Name: visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

Nous remercions le Dr Maria Reichenbach et le Dr Christian Hiepen pour leur soutien sur le système de mise en place du flux et Eleanor Fox et Yunyun Xiao pour la lecture critique du manuscrit. P-L.M. a été financé par l’école internationale de recherche Max Planck IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK a reçu un financement de la DFG-SFB1444. La figure 1 a été créée à l’aide de BioRender.

1. Exposition à la culture cellulaire et au stress de cisaillement des fluides
REMARQUE: Les CE de la veine ombilicale humaine (HUVEC) ont été utilisés comme exemple pour étudier l’interaction induite par la SS des SMAD. Le protocole décrit ci-dessous peut être appliqué à chaque type de cellule réactive SS.
<ol><li>Enduire la lame à 6 canaux avec 0,1% de gélatine pour la peau porcine dans du PBS pendant 30 min à 37 °C.</li>
	<li>Ensemencez des HUVEC dans des lames pré-enduit...

<ol>
	<li>Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+BMP+receptors:+Specificity,+activation+and+inhibition.">Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).</li><li>Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling.">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li><li>Hiepen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPR2+acts+as+a+gatekeeper+to+protect+endothelial+cells+from+increased+TGF&#946;+responses+and+altered+cell+mechanics.">BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGF&#946; responses and altered cell mechanics.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).</li><li>Hildebrandt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ActivinA+induced+SMAD1/5+Signaling+in+an+iPSC+derived+EC+model+of+Fibrodysplasia+Ossificans+Progressiva+(FOP)+can+be+rescued+by+the+drug+candidate+saracatinib.">ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+activation+state+of+the+endothelium+via+two+distinct+TGF-beta+type+I+receptors.">Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+receptor-like+kinase+(ALK)1+is+an+antagonistic+mediator+of+lateral+TGFbeta/ALK5+signaling.">Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling.</a> Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).</li><li>Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta-induced+Smad1/5+phosphorylation+in+epithelial+cells+is+mediated+by+novel+receptor+complexes+and+is+essential+for+anchorage-independent+growth.">Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).</li><li>Ramachandran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+uses+a+novel+mode+of+receptor+activation+to+phosphorylate+SMAD1/5+and+induce+epithelial-to-mesenchymal+transition.">TGF-&#946; uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition.</a> eLife. 7, 31756 (2018).</li><li>Flanders, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brightfield+proximity+ligation+assay+reveals+both+canonical+and+mixed+transforming+growth+factor-&#946;/bone+morphogenetic+protein+Smad+signaling+complexes+in+tissue+sections.">Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-&#946;/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).</li><li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).</li><li>Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+in+vascular+homeostasis+and+disease.">Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).</li><li>Cai, J., Pardali, E., S&#225;nchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+vascular+diseases.">BMP signaling in vascular diseases.</a> FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).</li><li>Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulated+TGF-&#946;/BMP+signaling+in+vascular+malformations.">Deregulated TGF-&#946;/BMP signaling in vascular malformations.</a> Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).</li><li>MacCarrick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loeys-Dietz+syndrome:+a+primer+for+diagnosis+and+management.">Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management.</a> Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Min, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Smad+2/3+signaling+by+low+shear+stress+mediates+artery+inward+remodeling.">Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling.</a> bioRxiv. , 691980 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+receptor-integrin+interaction+mediates+responses+of+vascular+endothelial+Smad1/5+and+proliferation+to+disturbed+flow.">BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-specific+activation+of+Smad1/5+regulates+vascular+endothelial+cell+cycle+progression+in+response+to+disturbed+flow.">Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).</li><li>van Dijk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+TGF-&#946;+and+BMP+signaling+in+human+atherosclerosis:+A+histological+evaluation+based+on+Smad+activation.">Visualizing TGF-&#946; and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation.</a> Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).</li><li>Derwall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+bone+morphogenetic+protein+signaling+reduces+vascular+calcification+and+atherosclerosis.">Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Alam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+Assay+(PLA).">Proximity Ligation Assay (PLA).</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).</li><li>Application Note 03: Growing Cells in &#181;-Channels. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf</a> (2012)</li><li>Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf</a> (2019)</li><li>ibidi. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Note+31:+Instructions+&#181;-Slide+VI+0.4.">Application Note 31: Instructions &#181;-Slide VI 0.4.</a> ibidi. , (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reichenbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+impact+of+fluid+shear+stress+and+YAP/TAZ+on+BMP/TGF-&#946;+induced+osteogenic+target+genes.">Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-&#946; induced osteogenic target genes.</a> Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).</li><li>Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+takes+two+to+tango:+Endothelial+TGF&#946;/BMP+signaling+crosstalk+with+mechanobiology.">It takes two to tango: Endothelial TGF&#946;/BMP signaling crosstalk with mechanobiology.</a> Cells. 9 (9), 1965 (2020).</li></ol>

Le protocole basé sur le PLA décrit ici offre un moyen efficace de déterminer la proximité de deux protéines (par exemple, leur interaction directe) dans les CE exposés à une contrainte de cisaillement avec une résolution quantitative et spatiale. En utilisant des lames d’écoulement avec plusieurs canaux parallèles, plusieurs interactions protéiques différentes peuvent être examinées en même temps dans des cellules dans des conditions mécaniques identiques. En revanche, les systèmes de chambre d’éco...

Les protéines de la superfamille des facteurs de croissance transformants bêta (TGFβ) sont des cytokines pléiotropes avec une variété de membres, y compris TGFβs, protéines morphogénétiques osseuses (BMP) et Activins1,2. La liaison au ligand induit la formation d’oligomères récepteurs conduisant à la phosphorylation et, par conséquent, à l’activation du SMAD régulateur cytosolique (R-SMAD). Selon la sous-famille de ligands, différents R-SMAD sont activés1,2. Alors que les TGFβs et les Activines induisent principalement la phosphorylation de SMAD2/3, les BMP induisent une phosphorylation SMAD1/5/8. Cependant, il y a de plus en plus de preuves que les BMP et les TGFβs/Activins activent également les R-SMAD de l’autre sous-famille respective, dans un processus appelé « signalisation latérale»3,4,5,6,7,8 et qu’il existe des complexes SMAD mixtes composés à la fois de membres SMAD1/5 et SMAD2/333,9 . Deux R-SMAD activés forment par la suite des complexes trimériques avec le médiateur commun SMAD4. Ces complexes de facteurs de transcription sont alors capables de se transloquer dans le noyau et de réguler la transcription des gènes cibles. Les SMAD peuvent interagir avec une variété de co-activateurs et de co-répresseurs transcriptionnels différents, ce qui conduit à la diversification des possibilités de régulation des gènes cibles10. La déréglementation de la signalisation SMAD a de graves implications dans une variété de maladies. Dans cette optique, une signalisation TGFβ/BMP déséquilibrée peut entraîner des pathologies vasculaires graves, telles que l’hypertension artérielle pulmonaire, la télangiectasie hémorragique héréditaire ou l’athérosclérose3,11,12,13,14.
Les cellules endothéliales (CE) forment la couche la plus interne des vaisseaux sanguins et sont donc exposées au stress de cisaillement (SS), une force de friction exercée par le flux visqueux du sang. Fait intéressant, les CE résidant dans les parties du système vasculaire, qui sont exposées à des niveaux élevés de SS laminaires uniformes, sont maintenus dans un état homéostatique et au repos. En revanche, les CE qui présentent des SS faibles et non uniformes, par exemple aux bifurcations ou à la courbure moindre de l’arc aortique, sont prolifératives et activent les voies inflammatoires15. À leur tour, les sites d’EC dysfonctionnels sont enclins à développer l’athérosclérose. Fait intéressant, les CE dans ces zones d’athéroprone affichent des niveaux aberrants élevés de SMAD2/3 et SMAD1/516,17,18 activés. Dans ce contexte, l’amélioration de la signalisation TGFβ/BMP s’est avérée être un événement précoce dans le développement de lésions athérosclérotiques19 et l’interférence avec la signalisation BMP s’est avérée réduire considérablement l’inflammation vasculaire, la formation d’athérome et la calcification associée20.
Le test de ligature de proximité (PLA) est une technique biochimique permettant d’étudier les interactions protéine-protéine in situ21,22. Il repose sur la spécificité des anticorps de différentes espèces qui peuvent se lier aux protéines cibles d’intérêt, permettant une détection très spécifique des interactions protéiques endogènes au niveau d’une seule cellule. Ici, les anticorps primaires doivent se lier à leur épitope cible à une distance inférieure à 40 nm pour permettre la détection23. Par conséquent, le PLA est très bénéfique par rapport aux approches traditionnelles de co-immunoprécipitation, où plusieurs millions de cellules sont nécessaires pour détecter les interactions protéiques endogènes. Dans le PLA, les anticorps secondaires spécifiques à l’espèce, liés de manière covalente à des fragments d’ADN (appelés sondes Plus et Moins), se lient aux anticorps primaires et si les protéines d’intérêt interagissent, les sondes Plus et Moins sont proches. L’ADN est ligaturé à l’étape suivante et l’amplification en cercle roulant de l’ADN circulaire est rendue possible. Lors de l’amplification, des oligonucléotides complémentaires marqués par fluorescence se lient à l’ADN synthétisé, ce qui permet de visualiser ces interactions protéiques par microscopie à fluorescence conventionnelle.
Le protocole décrit ici permet aux scientifiques de comparer quantitativement le nombre de complexes de transcription SMAD actifs dans des conditions athéroprotectrices et athéroprones SS in vitro à l’aide de PLA. SS est généré via un système de pompe pneumatique programmable capable de générer un débit unidirectionnel laminaire de niveaux définis et permettant d’augmenter progressivement les débits. Cette méthode permet de détecter les interactions entre SMAD1/5 ou SMAD2/3 avec SMAD4, ainsi que les complexes mixtes R-SMAD. Il peut facilement être étendu pour analyser les interactions des SMAD avec les co-régulateurs transcriptionnels ou aux complexes de facteurs de transcription autres que les SMAD. La figure 1 montre les principales étapes du protocole présenté ci-dessous.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique du protocole décrit. (A) Les cellules ensemencées dans des lames à 6 canaux sont exposées à une contrainte de cisaillement à l’aide d’un système de pompe pneumatique. (B) Les cellules fixes sont utilisées pour l’expérience du PLA ou pour les conditions de contrôle. (C) Les images des expériences PLA sont acquises avec un microscope à fluorescence et sont analysées à l’aide du logiciel d’analyse ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80606</td>
			<td>6-channel slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K298.1</td>
			<td>Quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.4</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stain DNA/Nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td>PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>MINUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>PLUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>PLA wash buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium (ECGS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf Serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4% buffered</td>
			<td>KLINIPATH/VWR</td>
			<td>VWRK4186.BO1</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&#160; 25 &#181;g/mL Hep +&#160;&#160; 50 &#181;g/mL ECGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, Type A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td>Use 0.1% in PBS for coating of flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v.7</td>
			<td>GarphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Program used for the Plots and statistical calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>supplement for medium (Hep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVECs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Mounting Medium</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Liquid mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Pump System</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>pneumatic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-80100</td>
			<td>supplement for medium (L-Glu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2154</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53745</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD2/3 Antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610843</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with CST 9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mousee anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Sanata Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7966</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>supplement for medium (P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set WHITE</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10963</td>
			<td>Tubings used for 1 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set YELLOW and GREEN</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Tubings used for 30 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9516</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>8685</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9515</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with BD 610843</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial Connector for &#181;-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10830</td>
			<td>serial connection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6683.1</td>
			<td>Permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay

La signalisation du facteur de croissance transformant β (TGFβ) / protéine morphogénétique osseuse (BMP) est étroitement régulée et équilibrée pendant le développement et l’homéostasie du système vasculaire Par conséquent, la dérégulation de cette voie de signalisation entraîne des pathologies vasculaires graves, telles que l’hypertension artérielle pulmonaire, la télangiectasie hémorragique héréditaire et l’athérosclérose. Les cellules endothéliales (CE), en tant que couche la plus interne des vaisseaux sanguins, sont constamment exposées au stress de cisaillement des fluides (SS). Il a été démontré que des schémas anormaux de SS fluide améliorent la signalisation TGFβ / BMP, qui, avec d’autres stimuli, induisent l’athérogenèse. En relation avec cela, l’athéroprorone, faible SS laminaire, a amélioré la signalisation TGFβ / BMP tandis que l’athéroprotecteur, SS laminaire élevé, diminue cette signalisation. Pour analyser efficacement l’activation de ces voies, nous avons conçu un flux de travail pour étudier la formation de complexes de facteurs de transcription dans des conditions SS à faible laminaire et à SS laminaire élevé à l’aide d’un système de pompe pneumatique disponible dans le commerce et d’un test de ligature de proximité (PLA).
La signalisation TGFβ/BMP active nécessite la formation de complexes SMAD trimériques constitués de deux SMAD régulateurs (R-SMAD); SMAD2/3 et SMAD1/5/8 pour la signalisation TGFβ et BMP, respectivement) avec un médiateur commun SMAD (co-SMAD; SMAD4). En utilisant le PLA ciblant différentes sous-unités du complexe SMAD trimérique, c’est-à-dire R-SMAD/co-SMAD ou R-SMAD/R-SMAD, la formation de complexes de facteurs de transcription SMAD actifs peut être mesurée quantitativement et spatialement à l’aide de la microscopie à fluorescence.
L’utilisation de glissières d’écoulement avec 6 petits canaux parallèles, qui peuvent être connectés en série, permet d’étudier la formation complexe du facteur de transcription et d’inclure les contrôles nécessaires. 
Le flux de travail expliqué ici peut être facilement adapté pour des études ciblant la proximité des SMAD à d’autres facteurs de transcription ou à des complexes de facteurs de transcription autres que les SMAD, dans différentes conditions de SS fluides. Le flux de travail présenté ici montre un moyen rapide et efficace d’étudier la signalisation TGFβ/BMP induite par les fluides SS dans les CE, à la fois quantitativement et spatialement.

Nous avons déjà utilisé le PLA pour détecter les interactions de différentes protéines SMAD3 et analysé les changements induits par le stress de cisaillement dans la phosphorylation SMAD28.
Ici, les deux méthodes ont été combinées avec le protocole décrit ci-dessus. Les HUVEC ont été soumis à une contrainte de cisaillement de 1 dyn/cm2 et 30 dyn/cm2 et analysés pour les interactions des facteurs de transcript...

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Visualization and Quantification of TGFÃƒÅ½Ã‚Â²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Ici, nous établissons un protocole pour visualiser et analyser simultanément plusieurs complexes SMAD en utilisant le test de ligature de proximité (PLA) dans les cellules endothéliales exposées à des conditions pathologiques et physiologiques de stress de cisaillement des fluides.

Visualisation et quantification de la signalisation TGFβ/BMP/SMAD dans différentes conditions de contrainte de cisaillement du fluide à l’aide du test de proximité-ligature-assay

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Ce protocole permet aux scientifiques de comparer quantitativement le nombre de complexes de facteurs de transcription dans différentes conditions de stress de cisaillement et sera bénéfique pour la recherche en biologie vasculaire. Le principal avantage de ce protocole est l’utilisation de canaux d’écoulement microfluidiques qui permettent d’étudier plusieurs paires d’anticorps, y compris les contrôles respectifs simultanément. Pour commencer, enduisez la lame à six canaux en ajoutant 0,1% de gélatine pour la peau porcine préparée dans le PBS dans les canaux pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.Videz les canaux de la solution de gélatine et ensemencez Huvecs dans les lames précodées à six canaux à une densité de 2,5 fois 10 à la sixième cellule par millilitre dans 30 microlitres de milieu complet M199. Laissez les cellules adhérer pendant une heure à 37 degrés Celsius dans l’incubateur humidifié. Ajouter 60 microlitres de milieu complet M199 pré-averti à chacun des réservoirs.Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux jours dans un incubateur humidifié avec remplacement du milieu après 24 heures. Montez le tube de silicium sur les unités fluidiques, remplissez les réservoirs avec un minimum de 10 millilitres de milieu complet M199 pré-averti. Connectez les unités fluidiques avec des tubes au système de pompe et effectuez le pré-fonctionnement sans cellules pour équilibrer le fluide et éliminer tout l’air restant.Connectez les canaux simples sur la glissière à six canaux à l’aide du tube de connexion série. Connectez le premier et le dernier canal de la glissière aux tubes montés sur l’unité fluidique. Pour l’exposition des cellules à des niveaux élevés de stress pur, augmentez le stress pur en fonction des phases d’adaptation, en définissant les étapes par incréments de cinq dynes par centimètre carré toutes les 30 minutes.Utilisez les touffes sur le tube pour détacher les glissières des pompes après l’exposition aux contraintes de cisaillement du fluide, en évitant les déversements moyens dans l’incubateur et en transférant les glissières d’écoulement sur la glace. Tout en détachant le tube des réservoirs, utilisez le doigt pour fermer l’autre côté du réservoir afin d’éviter de piéger les bulles d’air dans le canal. En gardant la glissière d’écoulement sur la glace, aspirez soigneusement le milieu des réservoirs, mais pas du canal où résident les cellules.Lavez les échantillons avec 90 microlitres de PBS stérile à froid en ajoutant du PBS à un réservoir et aspirez soigneusement de l’autre réservoir, puis répétez pour tous les canaux. Fixez les cellules en ajoutant 90 microlitres de solution tamponnée de PFA à 4% au même réservoir où le PBS a été ajouté et aspirez le liquide de l’autre réservoir comme démontré. Après avoir fixé les cellules dans les six canaux, transférez les échantillons de la glace à la température ambiante et incubez pendant 20 minutes.Lavez les cellules trois fois avec du PBS en ajoutant du PBS à un réservoir et en l’aspirant soigneusement de l’autre réservoir dans tous les canaux, en prenant soin de ne pas dessécher les canaux. Étancher l’accès PFA en ajoutant 90 microlitres de chlorure d’ammonium ambiant de 15 millimolaires préparé dans du PBS à l’un des réservoirs. Aspirer de l’autre réservoir et incuber les cellules pendant 10 minutes.Perméabiliser les cellules en ajoutant 90 microlitres de 0,3% de Triton X 100 préparés en PBS dans le réservoir vide. Aspirer de l’autre réservoir pour chaque canal et incuber pendant 10 minutes, puis laver trois fois avec du PBS comme démontré précédemment. À 90 microlitres de solution de blocage stérile de PLA dans un réservoir.Aspirer de l’autre côté pour chaque canal et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée. Ajouter des anticorps primaires dans le diluant d’anticorps PLA et le vortex. Aspirer soigneusement la solution bloquante des réservoirs et des canaux.Ajouter 30 microlitres de la solution d’anticorps primaires immédiatement dans le canal vide en inclinant la lame tout en ajoutant la solution. Répétez pour tous les canaux et incubez à quatre degrés Celsius dans la chambre humidifiée pendant la nuit ou à 37 degrés Celsius pendant une heure. Diluer moins lapin et plus souris PLA sonde de un à cinq dans le diluant d’anticorps PLA.Lavez tous les canaux deux fois en ajoutant 90 microlitres de tampon de lavage A et en aspirant comme démontré. Après avoir aspiré le tampon de lavage, ajouter 30 microlitres de solution de sonde PLA et incuber dans la chambre humidifiée. Diluer le tampon de ligature un à cinq dans de l’eau ionisée D et diluer l’enzyme lygus un à 40 dans le tampon de ligature dilué.Après avoir lavé et complètement aspiré le tampon de lavage A, ajoutez 30 microlitres de solution de ligature aux canaux vides tout en inclinant la glissière et incubez dans la chambre humidifiée. Diluer le tampon d’amplification un à cinq dans de l’eau désionisée, puis diluer l’enzyme polymérase un à 80 dans le tampon d’amplification dilué sur glace. Après avoir lavé et complètement aspiré le tampon de lavage A, ajoutez 30 microlitres de solution d’amplification aux canaux vides tout en inclinant la glissière et incubez-la dans la chambre humidifiée.Diluer le DAPI un à 500 dans le tampon de lavage B et laver tous les canaux une fois en ajoutant 90 microlitres de DAPI contenant le tampon de lavage B, et en aspirant comme démontré pour cuire les noyaux à la vapeur. Ensuite, lavez tous les canaux une fois avec le tampon de lavage B sans DAPI. Diluer le tampon de lavage B un à 10 dans de l’eau désionisée et laver tous les canaux une fois avec 90 microlitres de tampon de lavage dilué B.Après avoir aspiré le tampon de lavage B, ajouter immédiatement deux à trois gouttes du milieu de montage liquide à un réservoir et incliner la glissière pour répartir le support de montage dans tous les canaux.Conservez les échantillons à quatre degrés Celsius dans un environnement humidifié jusqu’à l’imagerie. Les Huvecs ont été exposés à un stress élevé et faible. Le faible stress de cisaillement a augmenté les interactions de la protéine SMAD dans le cytosol et les noyaux.Les contrôles d’anticorps uniques ont montré non à très peu de signaux, prouvant le succès de l’expérience. L’augmentation de la concentration d’anticorps a entraîné un nombre plus élevé d’événements PLA par cellule, mais la différence dans les signaux PLA entre les cellules exposées à un stress pur élevé et faible a été réduite. Les tampons auto-fabriqués pour le blocage et la dilution des anticorps peuvent être utilisés comme alternative aux tampons commerciaux.La quantification des événements PLA pour les solutions diluantes et bloquantes commerciales et auto-fabriquées a montré le même schéma de signaux PLA dans les zones cytosolique et nucléaire. Cependant, le nombre total d’événements PLA par cellule était plus élevé avec les solutions commerciales. Une combinaison d’anticorps SMAD Two/Three, SMAD Four a été utilisée lorsque l’anticorps SMAD Four n’était pas adapté aux expériences d’immunofluorescence.Il n’y avait aucune différence entre les événements d’APL dans la condition expérimentale par rapport à la condition témoin, ce qui indique l’importance de sélectionner la bonne combinaison d’anticorps pour détecter les événements de PLA. Le protocole décrit peut être adapté pour détecter les interactions des complexes de facteurs de transcription différents des SMAD et donc aider à comprendre la régulation des gènes dans les conditions de protection de l’athéro et de l’athéro.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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