Name: visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

हम डॉ मारिया Reichenbach और डॉ क्रिश्चियन Hiepen प्रवाह पर उनके समर्थन के लिए धन्यवाद स्थापित प्रणाली और एलेनोर फॉक्स और Yunyun Xiao गंभीर रूप से पांडुलिपि पढ़ने के लिए. पी-एल.M को अंतर्राष्ट्रीय मैक्स प्लैंक रिसर्च स्कूल आईएमपीआरएस-बायोलॉजी एंड कंप्यूटेशन (आईएमपीआरएस-बीएसी) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। पीके को DFG-SFB1444 द्वारा धन प्राप्त हुआ। चित्रा 1 BioRender का उपयोग कर बनाया गया था।

1. सेल संस्कृति और द्रव कतरनी तनाव जोखिम
नोट: मानव नाभि शिरा ECs (HUVECs) का उपयोग SMADs के एसएस प्रेरित इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक उदाहरण के रूप में किया गया था। नीचे वर्णित प्रोटोकॉल को प्रत्येक ?...

<ol>
	<li>Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+BMP+receptors:+Specificity,+activation+and+inhibition.">Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).</li><li>Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling.">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li><li>Hiepen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPR2+acts+as+a+gatekeeper+to+protect+endothelial+cells+from+increased+TGF&#946;+responses+and+altered+cell+mechanics.">BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGF&#946; responses and altered cell mechanics.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).</li><li>Hildebrandt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ActivinA+induced+SMAD1/5+Signaling+in+an+iPSC+derived+EC+model+of+Fibrodysplasia+Ossificans+Progressiva+(FOP)+can+be+rescued+by+the+drug+candidate+saracatinib.">ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+activation+state+of+the+endothelium+via+two+distinct+TGF-beta+type+I+receptors.">Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+receptor-like+kinase+(ALK)1+is+an+antagonistic+mediator+of+lateral+TGFbeta/ALK5+signaling.">Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling.</a> Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).</li><li>Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta-induced+Smad1/5+phosphorylation+in+epithelial+cells+is+mediated+by+novel+receptor+complexes+and+is+essential+for+anchorage-independent+growth.">Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).</li><li>Ramachandran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+uses+a+novel+mode+of+receptor+activation+to+phosphorylate+SMAD1/5+and+induce+epithelial-to-mesenchymal+transition.">TGF-&#946; uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition.</a> eLife. 7, 31756 (2018).</li><li>Flanders, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brightfield+proximity+ligation+assay+reveals+both+canonical+and+mixed+transforming+growth+factor-&#946;/bone+morphogenetic+protein+Smad+signaling+complexes+in+tissue+sections.">Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-&#946;/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).</li><li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).</li><li>Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+in+vascular+homeostasis+and+disease.">Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).</li><li>Cai, J., Pardali, E., S&#225;nchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+vascular+diseases.">BMP signaling in vascular diseases.</a> FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).</li><li>Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulated+TGF-&#946;/BMP+signaling+in+vascular+malformations.">Deregulated TGF-&#946;/BMP signaling in vascular malformations.</a> Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).</li><li>MacCarrick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loeys-Dietz+syndrome:+a+primer+for+diagnosis+and+management.">Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management.</a> Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Min, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Smad+2/3+signaling+by+low+shear+stress+mediates+artery+inward+remodeling.">Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling.</a> bioRxiv. , 691980 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+receptor-integrin+interaction+mediates+responses+of+vascular+endothelial+Smad1/5+and+proliferation+to+disturbed+flow.">BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-specific+activation+of+Smad1/5+regulates+vascular+endothelial+cell+cycle+progression+in+response+to+disturbed+flow.">Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).</li><li>van Dijk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+TGF-&#946;+and+BMP+signaling+in+human+atherosclerosis:+A+histological+evaluation+based+on+Smad+activation.">Visualizing TGF-&#946; and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation.</a> Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).</li><li>Derwall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+bone+morphogenetic+protein+signaling+reduces+vascular+calcification+and+atherosclerosis.">Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Alam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+Assay+(PLA).">Proximity Ligation Assay (PLA).</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).</li><li>Application Note 03: Growing Cells in &#181;-Channels. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf</a> (2012)</li><li>Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf</a> (2019)</li><li>ibidi. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Note+31:+Instructions+&#181;-Slide+VI+0.4.">Application Note 31: Instructions &#181;-Slide VI 0.4.</a> ibidi. , (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reichenbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+impact+of+fluid+shear+stress+and+YAP/TAZ+on+BMP/TGF-&#946;+induced+osteogenic+target+genes.">Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-&#946; induced osteogenic target genes.</a> Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).</li><li>Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+takes+two+to+tango:+Endothelial+TGF&#946;/BMP+signaling+crosstalk+with+mechanobiology.">It takes two to tango: Endothelial TGF&#946;/BMP signaling crosstalk with mechanobiology.</a> Cells. 9 (9), 1965 (2020).</li></ol>

यहां वर्णित पीएलए आधारित प्रोटोकॉल मात्रात्मक और स्थानिक संकल्प के साथ कतरनी तनाव के संपर्क में आने वाले ईसी में दो प्रोटीन (जैसे, उनकी सीधी बातचीत) की निकटता निर्धारित करने का एक कुशल तरीका प्रदान कर?...

ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर्स बीटा (TGFπ) superfamily के प्रोटीन विभिन्न प्रकार के सदस्यों के साथ pleiotropic साइटोकिन्स हैं, जिनमें TGFπs, अस्थि morphogenetic proteins (BMPs), और Activins1,2 शामिल हैं। लिगैंड बाइंडिंग रिसेप्टर ओलिगोमर्स के गठन को प्रेरित करता है जो फॉस्फोराइलेशन के लिए अग्रणी होता है और इस प्रकार, साइटोसोलिक नियामक एसएमएडी (आर-एसएमएडी) की सक्रियता। लिगेंड के उप-परिवार के आधार पर, विभिन्न आर-एसएमएडी सक्रिय होते हैं1,2। जबकि TGF और Activins मुख्य रूप से SMAD2/3 के फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित करते हैं, BMPs SMAD1/5/8 फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित करते हैं। हालांकि, इस बात के सबूत जमा हो रहे हैं कि बीएमपी और टीजीएफ / एक्टिविन भी संबंधित अन्य उप-परिवार के आर-एसएमएडी को सक्रिय करते हैं, एक प्रक्रिया में जिसे 'पार्श्व सिग्नलिंग' 3,4,5,6,7,8 कहा जाता है और यह कि मिश्रित एसएमएडी कॉम्प्लेक्स हैं, जिनमें दोनों शामिल हैं, SMAD1/5 और SMAD2/3, सदस्य 3,9 . दो सक्रिय आर-एसएमएडी बाद में सामान्य मध्यस्थ SMAD4 के साथ ट्रिमेरिक कॉम्प्लेक्स बनाते हैं। ये प्रतिलेखन कारक परिसर तब नाभिक में स्थानांतरित करने और लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को विनियमित करने में सक्षम होते हैं। SMADs विभिन्न ट्रांसक्रिप्शनल सह-उत्प्रेरकों और सह-दमनकर्ताओं की एक किस्म के साथ बातचीत कर सकते हैं, जिससे लक्ष्य जीन 10 को विनियमित करने की संभावनाओं का विविधीकरण होता है। SMAD सिग्नलिंग के विनियमन के विभिन्न प्रकार के रोगों में गंभीर निहितार्थ हैं। इसके अनुरूप, असंतुलित TGFπ/ BMP सिग्नलिंग गंभीर संवहनी विकृति का कारण बन सकती है, जैसे कि फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप, वंशानुगत रक्तस्रावी telangiectasia, या atherosclerosis3,11,12,13,14।
एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) रक्त वाहिकाओं की सबसे भीतरी परत बनाती हैं और इसलिए, कतरनी तनाव (एसएस) के संपर्क में आती हैं, जो रक्त के चिपचिपा प्रवाह द्वारा लागू एक घर्षण बल है। दिलचस्प बात यह है कि वास्कुलचर के कुछ हिस्सों में रहने वाले ईसी, जो वर्दी के उच्च स्तर के संपर्क में आते हैं, लैमिनर एसएस, को होमोस्टैटिक और क्विसेंट अवस्था में रखा जाता है। इसके विपरीत, ईसी जो कम, गैर-समान एसएस का अनुभव करते हैं, उदाहरण के लिए, विभाजन या महाधमनी आर्क की कम वक्रता पर, प्रोलिफेरेटिव होते हैं और भड़काऊ मार्गों को सक्रिय करते हैं। बदले में, बेकार ईसी की साइटें एथेरोस्क्लेरोसिस विकसित करने के लिए प्रवण हैं। दिलचस्प बात यह है कि इन एथेरोप्रोन क्षेत्रों में ईसी सक्रिय SMAD2/3 और SMAD1/516,17,18 के उच्च स्तर को प्रदर्शित करते हैं। इस संदर्भ में, बढ़ाया TGF π / BMP सिग्नलिंग atherosclerotic घावों के विकास में एक प्रारंभिक घटना के रूप में पाया गया था19 और बीएमपी सिग्नलिंग के साथ हस्तक्षेप स्पष्ट रूप से संवहनी सूजन, एथेरोमा गठन, और संबंधित कैल्सीफिकेशन 20 को कम करने के लिए पाया गया था।
निकटता बंधाव परख (पीएलए) एक जैव रासायनिक तकनीक के लिए situ21,22 में प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए है. यह विभिन्न प्रजातियों के एंटीबॉडी की विशिष्टता पर निर्भर करता है जो ब्याज के लक्ष्य प्रोटीन को बांध सकते हैं, जिससे एकल-कोशिका स्तर पर अंतर्जात प्रोटीन इंटरैक्शन का अत्यधिक विशिष्ट पता लगाया जा सकता है। यहां, प्राथमिक एंटीबॉडी को पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए 40 एनएम से कम की दूरी पर अपने लक्ष्य एपिटोप से बांधना पड़ता है23। इसलिए, पीएलए पारंपरिक सह-immunoprecipitation दृष्टिकोण पर बहुत फायदेमंद है, जहां अंतर्जात प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए कई मिलियन कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। पीएलए में, प्रजाति-विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी, सहसंयोजक रूप से डीएनए टुकड़ों (जिसे प्लस और माइनस प्रोब कहा जाता है) से जुड़ा हुआ है, प्राथमिक एंटीबॉडी को बांधता है और यदि ब्याज के प्रोटीन बातचीत करते हैं, तो प्लस और माइनस जांच निकटता में आते हैं। डीएनए निम्नलिखित चरण में ligated हो जाता है और परिपत्र डीएनए के रोलिंग सर्कल प्रवर्धन संभव बना दिया जाता है। प्रवर्धन के दौरान, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले पूरक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स संश्लेषित डीएनए से जुड़ते हैं, जिससे इन प्रोटीन इंटरैक्शन को पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जा सकती है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल वैज्ञानिकों को पीएलए का उपयोग करके विट्रो में एथेरोप्रोटेक्टिव और एथेरोप्रोन एसएस स्थितियों में सक्रिय एसएमएडी प्रतिलेखन परिसरों की संख्या की मात्रात्मक रूप से तुलना करने में सक्षम बनाता है। एसएस एक प्रोग्राम योग्य वायवीय पंप सिस्टम के माध्यम से उत्पन्न होता है जो परिभाषित स्तरों के लैमिनर यूनिडायरेक्शनल प्रवाह उत्पन्न करने में सक्षम है और प्रवाह दरों की चरणबद्ध वृद्धि की अनुमति देता है। यह विधि SMAD4 के साथ SMAD1/5 या SMAD2/3 के बीच इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए अनुमति देती है, साथ ही साथ मिश्रित-R-SMAD कॉम्प्लेक्स भी। इसे ट्रांसक्रिप्शनल सह-नियामकों के साथ एसएमएडी की बातचीत का विश्लेषण करने या एसएमएडी के अलावा अन्य प्रतिलेखन कारक परिसरों के लिए आसानी से विस्तारित किया जा सकता है। चित्र 1 नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल के प्रमुख चरणों को दर्शाता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> चित्रा 1: वर्णित प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) 6-चैनल स्लाइड में सीड कोशिकाओं को वायवीय पंप प्रणाली के साथ कतरनी तनाव के संपर्क में लाया जाता है। (बी) निश्चित कोशिकाओं का उपयोग पीएलए प्रयोग के लिए या नियंत्रण स्थितियों के लिए किया जाता है। (सी) पीएलए प्रयोगों की छवियों को एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहित किया जाता है और इमेजजे विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80606</td>
			<td>6-channel slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K298.1</td>
			<td>Quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.4</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stain DNA/Nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td>PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>MINUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>PLUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>PLA wash buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium (ECGS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf Serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4% buffered</td>
			<td>KLINIPATH/VWR</td>
			<td>VWRK4186.BO1</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&#160; 25 &#181;g/mL Hep +&#160;&#160; 50 &#181;g/mL ECGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, Type A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td>Use 0.1% in PBS for coating of flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v.7</td>
			<td>GarphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Program used for the Plots and statistical calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>supplement for medium (Hep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVECs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Mounting Medium</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Liquid mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Pump System</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>pneumatic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-80100</td>
			<td>supplement for medium (L-Glu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2154</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53745</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD2/3 Antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610843</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with CST 9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mousee anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Sanata Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7966</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>supplement for medium (P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set WHITE</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10963</td>
			<td>Tubings used for 1 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set YELLOW and GREEN</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Tubings used for 30 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9516</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>8685</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9515</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with BD 610843</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial Connector for &#181;-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10830</td>
			<td>serial connection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6683.1</td>
			<td>Permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay

ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर β (TGFπ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) सिग्नलिंग को वास्कुलचर सिस्टम के विकास और होमियोस्टैसिस के दौरान कसकर विनियमित और संतुलित किया जाता है इसलिए, इस सिग्नलिंग मार्ग में विनियमन के परिणामस्वरूप गंभीर संवहनी विकृति होती है, जैसे फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप, वंशानुगत रक्तस्रावी टेलेंजिक्टेसिया, और एथेरोस्क्लेरोसिस। एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी), रक्त वाहिकाओं की सबसे भीतरी परत के रूप में, लगातार द्रव कतरनी तनाव (एसएस) के संपर्क में आती हैं। द्रव एसएस के असामान्य पैटर्न को टीजीएफ / बीएमपी सिग्नलिंग को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, जो अन्य उत्तेजनाओं के साथ मिलकर, एथेरोजेनेसिस को प्रेरित करता है। इसके संबंध में, एथेरोप्रोन, कम लैमिनर एसएस को टीजीएफ π / बीएमपी सिग्नलिंग को बढ़ाने के लिए पाया गया था, जबकि एथेरोप्रोटेक्टिव, उच्च लैमिनर एसएस, इस सिग्नलिंग को कम करता है। कुशलतापूर्वक इन मार्गों के सक्रियण का विश्लेषण करने के लिए, हमने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वायवीय पंप प्रणाली और निकटता बंधाव परख (पीएलए) का उपयोग करके कम लैमिनर एसएस और उच्च लैमिनर एसएस स्थितियों के तहत प्रतिलेखन कारक परिसरों के गठन की जांच करने के लिए एक वर्कफ़्लो डिज़ाइन किया है।
सक्रिय TGF π / BMP-सिग्नलिंग के लिए दो नियामक SMADs (R-SMAD) से मिलकर trimeric SMAD परिसरों के गठन की आवश्यकता होती है; SMAD2/3 और SMAD1/5/8 TGF और BMP सिग्नलिंग के लिए क्रमशः) एक सामान्य मध्यस्थ SMAD (सह-SMAD) के साथ; SMAD4)। पीएलए का उपयोग करके ट्राइमेरिक एसएमएडी-कॉम्प्लेक्स के विभिन्न सबयूनिट्स को लक्षित करना, यानी, या तो आर-एसएमएडी / को-एसएमएडी या आर-एसएमएडी / आर-एसएमएडी, सक्रिय एसएमएडी ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर कॉम्प्लेक्स के गठन को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मात्रात्मक रूप से और स्थानिक रूप से मापा जा सकता है।
6 छोटे समानांतर चैनलों के साथ प्रवाह स्लाइड का उपयोग, जिसे श्रृंखला में जोड़ा जा सकता है, प्रतिलेखन कारक जटिल गठन की जांच और आवश्यक नियंत्रणों को शामिल करने की अनुमति देता है। 
यहां बताए गए वर्कफ़्लो को अन्य प्रतिलेखन कारकों के लिए एसएमएडी की निकटता को लक्षित करने वाले अध्ययनों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है या विभिन्न द्रव एसएस स्थितियों में एसएमएडी के अलावा अन्य प्रतिलेखन कारक परिसरों के लिए। यहां प्रस्तुत वर्कफ़्लो ईसी में तरल पदार्थ एसएस प्रेरित टीजीएफ / बीएमपी सिग्नलिंग का अध्ययन करने का एक त्वरित और प्रभावी तरीका दिखाता है, दोनों मात्रात्मक और स्थानिक रूप से।

हमने पहले पीएलए का उपयोग विभिन्न एसएमएडी प्रोटीन 3 की बातचीत का पता लगाने के लिए किया है और एसएमएडी फॉस्फोराइलेशन 28 में कतरनी तनाव प्रेरित परिवर्तनों का विश्लेषण किया है।
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Visualization and Quantification of TGFÃƒÅ½Ã‚Â²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

यहां, हम एक साथ कल्पना करने और कई एसएमएडी परिसरों का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करते हैं जो एंडोथेलियल कोशिकाओं में निकटता बंधाव परख (पीएलए) का उपयोग करके पैथोलॉजिकल और शारीरिक द्रव कतरनी तनाव की स्थिति के संपर्क में हैं।

विज़ुअलाइज़ेशन और TGF के परिमाणीकरण π / BMP / SMAD विभिन्न द्रव कतरनी तनाव शर्तों के तहत निकटता-बंधन-परख का उपयोग कर सिग्नलिंग

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

यह प्रोटोकॉल वैज्ञानिकों को विभिन्न कतरनी तनाव स्थितियों के तहत प्रतिलेखन कारक परिसरों की संख्या की मात्रात्मक रूप से तुलना करने में सक्षम बनाता है, और संवहनी जीव विज्ञान में अनुसंधान के लिए फायदेमंद होगा। इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह चैनलों का उपयोग है जो कई एंटीबॉडी जोड़े की जांच की अनुमति देता है, जिसमें संबंधित नियंत्रण एक साथ शामिल हैं। शुरू करने के लिए, पीबीएस में तैयार 0.1% पोर्सिनी त्वचा जिलेटिन को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए चैनलों में जोड़कर छह चैनल स्लाइड को कोट करें।M199 पूर्ण माध्यम के 30 microliters में प्रति मिलीलीटर छठी कोशिकाओं के लिए 2.5 गुना 10 के घनत्व पर पूर्व कोडित छह चैनल स्लाइड में जिलेटिन समाधान और बीज Huvecs से चैनलों को खाली करें। कोशिकाओं को ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए पालन करने की अनुमति दें। पूर्व चेतावनी M199 जलाशयों में से प्रत्येक के लिए पूरा माध्यम के 60 microliters जोड़ें.24 घंटे के बाद मध्यम प्रतिस्थापन के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में दो दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को संस्कृति। Fluidic इकाइयों पर सिलिकॉन टयूबिंग माउंट, पूर्व चेतावनी M199 पूर्ण माध्यम के कम से कम 10 milliliters के साथ जलाशयों को भरने. पंप प्रणाली के लिए टयूबिंग के साथ fluidic इकाइयों को कनेक्ट करें और माध्यम को संतुलित करने और किसी भी शेष हवा को हटाने के लिए कोशिकाओं के बिना पूर्व रन प्रदर्शन।सीरियल कनेक्शन टयूबिंग का उपयोग करके छह चैनल स्लाइड पर एकल चैनलों को कनेक्ट करें। स्लाइड पर पहले और अंतिम चैनल को तरल पदार्थ इकाई पर घुड़सवार ट्यूबों से कनेक्ट करें। सरासर तनाव के उच्च स्तर के लिए कोशिकाओं के संपर्क के लिए, अनुकूलन चरणों के साथ सरासर तनाव कदम वार वृद्धि, प्रति 30 मिनट प्रति वर्ग सेंटीमीटर पांच dynes की वृद्धि में कदम सेट.द्रव कतरनी तनाव जोखिम के बाद पंपों से स्लाइड को अलग करने के लिए टयूबिंग पर clumps का उपयोग करें, इनक्यूबेटर में मध्यम spillage से बचने, और बर्फ पर प्रवाह स्लाइड हस्तांतरण। जलाशयों से टयूबिंग को अलग करते समय, चैनल में हवा के बुलबुले को फँसाने से बचने के लिए जलाशय के दूसरी तरफ को बंद करने के लिए उंगली का उपयोग करें। बर्फ पर प्रवाह स्लाइड रखते हुए, जलाशयों से माध्यम को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें, लेकिन उस चैनल से नहीं जहां कोशिकाएं रहती हैं।एक जलाशय में पीबीएस जोड़कर ठंडे बाँझ पीबीएस के 90 माइक्रोलीटर के साथ नमूनों को धोएं और दूसरे जलाशय से सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें, फिर सभी चैनलों के लिए दोहराएं। उसी जलाशय में 4% पीएफए समाधान के 90 माइक्रोलीटर जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें जहां पीबीएस जोड़ा गया था और अन्य जलाशय से तरल को एस्पिरेट करें जैसा कि प्रदर्शित किया गया था। सभी छह चैनलों में कोशिकाओं को ठीक करने के बाद, नमूनों को बर्फ से कमरे के तापमान पर स्थानांतरित करें, और 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।एक जलाशय में पीबीएस जोड़कर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं और इसे सभी चैनलों में दूसरे जलाशय से सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें, चैनलों को सूखने के लिए ध्यान न रखें। जलाशयों में से एक के लिए PBS में तैयार परिवेश 15 millimolar अमोनियम क्लोराइड के 90 microliters जोड़ने के द्वारा पहुँच PFA बुझाने. अन्य जलाशय से एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।खाली जलाशय में PBS में तैयार 0.3% Triton X 100 के 90 माइक्रोलीटर जोड़कर कोशिकाओं को permeabilize। प्रत्येक चैनल के लिए अन्य जलाशय से एस्पिरेट करें और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, फिर पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था। बाँझ पीएलए के 90 माइक्रोलीटर पर एक जलाशय के लिए समाधान को अवरुद्ध करना।प्रत्येक चैनल के लिए दूसरी तरफ से एस्पिरेट करें और एक ह्यूमिडिफाइड चैंबर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। पीएलए एंटीबॉडी डिल्यूएंट और भंवर में प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। ध्यान से जलाशयों और चैनलों से अवरुद्ध समाधान aspirate.समाधान जोड़ते समय स्लाइड को झुकाकर खाली चैनल में तुरंत प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें। सभी चैनलों के लिए दोहराएं और एक घंटे के लिए रात भर ह्यूमिडिफाइड चैंबर में चार डिग्री सेल्सियस पर या 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। तनु माइनस खरगोश और प्लस माउस पीएलए पीएलए एंटीबॉडी diluent में एक से पांच की जांच करता है।वॉश बफर ए के 90 माइक्रोलीटर जोड़कर और एस्पिरेटिंग के रूप में प्रदर्शित करके सभी चैनलों को दो बार धोएं। धोने के बफर aspirating के बाद, पीएलए जांच समाधान के 30 microliters जोड़ें और humidified कक्ष में ऊष्मायन. डी आयनित पानी में एक से पांच बंधाव बफर पतला और पतला बंधाव बफर में lygus एंजाइम एक से 40 करने के लिए पतला।धोने के बाद और पूरी तरह से धोने बफर ए aspirating, स्लाइड झुकाव, जबकि स्लाइड झुकाव खाली चैनलों के लिए बंधाव समाधान के 30 microliters जोड़ें, और humidified कक्ष में incubate. विआयनीकृत पानी में प्रवर्धन बफर को एक से पांच तक पतला करें, फिर बर्फ पर पतला प्रवर्धन बफर में पोलीमरेज़ एंजाइम को एक से 80 तक पतला करें। धोने के बाद और पूरी तरह से धोने बफर ए aspirating, स्लाइड झुकाव जबकि खाली चैनलों के लिए प्रवर्धन समाधान के 30 microliters जोड़ें, और यह humidified कक्ष में incubate.वॉश बफर बी में DAPI को एक से 500 तक पतला करें और वॉश बफर बी युक्त DAPI के 90 माइक्रोलीटर जोड़कर सभी चैनलों को एक बार धोएं, और नाभिक को भाप देने के लिए प्रदर्शित aspirating। फिर DAPI के बिना वॉश बफर बी के साथ एक बार सभी चैनलों को धो लें। विआयनीकृत पानी में धोने बफर बी को एक से 10 तक पतला करें और सभी चैनलों को पतला धोने वाले बफर बी के 90 माइक्रोलीटर के साथ एक बार धोएं।इमेजिंग तक एक humidified वातावरण में चार डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें। Huvecs उच्च और कम सरासर तनाव के संपर्क में थे। कम कतरनी तनाव साइटोसोल और नाभिक में SMAD प्रोटीन इंटरैक्शन में वृद्धि हुई।एकल एंटीबॉडी नियंत्रण ने प्रयोग की सफलता को साबित करते हुए बहुत कम संकेतों को नहीं दिखाया। बढ़ी हुई एंटीबॉडी एकाग्रता के परिणामस्वरूप प्रति सेल पीएलए की घटनाओं की एक उच्च संख्या हुई, लेकिन उच्च और निम्न सरासर तनाव उजागर कोशिकाओं के बीच पीएलए संकेतों में अंतर कम हो गया था। अवरुद्ध और एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए स्व-निर्मित बफर का उपयोग वाणिज्यिक बफर के विकल्प के रूप में किया जा सकता है।वाणिज्यिक और स्व-निर्मित डिलुएंट और अवरुद्ध समाधानों के लिए पीएलए की घटनाओं के परिमाणीकरण ने साइटोसोलिक और परमाणु क्षेत्रों में पीएलए संकेतों के समान पैटर्न को दिखाया। हालांकि, प्रति सेल पीएलए घटनाओं की कुल संख्या वाणिज्यिक समाधानों के साथ अधिक थी। SMAD दो /तीन, SMAD चार एंटीबॉडी का एक संयोजन का उपयोग किया गया था जहां SMAD चार एंटीबॉडी immunofluorescence प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं था।प्रयोगात्मक बनाम नियंत्रण स्थिति में पीएलए की घटनाओं में कोई अंतर नहीं था, जो पीएलए की घटनाओं का पता लगाने के लिए सही एंटीबॉडी संयोजन का चयन करने के महत्व को दर्शाता है। वर्णित प्रोटोकॉल को एसएमएडी से अलग प्रतिलेखन कारक परिसरों की बातचीत का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और इसलिए एथेरो प्रवण और एथेरो सुरक्षात्मक स्थितियों में जीन विनियमन को समझने में मदद करता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

बैक्टीरियल Histidine Kinase Autophosphorylation की मात्रा एक nitrocellulose बाध्यकारी परख का उपयोग

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

सह-immunoprecipitation द्वारा परमाणु और cytoplasmic भागों में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के दृश्य और<em&gt; बगल में</em&gt; निकटता Ligation परख

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

एक नी-शिफ़-बेस की हाइड्रोलिसिस परिसर का उपयोग स्थितियां एसिड अस्थायी रक्षा समूह की अवधारण के लिए उपयुक्त

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

निलंबन सेल संस्कृतियों में डीएनए नुकसान-प्रेरित प्रोटीन परिसरों का पता लगाने और विज़ुअलाइज़ेशन निकटता के बंधन परख का उपयोग करना

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

प्रोटीन Isoforms के Heterodimerization का पता लगाने में एक का उपयोग कर सीटू निकटता बंधाव परख

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

अंशांकन-मुक्त इन विट्रो ठहराव में प्रोटीन होमो-oligomerization का उपयोग कर वाणिज्यिक इंस्ट्रूमेंटेशन और नि: शुल्क, खुला स्रोत चमक विश्लेषण सॉफ्टवेयर

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

विट्रो में हाइपोपिग्मेंटेशन गतिविधि का प्रमाणन

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

मल्टीप्लेक्स्ड सह-प्रतिरक्षा का उपयोग कर प्रोटीन इंटरेक्शन नेटवर्क गतिशीलता का परिमाणीकरण

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions

कड़ाई से एनारोबिक/

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

कोशिकाओं और ऊतकों में कोएंजाइम ए का परिमाण

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...