستهدف قرب SMADs من عوامل النسخ الأخرى أو مجمعات عوامل النسخ بخلاف SMADs ، في ظروف SS السوائل المختلفة. يظهر سير العمل المعروض هنا طريقة سريعة وفعالة لدراسة إشارات TGFβ/BMP المستحثة SS السائلة في ECs ، كميا ومكانيا.

لقد استخدمنا سابقا جيش التحرير الشعبي للكشف عن التفاعلات من البروتينات SMAD مختلفة3 وتحليل الإجهاد القص الناجمة عن التغيرات في SMAD الفوسفور28.
هنا، تم دمج كلا الأسلوبين مع البروتوكول المذكور أعلاه. تعرضت HUVECs لإجهاد القص من 1 dyn/cm2 و 30 dyn/cm2 وت?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

Visualization and Quantification of TGFÃƒÅ½Ã‚Â²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

هنا، نضع بروتوكولا لتصور وتحليل مجمعات SMAD المتعددة في وقت واحد باستخدام مقايسة ربط القرب (PLA) في الخلايا البطانية المعرضة لظروف إجهاد القص المرضي والفسيولوجي.

التصور والتحديد الكمي للإشارات TGFβ/BMP/SMAD تحت ظروف إجهاد القص السائل المختلفة باستخدام القرب-الربط-المقايسة

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

يمكن هذا البروتوكول العلماء من مقارنة عدد مجمعات عوامل النسخ كميا في ظل ظروف إجهاد القص المختلفة ، وسيكون مفيدا للأبحاث في بيولوجيا الأوعية الدموية. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو استخدام قنوات التدفق microfluidic التي تسمح بإجراء تحقيقات في عدة أزواج من الأجسام المضادة ، بما في ذلك الضوابط ذات الصلة في وقت واحد. للبدء، معطف الشريحة قناة ستة بإضافة 0.1٪ الجيلاتين الجلد porcine أعدت في برنامج تلفزيوني في القنوات لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.إفراغ القنوات من محلول الجيلاتين والبذور Huvecs في الشرائح قبل ترميز ست قنوات في كثافة 2.5 مرات 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر في 30 ميكرولتر من M199 المتوسطة كاملة. السماح للخلايا بالالتصاق لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة الرطبة. إضافة 60 ميكرولتر من M199 حذر مسبقا المتوسطة كاملة إلى كل من الخزانات.زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة يومين في حاضنة رطبة مع استبدال متوسط بعد 24 ساعة. جبل أنابيب السيليكون على وحدات السوائل، وملء الخزانات مع ما لا يقل عن 10 ملليلتر من M199 حذر مسبقا المتوسطة كاملة. قم بتوصيل الوحدات السائلة مع الأنابيب بنظام المضخة واجري التشغيل المسبق بدون خلايا لتوازن الوسط وإزالة أي هواء متبقي.قم بتوصيل القنوات المفردة على شريحة القنوات الست باستخدام أنابيب الاتصال التسلسلي. قم بتوصيل القناة الأولى والأخيرة على الشريحة بالأنابيب المثبتة على وحدة fluidics. لتعرض الخلايا لمستويات عالية من الإجهاد المطلق، وزيادة مجرد خطوة الإجهاد الحكمة مع مراحل التكيف، وتحديد الخطوات في زيادات من خمسة عسر القراءة لكل سنتيمتر مربع في 30 دقيقة.استخدم الكتل الموجودة على الأنبوب لفصل الشرائح عن المضخات بعد التعرض لإجهاد القص السائل ، وتجنب الانسكاب المتوسط في الحاضنة ، ونقل الشرائح المتدفقة على الجليد. أثناء فصل الأنبوب عن الخزانات، استخدم الإصبع لإغلاق الجانب الآخر من الخزان لتجنب محاصرة فقاعات الهواء في القناة. الحفاظ على تدفق الشريحة على الجليد، يستنشق المتوسط بعناية من الخزانات ولكن ليس من القناة التي تتواجد فيها الخلايا.غسل العينات مع 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عقيم الباردة عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني إلى خزان واحد و يستنشق بعناية من الخزان الآخر، ثم كرر لجميع القنوات. إصلاح الخلايا بإضافة 90 ميكرولتر من محلول PFA المخزنة مؤقتا 4٪ إلى نفس الخزان حيث تمت إضافة برنامج تلفزيوني واستنشاق السائل من الخزان الآخر كما هو موضح. بعد إصلاح الخلايا في جميع القنوات الست، نقل العينات من الجليد إلى درجة حرارة الغرفة، واحتضان لمدة 20 دقيقة.غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني إلى خزان واحد والحصول عليه بعناية من الخزان الآخر في جميع القنوات، مع الحرص على عدم تجفيف القنوات. إخماد الوصول PFA بإضافة 90 ميكرولتر من كلوريد الأمونيوم 15 ملليمولار المحيطة التي أعدت في برنامج تلفزيوني إلى واحد من الخزانات. يستنشق من الخزان الآخر واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق.Permeabilize الخلايا عن طريق إضافة 90 ميكرولتر من 0.3٪ تريتون X 100 أعدت في برنامج تلفزيوني في الخزان الفارغ. اسبيرات من الخزان الآخر لكل قناة واحتضان لمدة 10 دقائق، ثم غسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح من قبل. في 90 ميكرولتر من محلول منع PLA العقيم لخزان واحد.يستنشق من الجانب الآخر لكل قناة واحتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة. إضافة الأجسام المضادة الأولية في الأجسام المضادة جيش التحرير الشعبى الصينى diluent ودوامة. يستنشق بعناية حل الحجب من الخزانات والقنوات.أضف 30 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي مباشرة إلى القناة الفارغة عن طريق إمالة الشريحة أثناء إضافة الحل. كرر لجميع القنوات واحتضان في أربع درجات مئوية في غرفة رطبة بين عشية وضحاها أو في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تمييع ناقص أرنب بالإضافة إلى الماوس PLA تحقيقات 1-5 في الأجسام المضادة جيش التحرير الشعبي المخفف.غسل جميع القنوات مرتين عن طريق إضافة 90 ميكرولتر من غسل العازلة A وspirating كما هو موضح. بعد قرصنة المخزن المؤقت للغسيل ، أضف 30 ميكرولتر من محلول مسبار PLA واحتضانه في الغرفة الرطبة. تمييع العازلة ربط واحد إلى خمسة في الماء المتأين D وتمييع إنزيم ليغوس 1-40 في العازلة الربط المخفف.بعد غسل وspirating تماما غسل العازلة A، إضافة 30 ميكرولتر من محلول الربط إلى قنوات فارغة في حين يميل الشريحة، واحتضان في غرفة رطبة. تمييع العازلة تضخيم واحد إلى خمسة في الماء deionized، ثم تمييع إنزيم البوليميراز 1-80 في العازلة التضخيم المخفف على الجليد. بعد غسل واستنشاق تماما العازلة غسل A، إضافة 30 ميكرولتر من محلول تضخيم إلى قنوات فارغة في حين يميل الشريحة، واحتضانه في غرفة رطبة.تمييع DAPI واحد إلى 500 في غسل العازلة B وغسل جميع القنوات مرة واحدة عن طريق إضافة 90 ميكرولتر من DAPI التي تحتوي على غسل العازلة B، وspirating كما هو موضح لتبخير النوى. ثم غسل جميع القنوات مرة واحدة مع غسل العازلة B دون DAPI. تمييع العازلة غسل B 1-10 في الماء deionized وغسل جميع القنوات مرة واحدة مع 90 ميكرولتر من المخفف غسل العازلة B.After aspirating غسل العازلة B، إضافة على الفور 2-3 قطرات من السائل تصاعد المتوسطة إلى خزان واحد، وإمالة الشريحة لتوزيع المتوسطة المتصاعدة في جميع القنوات.تخزين العينات في أربع درجات مئوية في بيئة رطبة حتى التصوير. تعرض هوفيكس لضغوط عالية ومنخفضة. زاد إجهاد القص المنخفض من تفاعلات بروتين SMAD في السيتوسول والنوى.وأظهرت ضوابط الأجسام المضادة واحد لا لإشارات قليلة جدا، مما يثبت نجاح التجربة. أدت زيادة تركيز الأجسام المضادة إلى ارتفاع عدد أحداث جيش التحرير الشعبي لكل خلية ، ولكن تم تقليل الفرق في إشارات جيش التحرير الشعبي بين الخلايا المكشوفة عالية ومنخفضة الإجهاد. يمكن استخدام المخازن المؤقتة ذاتية الصنع للحجب وتمييع الأجسام المضادة كبديل للمخازن المؤقتة التجارية.وقد اظهر التحديد الكمى لاحداث جيش التحرير الشعبى الصينى للحلول التجارية والحلول ذاتية الصنع للعزل والحجب نفس النمط من اشارات جيش التحرير الشعبى الصينى فى المناطق الخلوية والنووية . ومع ذلك، كان العدد الإجمالي لأحداث جيش التحرير الشعبي لكل خلية أعلى مع الحلول التجارية. تم استخدام مزيج من SMAD Two/Three ، SMAD Four الأجسام المضادة حيث لم يكن الجسم المضاد SMAD Four مناسبا لتجارب الفلورة المناعية.لم يكن هناك فرق في أحداث جيش التحرير الشعبي في حالة الاختبار مقابل السيطرة ، مما يشير إلى أهمية اختيار تركيبة الأجسام المضادة الصحيحة للكشف عن أحداث جيش التحرير الشعبي. يمكن تكييف البروتوكول الموصوف للكشف عن تفاعلات مجمعات عوامل النسخ المختلفة عن SMADs وبالتالي المساعدة في فهم تنظيم الجينات في ظروف الحماية المعرضة للأثيرو و أثيرو.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

الكمي للبكتيريا الحامض الأميني كيناز Autophosphorylation باستخدام الفحص النيتروسليلوز التجليد

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

تصور التفاعل البروتين البروتين في هيولي النووية والكسور بواسطة شركة مناعي و<em&gt; في الموقع</em&gt; القرب من ربط الفحص

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

التحلل من شيف-قاعدة ني مجمع الظروف عن طريق مناسبة للاحتباس حماية المجموعات حمض عطوب

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

الكشف عن هيتيروديميريزيشن Isoforms البروتين باستخدام في الموقع قرب ربط التحليل

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

التحديد الكمي لنشاط نقص التصبغ في المختبر

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions

إعداد متوسط لزراعة الكائنات الحية الدقيقة في ظل ظروف اللاهوائية / اللاهوائية بدقة

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

القياس الكمي لانزيم A في الخلايا والانسجه

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...