Name: visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

Vi takker Dr. Maria Reichenbach og Dr. Christian Hiepen for deres støtte på flow-oprettet system og Eleanor Fox og Yunyun Xiao for kritisk at læse manuskriptet. P-L.M. blev finansieret af den internationale Max Planck Research School IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK modtog støtte fra DFG-SFB1444. Figur 1 blev oprettet ved hjælp af BioRender.

1. Cellekultur og væskeforskydningsstresseksponering
BEMÆRK: Human navlestrengeEEEE(HUVECs) blev brugt som eksempel til at studere SS induceret interaktion mellem SMAD'er. Den protokol, der er beskrevet nedenfor, kan anvendes på alle SS-responsive celletyper.
<ol><li>Coat 6-kanals dias med 0,1% porcine hudgelatine i PBS i 30 min ved 37 °C.</li>
	<li>Frø HUVECs i præ-coatede 6-kanals dias ved en densitet på 2,5 x 106 celler pr. ML i 30 μL af M199 fuld medium. BEMÆRK: Yd...

<ol>
	<li>Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+BMP+receptors:+Specificity,+activation+and+inhibition.">Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).</li><li>Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling.">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li><li>Hiepen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPR2+acts+as+a+gatekeeper+to+protect+endothelial+cells+from+increased+TGF&#946;+responses+and+altered+cell+mechanics.">BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGF&#946; responses and altered cell mechanics.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).</li><li>Hildebrandt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ActivinA+induced+SMAD1/5+Signaling+in+an+iPSC+derived+EC+model+of+Fibrodysplasia+Ossificans+Progressiva+(FOP)+can+be+rescued+by+the+drug+candidate+saracatinib.">ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+activation+state+of+the+endothelium+via+two+distinct+TGF-beta+type+I+receptors.">Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+receptor-like+kinase+(ALK)1+is+an+antagonistic+mediator+of+lateral+TGFbeta/ALK5+signaling.">Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling.</a> Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).</li><li>Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta-induced+Smad1/5+phosphorylation+in+epithelial+cells+is+mediated+by+novel+receptor+complexes+and+is+essential+for+anchorage-independent+growth.">Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).</li><li>Ramachandran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+uses+a+novel+mode+of+receptor+activation+to+phosphorylate+SMAD1/5+and+induce+epithelial-to-mesenchymal+transition.">TGF-&#946; uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition.</a> eLife. 7, 31756 (2018).</li><li>Flanders, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brightfield+proximity+ligation+assay+reveals+both+canonical+and+mixed+transforming+growth+factor-&#946;/bone+morphogenetic+protein+Smad+signaling+complexes+in+tissue+sections.">Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-&#946;/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).</li><li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).</li><li>Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+in+vascular+homeostasis+and+disease.">Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).</li><li>Cai, J., Pardali, E., S&#225;nchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+vascular+diseases.">BMP signaling in vascular diseases.</a> FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).</li><li>Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulated+TGF-&#946;/BMP+signaling+in+vascular+malformations.">Deregulated TGF-&#946;/BMP signaling in vascular malformations.</a> Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).</li><li>MacCarrick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loeys-Dietz+syndrome:+a+primer+for+diagnosis+and+management.">Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management.</a> Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Min, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Smad+2/3+signaling+by+low+shear+stress+mediates+artery+inward+remodeling.">Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling.</a> bioRxiv. , 691980 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+receptor-integrin+interaction+mediates+responses+of+vascular+endothelial+Smad1/5+and+proliferation+to+disturbed+flow.">BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-specific+activation+of+Smad1/5+regulates+vascular+endothelial+cell+cycle+progression+in+response+to+disturbed+flow.">Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).</li><li>van Dijk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+TGF-&#946;+and+BMP+signaling+in+human+atherosclerosis:+A+histological+evaluation+based+on+Smad+activation.">Visualizing TGF-&#946; and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation.</a> Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).</li><li>Derwall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+bone+morphogenetic+protein+signaling+reduces+vascular+calcification+and+atherosclerosis.">Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Alam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+Assay+(PLA).">Proximity Ligation Assay (PLA).</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).</li><li>Application Note 03: Growing Cells in &#181;-Channels. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf</a> (2012)</li><li>Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf</a> (2019)</li><li>ibidi. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Note+31:+Instructions+&#181;-Slide+VI+0.4.">Application Note 31: Instructions &#181;-Slide VI 0.4.</a> ibidi. , (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reichenbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+impact+of+fluid+shear+stress+and+YAP/TAZ+on+BMP/TGF-&#946;+induced+osteogenic+target+genes.">Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-&#946; induced osteogenic target genes.</a> Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).</li><li>Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+takes+two+to+tango:+Endothelial+TGF&#946;/BMP+signaling+crosstalk+with+mechanobiology.">It takes two to tango: Endothelial TGF&#946;/BMP signaling crosstalk with mechanobiology.</a> Cells. 9 (9), 1965 (2020).</li></ol>

Den PLA-baserede protokol, der er beskrevet her, tilbyder en effektiv måde at bestemme nærheden af to proteiner (f.eks. deres direkte interaktion) i ECs udsat for forskydningsstress med kvantitativ og rumlig opløsning. Ved at bruge flow slides med flere parallelle kanaler, flere forskellige protein interaktioner kan undersøges på samme tid i celler under identiske mekaniske forhold. I modsætning hertil gør specialbyggede flowkammersystemer ofte brug af en enkelt kanal, der er bygget op omkring en glasdækslede, hv...

Proteiner af de transformerende vækstfaktorer beta (TGFβ) superfamily er pleiotropiske cytokiner med en række medlemmer, herunder TGFβs, knoglemorfogenetiske proteiner (BMB'er) og Activins1,2. Ligandbinding fremkalder dannelsen af receptor oligomerer, der fører til fosforylering og dermed aktivering af cytosolic reguleringsmæssig SMAD (R-SMAD). Afhængigt af ligandernes underfamilie aktiveres forskellige R-SMAD'er1,2. Mens TGFβs og Activins hovedsagelig fremkalder fosforylering af SMAD2/3, fremkalder BMB'er SMAD1/5/8 fosforylering. Der er imidlertid akkumulerende beviser for, at BMPs og TGFβs/Activins også aktiverer R-SMAD'er for den respektive anden underfamilie i en proces, der betegnes som »lateral signalering«3,4,5,6,7,8, og at der er blandede SMAD-komplekser bestående af både SMAD1/5 og SMAD2/3, medlemmer3,9 . To aktiverede R-SMAD'er danner efterfølgende trimeriske komplekser med den fælles mægler SMAD4. Disse transskription faktor komplekser er derefter i stand til at translokere ind i kernen og regulere transskription af mål gener. SMAD'er kan interagere med en række forskellige transskriptionskoaktiveringatorer og co-repressorer, hvilket fører til diversificering af mulighederne for at regulere målgener10. Deregulering af SMAD-signalering har alvorlige konsekvenser for en række sygdomme. I overensstemmelse med dette, ubalanceret TGFβ/BMP signalering kan føre til alvorlige vaskulære patologier, såsom lungepulsåren hypertension, arvelig hæmoragisk telangiectasia, eller åreforkalkning3,11,12,13,14.
Endotelceller (ECs) danner det inderste lag af blodkar og udsættes derfor for forskydningsstress (SS), en friktionskraft udøvet af blodets tyktflydende strøm. Interessant nok holdes ECs, der er bosiddende på de dele af vaskulaturen, som udsættes for høje niveauer af ensartet, laminar SS, i en homøostatisk og quiescent tilstand. I modsætning hertil er ECs, der oplever lav, ikke-ensartet SS, f.eks. ved bifurcations eller den mindre krumning af aortabuen, proliferative og aktiverer inflammatoriske veje15. Til gengæld er steder med dysfunktionelle ECs tilbøjelige til at udvikle åreforkalkning. Interessant nok viser ECs i disse atheroprone områder afvigende høje niveauer af aktiveret SMAD2/3 og SMAD1/516,17,18. I denne sammenhæng viste det sig, at forbedret TGFβ/BMP-signalering var en tidlig hændelse i udviklingen af aterosklerotiske læsioner19, og interferens med BMP-signalering viste sig at reducere vaskulær betændelse, ateromadannelse og tilhørende forkalkning20.
Proximity Ligation Assay (PLA) er en biokemisk teknik til at studere protein-protein interaktioner in situ21,22. Det er afhængig af specificiteten af antistoffer af forskellige arter, der kan binde målproteiner af interesse, hvilket giver mulighed for meget specifik påvisning af endogene proteininteraktioner på et enkeltcellet niveau. Her skal primære antistoffer binde sig til deres mål epitope i en afstand af mindre end 40 nm for at give mulighed for detektion23. Derfor er PLA i høj grad gavnlig i forhold til traditionelle co-immunprecipitation tilgange, hvor flere millioner celler er nødvendige for at opdage endogene protein interaktioner. I PLA binder artsspecifikke sekundære antistoffer, der er kovalent forbundet med DNA-fragmenter (såkaldte Plus- og Minus-sonder), de primære antistoffer, og hvis interesseproteinerne interagerer, kommer Plus- og Minus-sonder tæt på. DNA'et bliver ligated i det følgende trin, og den rullende cirkelforstærkning af det cirkulære DNA er muliggjort. Under forstærkning binder fluorescerende mærkede komplementære oligoukleotider sig til det syntetiserede DNA, hvilket gør det muligt at visualisere disse proteininteraktioner ved konventionel fluorescensmikroskopi.
Den protokol, der er beskrevet her, gør det muligt for forskere kvantitativt at sammenligne antallet af aktive SMAD transskriptionskomplekser ved atheroprotive og atheroprone SS-tilstande in vitro ved hjælp af PLA. SS genereres via et programmerbart pneumatisk pumpesystem, der er i stand til at generere laminar ensrettet strøm af definerede niveauer og tillader trinvise stigninger i flowhastigheder. Denne metode gør det muligt at påektionere interaktioner mellem SMAD1/5 eller SMAD2/3 med SMAD4 samt blandede R-SMAD-komplekser. Det kan nemt udvides til at analysere interaktioner af SMADs med transskriptionelle medregulatorer eller til transskriptionsfaktorkomplekser bortset fra SMAD'er. Figur 1 viser de vigtigste trin i protokollen nedenfor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk repræsentation af den beskrevne protokol. (A) Celler, der er sået i 6-kanals dias, udsættes for forskydningsstress med et pneumatisk pumpesystem. (B) Faste celler anvendes til PLA-eksperiment eller til kontrolbetingelser. (C) Billeder af PLA eksperimenter er erhvervet med en fluorescens mikroskop og analyseres ved hjælp af ImageJ analyse software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80606</td>
			<td>6-channel slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K298.1</td>
			<td>Quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.4</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stain DNA/Nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td>PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>MINUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>PLUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>PLA wash buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium (ECGS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf Serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4% buffered</td>
			<td>KLINIPATH/VWR</td>
			<td>VWRK4186.BO1</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&#160; 25 &#181;g/mL Hep +&#160;&#160; 50 &#181;g/mL ECGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, Type A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td>Use 0.1% in PBS for coating of flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v.7</td>
			<td>GarphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Program used for the Plots and statistical calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>supplement for medium (Hep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVECs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Mounting Medium</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Liquid mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Pump System</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>pneumatic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-80100</td>
			<td>supplement for medium (L-Glu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2154</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53745</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD2/3 Antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610843</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with CST 9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mousee anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Sanata Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7966</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>supplement for medium (P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set WHITE</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10963</td>
			<td>Tubings used for 1 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set YELLOW and GREEN</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Tubings used for 30 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9516</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>8685</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9515</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with BD 610843</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial Connector for &#181;-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10830</td>
			<td>serial connection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6683.1</td>
			<td>Permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay

Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signalering er stramt reguleret og afbalanceret under udvikling og homøostase i vaskulatsystemet Derfor resulterer deregulering i denne signalvej i alvorlige vaskulære patologier, såsom lungepulsåren hypertension, arvelig hæmoragisk telangiectasia og åreforkalkning. Endotelceller (ECs), som det inderste lag af blodkar, er konstant udsat for væskeforskydning stress (SS). Unormale mønstre af væske SS har vist sig at forbedre TGFβ/BMP signalering, som sammen med andre stimuli fremkalder åreogenese. I forbindelse med dette, atheroprone, lav laminar SS blev fundet at forbedre TGFβ / BMP signalering mens atheroprotective, høj laminar SS, mindsker denne signalering. For effektivt at analysere aktiveringen af disse veje designede vi en arbejdsgang for at undersøge dannelsen af transskriptionsfaktorkomplekser under lav laminar SS og høje laminar SS-forhold ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt pneumatisk pumpesystem og nærhed ligation assay (PLA).
Aktiv TGFβ/BMP-signalering kræver dannelse af trimeriske SMAD-komplekser bestående af to regulatoriske SMAD'er (R-SMAD); SMAD2/3 og SMAD1/5/8 for henholdsvis TGFβ- og BMP-signalering) med en fælles mægler SMAD (co-SMAD; SMAD4). Ved hjælp af PLA rettet mod forskellige underenheder af trimerisk SMAD-kompleks, dvs. enten R-SMAD/co-SMAD eller R-SMAD/R-SMAD, kan dannelsen af aktive SMAD transskriptionsfaktorkomplekser måles kvantitativt og rumligt ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
Brugen af flow slides med 6 små parallelle kanaler, der kan tilsluttes i serier, giver mulighed for undersøgelse af transskription faktor kompleks dannelse og inddragelse af nødvendige kontroller. 
Arbejdsgangen forklaret her kan let tilpasses til undersøgelser rettet mod nærheden af SMADs til andre transskription faktorer eller til transskription faktor komplekser andre end SMADs, i forskellige flydende SS betingelser. Den arbejdsgang, der præsenteres her, viser en hurtig og effektiv måde at studere den flydende SS inducerede TGFβ/BMP-signalering i ECs, både kvantitativt og rumligt.

Vi har tidligere brugt PLA til at opdage interaktioner af forskellige SMAD proteiner3 og analyseret forskydningsstress induceret ændringer i SMAD fosforylering28.
Her blev begge metoder kombineret med den protokol, der er beskrevet ovenfor. HUVECs blev udsat for forskydningsstress på 1 dyn/cm2 og 30 dyn/cm2 og analyseret for interaktioner af SMAD transskriptionsfaktorer. Vi viser, at sammenlignet med den høje forskydnings...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

Visualization and Quantification of TGFÃƒÅ½Ã‚Â²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Her etablerer vi en protokol til samtidig at visualisere og analysere flere SMAD-komplekser ved hjælp af nærhed ligation assay (PLA) i endotelceller udsat for patologiske og fysiologiske væskeforskydningsstress betingelser.

Visualisering og kvantificering af TGFβ/BMP/SMAD Signalering under forskellige væskeforskydningsstress ved hjælp af proximity-ligation-assay

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Denne protokol gør det muligt for forskere kvantitativt at sammenligne antallet af transskriptionsfaktorkomplekser under forskellige forskydningsstress betingelser og vil være gavnlig for forskning i vaskulær biologi. Den største fordel ved denne protokol er brugen af mikrofluidiske flowkanaler, der tillader undersøgelser af flere antistofpar, herunder de respektive kontroller samtidigt. Til at begynde med skal du belægge de seks kanalslide ved at tilføje 0,1% svinskindsgelatine tilberedt i PBS i kanalerne i 30 minutter ved 37 grader Celsius.Tøm kanalerne fra gelatineopløsningen og frø Huvecs i de forkodede sekskanals dias med en densitet på 2,5 gange 10 til den sjette celle pr. milliliter i 30 mikroliter af M199 komplet medium. Lad cellerne klæbe i en time ved 37 grader Celsius i den befugtede inkubator. Tilføj 60 mikroliter af præ-advarede M199 komplet medium til hver af reservoirerne.Kultur cellerne ved 37 grader Celsius i to dage i en befugtet inkubator med medium udskiftning efter 24 timer. Monter siliciumslangen på de flydende enheder, fyld reservoirerne med mindst 10 milliliter forforvaret M199 komplet medium. Tilslut de fluidiske enheder med slanger til pumpesystemet og udfør pre-run uden celler til ekvilibrering af mediet og fjerne eventuelle resterende luft.Tilslut de enkelte kanaler på de seks kanaler slide ved hjælp af den serielle forbindelse slanger. Tilslut den første og sidste kanal på diaset til rørene monteret på fluidics enheden. For eksponering af cellerne til høje niveauer af ren stress, øge den rene stress trin klogt med tilpasning faser, indstilling af trin i intervaller på fem dyner per kvadratcentimeter pr 30 minutter.Brug klumperne på slangen til at løsne diasene fra pumper efter væske forskydningsstresseksponering, undgå medium spild i inkubatoren og overføre flow slides på is. Mens du løsner slangen fra reservoirerne, skal du bruge fingeren til at lukke den anden side af reservoiret for at undgå at fange luftboblerne i kanalen. Hold flow slide på is, aspirere mediet omhyggeligt fra reservoirerne, men ikke fra den kanal, hvor cellerne bor.Vask prøverne med 90 mikroliter kold steril PBS ved at tilføje PBS til det ene reservoir og aspirere forsigtigt fra det andet reservoir, og gentag derefter for alle kanaler. Fastgør cellerne ved at tilsætte 90 mikroliter buffered 4% PFA-opløsning til det samme reservoir, hvor PBS blev tilsat og aspirere væsken fra det andet reservoir som demonstreret. Når cellerne er rettet i alle seks kanaler, overføres prøverne fra is til stuetemperatur og inkuberes i 20 minutter.Vask cellerne tre gange med PBS ved at tilføje PBS til et reservoir og aspirere det omhyggeligt fra det andet reservoir i alle kanaler, idet du sørger for ikke at tørre kanalerne ud. Sluk adgang PFA ved at tilføje 90 mikroliter af omgivende 15 millimolar ammoniumchlorid tilberedt i PBS til et af reservoirerne. Aspirere fra det andet reservoir og inkubere cellerne i 10 minutter.Permeabilize cellerne ved at tilføje 90 mikroliter af 0,3% Triton X 100 tilberedt i PBS i det tomme reservoir. Aspirere fra det andet reservoir for hver kanal og inkubere i 10 minutter, derefter vaskes tre gange med PBS som påvist før. Ved 90 mikroliter steril PLA-blokeringsopløsning til et reservoir.Aspirere fra den anden side for hver kanal og inkubere i en time ved 37 grader Celsius i et befugtet kammer. Tilsæt primære antistoffer i PLA antistof fortyndingsstof og vortex. Opsnæm forsigtigt blokeringsopløsningen fra reservoirerne og kanalerne.Tilsæt 30 mikroliter af den primære antistofopløsning straks i den tomme kanal ved at vippe diaset, mens opløsningen tilføjes. Gentag for alle kanaler og inkuber ved fire grader Celsius i det befugtede kammer natten over eller ved 37 grader Celsius i en time. Fortynd minus kanin og plus mus PLA sonder en til fem i PLA antistof fortyndingsstof.Vask alle kanalerne to gange ved at tilføje 90 mikroliter af vaskebuffer A og aspirere som demonstreret. Efter indsugning af vaskebufferen tilsættes 30 mikroliter PLA-sondeopløsning og inkuberes i det befugtede kammer. Fortynd ligationsbufferen en til fem i D ioniseret vand og fortynd lygusenzymet en til 40 i den fortyndede ligationsbuffer.Efter vask og helt indsugning af vaskebufferen A tilsættes 30 mikroliter ligationsopløsning til de tomme kanaler, mens du vipper diaset, og inkuberes i det befugtede kammer. Fortynd forstærkningsbufferen en til fem i deioniseret vand, fortynd derefter polymeraseenzymet en til 80 i den fortyndede forstærkningsbuffer på is. Efter vask og helt indsugning af vaskebufferen A tilsættes 30 mikroliter forstærkningsopløsning til de tomme kanaler, mens du vipper diaset, og inkuberes det i det befugtede kammer.Fortynd DAPI en til 500 i vaskebuffer B og vask alle kanaler én gang ved at tilsætte 90 mikroliter DAPI indeholdende vaskebuffer B og aspirere som vist at dampe kernerne. Vask derefter alle kanalerne én gang med vaskebuffer B uden DAPI. Fortynd vaskebuffer B 1 til 10 i deioniseret vand og vask alle kanaler én gang med 90 mikroliter fortyndet vaskebuffer B.Efter indsugning af vaskebuffer B tilsættes straks to til tre dråber af det flydende monteringsmedium til et reservoir og vip diaset for at fordele monteringsmediet i alle kanaler.Opbevar prøverne ved fire grader Celsius i et befugtet miljø, indtil billeddannelse. Huvecs blev udsat for høj og lav ren stress. Den lave forskydningsstress øgede SMAD-proteininteraktioner i cytosolen og kernerne.Enkelt antistof kontrol viste nej til meget få signaler, der beviser succes eksperimentet. Øget antistofkoncentration resulterede i et højere antal PLA-hændelser pr. celle, men forskellen i PLA-signaler mellem høje og lave belastningsudtryks eksponerede celler blev reduceret. Selvfremstillede buffere til blokering og antistoffortynding kan bruges som et alternativ til kommercielle buffere.Kvantificeringen af PLA-begivenheder for kommercielle og selvfremstillede fortyndings- og blokeringsløsninger viste det samme mønster af PLA-signaler i de cytosolic og nukleare områder. Det samlede antal PLA-hændelser pr. celle var imidlertid højere med kommercielle løsninger. En kombination af SMAD Two/Three, SMAD Fire antistoffer blev anvendt, hvor SMAD Four antistof ikke var egnet til immunfluorescenceforsøg.Der var ingen forskel i PLA-hændelser i den eksperimentelle versus kontroltilstand, hvilket indikerer vigtigheden af at vælge den korrekte antistofkombination til at opdage PLA-hændelserne. Den beskrevne protokol kan tilpasses til at opdage samspillet mellem transskription faktor komplekser forskellig fra SMADs og derfor hjælpe med at forstå genregulering i athero tilbøjelige og athero beskyttende forhold.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantificering af Bakteriel Histidin kinase Autophosphorylering Ved hjælp af en Nitrocellulose-bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisering af protein-protein interaktion i nukleare og Cytoplasmiske Brøker af Co-immunopræcipitation og<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligeringsassayet

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolyseprodukter af en Ni-Schiff-Base Complex Brug af betingelser egnet til Bevarelse af syrelabile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Påvisning af Heterodimerization af Protein isoformer ved hjælp af en in Situ nærhed ligatur Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantificering af Protein Homo-oligomerisering ved hjælp af kommercielle instrumentering og gratis, Open Source lysstyrke analyse Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantificering af hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantificering af protein interaktions netværk dynamik ved hjælp af Multiplexed Co-Immunopræcipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions

Medium forberedelse til dyrkning af mikroorganismer under strengt anaerobe/anoxiske forhold

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantificering af coenzym A i celler og væv

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...