Name: visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

We bedanken Dr. Maria Reichenbach en Dr. Christian Hiepen voor hun steun aan het flow-set-up systeem en Eleanor Fox en Yunyun Xiao voor het kritisch lezen van het manuscript. P-L.M. werd gefinancierd door de internationale Max Planck Research School IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK ontving financiering van de DFG-SFB1444. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.

1. Blootstelling aan celkweek en vloeistofafschuivingsstress
OPMERKING: Humane navelstrengader EC's (HUVECs) werden gebruikt als voorbeeld om SS-geïnduceerde interactie van SMADs te bestuderen. Het hieronder beschreven protocol kan worden toegepast op elk SS-responsief celtype.
<ol><li>Bestrijk 6-kanaals dia met 0,1% varkenshuidgelatine in PBS gedurende 30 min bij 37 °C.</li>
	<li>Zaad HUVECs in voorgecoate 6-kanaals dia's met een dichtheid van 2,5 x 106 cellen per ml in 30 μL ...

<ol>
	<li>Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+BMP+receptors:+Specificity,+activation+and+inhibition.">Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).</li><li>Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling.">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li><li>Hiepen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPR2+acts+as+a+gatekeeper+to+protect+endothelial+cells+from+increased+TGF&#946;+responses+and+altered+cell+mechanics.">BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGF&#946; responses and altered cell mechanics.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).</li><li>Hildebrandt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ActivinA+induced+SMAD1/5+Signaling+in+an+iPSC+derived+EC+model+of+Fibrodysplasia+Ossificans+Progressiva+(FOP)+can+be+rescued+by+the+drug+candidate+saracatinib.">ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+activation+state+of+the+endothelium+via+two+distinct+TGF-beta+type+I+receptors.">Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+receptor-like+kinase+(ALK)1+is+an+antagonistic+mediator+of+lateral+TGFbeta/ALK5+signaling.">Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling.</a> Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).</li><li>Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta-induced+Smad1/5+phosphorylation+in+epithelial+cells+is+mediated+by+novel+receptor+complexes+and+is+essential+for+anchorage-independent+growth.">Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).</li><li>Ramachandran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+uses+a+novel+mode+of+receptor+activation+to+phosphorylate+SMAD1/5+and+induce+epithelial-to-mesenchymal+transition.">TGF-&#946; uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition.</a> eLife. 7, 31756 (2018).</li><li>Flanders, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brightfield+proximity+ligation+assay+reveals+both+canonical+and+mixed+transforming+growth+factor-&#946;/bone+morphogenetic+protein+Smad+signaling+complexes+in+tissue+sections.">Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-&#946;/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).</li><li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).</li><li>Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+in+vascular+homeostasis+and+disease.">Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).</li><li>Cai, J., Pardali, E., S&#225;nchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+vascular+diseases.">BMP signaling in vascular diseases.</a> FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).</li><li>Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulated+TGF-&#946;/BMP+signaling+in+vascular+malformations.">Deregulated TGF-&#946;/BMP signaling in vascular malformations.</a> Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).</li><li>MacCarrick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loeys-Dietz+syndrome:+a+primer+for+diagnosis+and+management.">Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management.</a> Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Min, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Smad+2/3+signaling+by+low+shear+stress+mediates+artery+inward+remodeling.">Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling.</a> bioRxiv. , 691980 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+receptor-integrin+interaction+mediates+responses+of+vascular+endothelial+Smad1/5+and+proliferation+to+disturbed+flow.">BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-specific+activation+of+Smad1/5+regulates+vascular+endothelial+cell+cycle+progression+in+response+to+disturbed+flow.">Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).</li><li>van Dijk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+TGF-&#946;+and+BMP+signaling+in+human+atherosclerosis:+A+histological+evaluation+based+on+Smad+activation.">Visualizing TGF-&#946; and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation.</a> Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).</li><li>Derwall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+bone+morphogenetic+protein+signaling+reduces+vascular+calcification+and+atherosclerosis.">Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Alam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+Assay+(PLA).">Proximity Ligation Assay (PLA).</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).</li><li>Application Note 03: Growing Cells in &#181;-Channels. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf</a> (2012)</li><li>Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf</a> (2019)</li><li>ibidi. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Note+31:+Instructions+&#181;-Slide+VI+0.4.">Application Note 31: Instructions &#181;-Slide VI 0.4.</a> ibidi. , (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reichenbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+impact+of+fluid+shear+stress+and+YAP/TAZ+on+BMP/TGF-&#946;+induced+osteogenic+target+genes.">Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-&#946; induced osteogenic target genes.</a> Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).</li><li>Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+takes+two+to+tango:+Endothelial+TGF&#946;/BMP+signaling+crosstalk+with+mechanobiology.">It takes two to tango: Endothelial TGF&#946;/BMP signaling crosstalk with mechanobiology.</a> Cells. 9 (9), 1965 (2020).</li></ol>

Het hier beschreven OP PLA gebaseerde protocol biedt een efficiënte manier om de nabijheid van twee eiwitten (bijvoorbeeld hun directe interactie) te bepalen in EC's die zijn blootgesteld aan schuifspanning met kwantitatieve en ruimtelijke resolutie. Door gebruik te maken van flowglaasjes met meerdere parallelle kanalen kunnen verschillende eiwitinteracties tegelijkertijd worden onderzocht in cellen onder identieke mechanische omstandigheden. Op maat gemaakte stroomkamersystemen maken daarentegen vaak gebruik van een en...

Eiwitten van de transforming growth factors beta (TGFβ) superfamilie zijn pleiotrope cytokines met een verscheidenheid aan leden, waaronder TGFβs, botmorfogenetische eiwitten (BMP's) en Activinen1,2. Ligandbinding induceert de vorming van receptor oligomeren die leiden tot de fosforylering en daarmee activering van cytosolische regulerende SMAD (R-SMAD). Afhankelijk van de subfamilie van liganden worden verschillende R-SMADs geactiveerd1,2. Terwijl TGFβs en Activins voornamelijk fosforylering van SMAD2/3 induceren, induceren BMP's SMAD1/5/8 fosforylering. Er zijn echter steeds meer aanwijzingen dat BMP's en TGFβs/Activinen ook R-SMADs van de respectieve andere subfamilie activeren, in een proces dat wordt aangeduid als 'laterale signalering'3,4,5,6,7,8 en dat er gemengde SMAD-complexen zijn die bestaan uit zowel SMAD1/5 als SMAD2/3, leden3,9 . Twee geactiveerde R-SMADs vormen vervolgens trimerische complexen met de gemeenschappelijke mediator SMAD4. Deze transcriptiefactorcomplexen zijn vervolgens in staat om naar de kern te transloceren en de transcriptie van doelgenen te reguleren. SMADs kunnen interageren met een verscheidenheid aan verschillende transcriptionele co-activatoren en co-repressoren, wat leidt tot de diversificatie van de mogelijkheden om doelgenen te reguleren10. Deregulering van SMAD-signalering heeft ernstige gevolgen voor een verscheidenheid aan ziekten. In lijn hiermee kan onevenwichtige TGFβ / BMP-signalering leiden tot ernstige vasculaire pathologieën, zoals pulmonale arteriële hypertensie, erfelijke hemorragische teleangiëctasie of atherosclerose3,11,12,13,14.
Endotheelcellen (EC's) vormen de binnenste laag van bloedvaten en worden daarom blootgesteld aan schuifspanning (SS), een wrijvingskracht die wordt uitgeoefend door de viskeuze bloedstroom. Interessant is dat EC's die zich bevinden in de delen van de vasculatuur, die worden blootgesteld aan hoge niveaus van uniforme, laminaire SS, in een homeostatische en rustige toestand worden gehouden. Daarentegen zijn EC's die lage, niet-uniforme SS ervaren, bijvoorbeeld bij bifurcaties of de kleinere kromming van de aortaboog, proliferatief en activeren ontstekingsroutes15. Op hun beurt zijn plaatsen van disfunctionele EC's vatbaar voor het ontwikkelen van atherosclerose. Interessant is dat EC's in deze atheroprone gebieden afwijkend hoge niveaus van geactiveerde SMAD2 / 3 en SMAD1 / 516, 17,18 vertonen. In deze context bleek verbeterde TGFβ/BMP-signalering een vroege gebeurtenis te zijn in de ontwikkeling van atherosclerotische laesies19 en interferentie met BMP-signalering bleek vasculaire ontsteking, atheromavorming en bijbehorende calcificatie aanzienlijk te verminderen20.
Proximity Ligation Assay (PLA) is een biochemische techniek om eiwit-eiwit interacties in situ21,22 te bestuderen. Het is gebaseerd op de specificiteit van antilichamen van verschillende soorten die doeleiwitten van belang kunnen binden, waardoor zeer specifieke detectie van endogene eiwitinteracties op eencellig niveau mogelijk is. Hier moeten primaire antilichamen zich binden aan hun doelepithop op een afstand van minder dan 40 nm om de detectie mogelijk te maken23. Daarom is PLA zeer gunstig ten opzichte van traditionele co-immunoprecipitatiebenaderingen, waarbij enkele miljoenen cellen nodig zijn om endogene eiwitinteracties te detecteren. In PLA binden soortspecifieke secundaire antilichamen, covalent gekoppeld aan DNA-fragmenten (plus- en minus-sondes genoemd), de primaire antilichamen en als de eiwitten van belang op elkaar inwerken, komen plus- en minus-sondes in de buurt. Het DNA wordt in de volgende stap geligeerd en de rollende cirkelversterking van het circulaire DNA wordt mogelijk gemaakt. Tijdens amplificatie binden fluorescerend gelabelde complementaire oligonucleotiden aan het gesynthetiseerde DNA, waardoor deze eiwitinteracties kunnen worden gevisualiseerd door conventionele fluorescentiemicroscopie.
Het hier beschreven protocol stelt wetenschappers in staat om het aantal actieve SMAD-transcriptiecomplexen bij atheroprotectieve en atheroprone SS-condities in vitro kwantitatief te vergelijken met behulp van PLA. RVS wordt gegenereerd via een programmeerbaar pneumatisch pompsysteem dat in staat is om laminaire unidirectionele stroom van gedefinieerde niveaus te genereren en stapsgewijze verhogingen van debieten mogelijk maakt. Deze methode maakt het mogelijk om interacties tussen SMAD1/5 of SMAD2/3 met SMAD4 te detecteren, evenals gemengde R-SMAD-complexen. Het kan eenvoudig worden uitgebreid om interacties van SMADs met transcriptionele co-regulatoren te analyseren of om transcriptiefactorcomplexen anders dan SMADs te analyseren. Figuur 1 toont de belangrijkste stappen van het protocol hieronder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van het beschreven protocol. (A) Cellen gezaaid in 6-kanaals dia's worden blootgesteld aan schuifspanning met een pneumatisch pompsysteem. (B) Vaste cellen worden gebruikt voor PLA-experimenten of voor controleomstandigheden. (C) Beelden van PLA-experimenten worden verkregen met een fluorescentiemicroscoop en worden geanalyseerd met behulp van ImageJ-analysesoftware. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80606</td>
			<td>6-channel slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K298.1</td>
			<td>Quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.4</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stain DNA/Nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td>PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>MINUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>PLUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>PLA wash buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium (ECGS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf Serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4% buffered</td>
			<td>KLINIPATH/VWR</td>
			<td>VWRK4186.BO1</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&#160; 25 &#181;g/mL Hep +&#160;&#160; 50 &#181;g/mL ECGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, Type A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td>Use 0.1% in PBS for coating of flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v.7</td>
			<td>GarphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Program used for the Plots and statistical calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>supplement for medium (Hep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVECs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Mounting Medium</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Liquid mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Pump System</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>pneumatic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-80100</td>
			<td>supplement for medium (L-Glu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2154</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53745</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD2/3 Antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610843</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with CST 9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mousee anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Sanata Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7966</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>supplement for medium (P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set WHITE</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10963</td>
			<td>Tubings used for 1 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set YELLOW and GREEN</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Tubings used for 30 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9516</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>8685</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9515</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with BD 610843</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial Connector for &#181;-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10830</td>
			<td>serial connection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6683.1</td>
			<td>Permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay

Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signalering is strak gereguleerd en gebalanceerd tijdens de ontwikkeling en homeostase van het vasculatuursysteem Daarom resulteert deregulering in deze signaleringsroute in ernstige vasculaire pathologieën, zoals pulmonale arterie hypertensie, erfelijke hemorragische teleangiëctasie en atherosclerose. Endotheelcellen (EC's), als de binnenste laag van bloedvaten, worden voortdurend blootgesteld aan vloeistofschuifstress (SS). Van abnormale patronen van vloeibare SS is aangetoond dat ze de TGFβ / BMP-signalering verbeteren, die, samen met andere stimuli, atherogenese induceren. In verband hiermee bleek atheroprone, lage laminaire SS de TGFβ/BMP-signalering te verbeteren, terwijl atheroprotectieve, hoge laminaire SS deze signalering vermindert. Om de activering van deze paden efficiënt te analyseren, hebben we een workflow ontworpen om de vorming van transcriptiefactorcomplexen onder lage laminaire SS- en hoge laminaire SS-omstandigheden te onderzoeken met behulp van een in de handel verkrijgbaar pneumatisch pompsysteem en nabijheidsligatietest (PLA).
Actieve TGFβ/BMP-signalering vereist de vorming van trimerische SMAD-complexen bestaande uit twee regulerende SMADs (R-SMAD); SMAD2/3 en SMAD1/5/8 voor respectievelijk TGFβ- en BMP-signalering) met een gemeenschappelijke bemiddelaar SMAD (co-SMAD; SMAD4). Met behulp van PLA gericht op verschillende subeenheden van het trimerische SMAD-complex, d.w.z. R-SMAD / co-SMAD of R-SMAD / R-SMAD, kan de vorming van actieve SMAD-transcriptiefactorcomplexen kwantitatief en ruimtelijk worden gemeten met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Het gebruik van stromingsdia's met 6 kleine parallelle kanalen, die in serie kunnen worden aangesloten, maakt het mogelijk om de transcriptiefactorcomplexvorming te onderzoeken en noodzakelijke controles op te nemen. 
De hier uitgelegde workflow kan eenvoudig worden aangepast voor studies die gericht zijn op de nabijheid van SMADs tot andere transcriptiefactoren of tot transcriptiefactorcomplexen anders dan SMADs, in verschillende vloeibare SS-omstandigheden. De hier gepresenteerde workflow toont een snelle en effectieve manier om de vloeistof SS geïnduceerde TGFβ / BMP-signalering in EC's te bestuderen, zowel kwantitatief als ruimtelijk.

We hebben eerder PLA gebruikt om interacties van verschillende SMAD-eiwitten te detecteren3 en door schuifspanning veroorzaakte veranderingen in SMAD-fosforylering28 geanalyseerd.
Hier werden beide methoden gecombineerd met het hierboven beschreven protocol. HUVECs werden onderworpen aan schuifspanning van 1 dyn/cm2 en 30 dyn/cm2 en geanalyseerd op interacties van SMAD transcriptiefactoren. We tonen aan dat, in vergelijking ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

Visualization and Quantification of TGFÃƒÅ½Ã‚Â²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Hier stellen we een protocol op om tegelijkertijd meerdere SMAD-complexen te visualiseren en te analyseren met behulp van proximity ligation assay (PLA) in endotheelcellen die worden blootgesteld aan pathologische en fysiologische vloeistofafschuifstressomstandigheden.

Visualisatie en kwantificering van TGFβ/BMP/SMAD-signalering onder verschillende vloeistofafschuifstressomstandigheden met behulp van proximity-ligation-assay

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Dit protocol stelt wetenschappers in staat om het aantal transcriptiefactorcomplexen onder verschillende afschuifstressomstandigheden kwantitatief te vergelijken en zal gunstig zijn voor onderzoek in de vasculaire biologie. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is het gebruik van microfluïdische stroomkanalen die onderzoek van verschillende antilichaamparen mogelijk maken, inclusief de respectieve controles tegelijkertijd. Om te beginnen, coat de zeskanaals dia door 0,1% varkenshuidgelatine bereid in PBS toe te voegen aan de kanalen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.Leeg de kanalen van de gelatine-oplossing en zaad Huvecs in de voorgecodeerde zes kanaalglaasjes met een dichtheid van 2,5 maal 10 tot de zesde cel per milliliter in 30 microliter M199 volledig medium. Laat de cellen een uur lang hechten bij 37 graden Celsius in de bevochtigde couveuse. Voeg 60 microliter vooraf gewaarschuwd M199 compleet medium toe aan elk van de reservoirs.Kweek de cellen bij 37 graden Celsius gedurende twee dagen in een bevochtigde incubator met medium vervanging na 24 uur. Monteer de siliconenbuizen op de vloeistofeenheden, vul de reservoirs met minimaal 10 milliliter vooraf gewaarschuwd M199 compleet medium. Sluit de vloeistofeenheden met slangen aan op het pompsysteem en voer de voorloop uit zonder cellen voor het in evenwicht brengen van het medium en het verwijderen van resterende lucht.Sluit de afzonderlijke kanalen op de zes kanalen schuif aan met behulp van de seriële verbindingsslang. Sluit het eerste en laatste kanaal op de schuif aan op de buizen die op de fluidics-eenheid zijn gemonteerd. Voor blootstelling van de cellen aan hoge niveaus van pure stress, verhoog de pure stress stapsgewijs met aanpassingsfasen, waarbij de stappen worden ingesteld in stappen van vijf kleurstoffen per vierkante centimeter per 30 minuten.Gebruik de klonten op de slang om de glijbanen los te maken van pompen na blootstelling aan vloeistofschuifspanning, om medium morsen in de incubator te voorkomen en stroomglijbanen op ijs over te brengen. Gebruik tijdens het losmaken van de buizen van de reservoirs de vinger om de andere kant van het reservoir te sluiten om te voorkomen dat de luchtbellen in het kanaal worden opgesloten. Houd de stroom op ijs glijden, zuig het medium voorzichtig op uit de reservoirs, maar niet uit het kanaal waar de cellen zich bevinden.Was de monsters met 90 microliter koud steriel PBS door PBS aan het ene reservoir toe te voegen en zuig voorzichtig op uit het andere reservoir en herhaal dit vervolgens voor alle kanalen. Fixeer de cellen door 90 microliter gebufferde 4%PFA-oplossing toe te voegen aan hetzelfde reservoir waar de PBS is toegevoegd en zuig de vloeistof uit het andere reservoir aan zoals aangetoond. Nadat u de cellen in alle zes kanalen hebt bevestigd, brengt u de monsters over van ijs naar kamertemperatuur en incubeert u gedurende 20 minuten.Was de cellen drie keer met PBS door PBS aan het ene reservoir toe te voegen en het voorzichtig uit het andere reservoir in alle kanalen aan te zuigen, waarbij u ervoor zorgt dat de kanalen niet uitdrogen. Blus toegang tot PFA door 90 microliter omgevingsactief 15 millimolar ammoniumchloride bereid in PBS toe te voegen aan een van de reservoirs. Aspirateer uit het andere reservoir en incubeer de cellen gedurende 10 minuten.Permeabiliseer de cellen door 90 microliter van 0,3% Triton X 100 bereid in PBS toe te voegen in het lege reservoir. Aspirateer uit het andere reservoir voor elk kanaal en incubeer gedurende 10 minuten en spoel vervolgens drie keer met PBS zoals eerder aangetoond. Bij 90 microliter steriele PLA-blokkerende oplossing voor één reservoir.Adem vanaf de andere kant voor elk kanaal en incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde kamer. Voeg primaire antilichamen toe aan PLA-antilichaamverdunningsmiddel en vortex. Zuig de blokkerende oplossing voorzichtig op uit de reservoirs en kanalen.Voeg onmiddellijk 30 microliter van de primaire antilichaamoplossing toe aan het lege kanaal door de schuif te kantelen terwijl u de oplossing toevoegt. Herhaal dit voor alle kanalen en incubeer bij vier graden Celsius in de bevochtigde kamer 's nachts of bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Verdun minus konijn en plus muis PLA sondes één tot vijf in het PLA-antilichaamverdunningsmiddel.Was alle kanalen twee keer door 90 microliter wasbuffer A toe te voegen en aan te zuigen zoals gedemonstreerd. Voeg na het aanzuigen van de wasbuffer 30 microliter PLA-sondeoplossing toe en incubeer in de bevochtigde kamer. Verdun de ligatiebuffer één tot vijf in D-geïoniseerd water en verdun het lygus-enzym één tot 40 in de verdunde ligatiebuffer.Voeg na het wassen en volledig aanzuigen van de wasbuffer A 30 microliter ligatieoplossing toe aan de lege kanalen terwijl u de schuif kantelt en incubeer in de bevochtigde kamer. Verdun de amplificatiebuffer één tot vijf in gedeïoniseerd water en verdun vervolgens het polymerase-enzym één tot 80 in de verdunde amplificatiebuffer op ijs. Voeg na het wassen en volledig aanzuigen van de wasbuffer A 30 microliter versterkingsoplossing toe aan de lege kanalen terwijl u de schuif kantelt en incubeer deze in de bevochtigde kamer.Verdun de DAPI één tot 500 in wasbuffer B en was alle kanalen eenmaal door 90 microliter DAPI-bevattende wasbuffer B toe te voegen en aan te zuigen zoals aangetoond om de kernen te stomen. Was vervolgens alle kanalen één keer met wasbuffer B zonder DAPI. Verdun de wasbuffer B één tot 10 in gedeïoniseerd water en was alle kanalen eenmaal met 90 microliter verdunde wasbuffer B.Voeg na het aanzuigen van wasbuffer B onmiddellijk twee tot drie druppels van het vloeibare montagemedium toe aan één reservoir en kantel de schuif om het montagemedium in alle kanalen te verdelen.Bewaar de monsters bij vier graden Celsius in een bevochtigde omgeving totdat ze worden ingebeeld. Huvecs werden blootgesteld aan hoge en lage pure stress. De lage schuifspanning verhoogde smad-eiwitinteracties in het cytosol en de kernen.Enkele antilichaamcontroles vertoonden geen tot zeer weinig signalen, wat het succes van het experiment bewijst. Verhoogde antilichaamconcentratie resulteerde in een hoger aantal PLA-gebeurtenissen per cel, maar het verschil in PLA-signalen tussen cellen met hoge en lage pure stress was verminderd. Zelfgemaakte buffers voor blokkering en antilichaamverdunning kunnen worden gebruikt als alternatief voor commerciële buffers.De kwantificering van PLA-gebeurtenissen voor commerciële en zelfgemaakte verdunnings- en blokkeringsoplossingen toonde hetzelfde patroon van PLA-signalen in de cytosolische en nucleaire gebieden. Het totale aantal PLA-gebeurtenissen per cel was echter hoger met commerciële oplossingen. Een combinatie van SMAD Two/Three, SMAD Four antilichamen werd gebruikt waar het SMAD Four antilichaam niet geschikt was voor immunofluorescentie experimenten.Er was geen verschil in PLA-gebeurtenissen in de experimentele versus controleconditie, wat wijst op het belang van het selecteren van de juiste antilichaamcombinatie om de PLA-gebeurtenissen te detecteren. Het beschreven protocol kan worden aangepast om de interacties van transcriptiefactorcomplexen te detecteren die verschillen van SMADs en daarom helpen bij het begrijpen van genregulatie in athero-gevoelige en athero-beschermende omstandigheden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kwantificering van bacteriële histidine kinase autofosforylering Met een Nitrocellulose bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolyse van een Ni-Schiff Base-complex onder omstandigheden geschikt voor het bewaren van zuur-labiele Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kwantificering van hypopigmentatie activiteit In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions

Middelgrote voorbereiding voor de teelt van micro-organismen onder strikt anaerobe/anoxische condities

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kwantificering van co-enzym A in cellen en weefsels

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...