Name: visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

マリア・ライヒェンバッハ博士とクリスチャン・ヒエペン博士がフローセットアップシステムをサポートし、エレノア・フォックスとユンユン・シャオが原稿を批判的に読んでくれて感謝します。P-L.Mは、国際的なマックスプランク研究学校IMPRS生物学と計算(IMPRS-BAC)によって資金提供されました。PKはDFG-SFB1444から資金提供を受けた。図 1 は、バイオレンダリングを使用して作成されました。

1. 細胞培養と流体せん断ストレス暴露
注: ヒト臍静脈脳(HUVEC)はSS誘導SMAの相互作用を研究する例として用いられた。以下に説明するプロトコルは、すべてのSS応答セルタイプに適用できます。
<ol><li>PBSで0.1%ブタスキンゼラチンを37°Cで30分間コーティングする6チャンネルスライド。</li>
	<li>M199フル培地の30 μLでmLあたり2.5 x 106 細胞の密度で、事前にコーティング...

<ol>
	<li>Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+BMP+receptors:+Specificity,+activation+and+inhibition.">Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).</li><li>Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling.">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li><li>Hiepen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPR2+acts+as+a+gatekeeper+to+protect+endothelial+cells+from+increased+TGF&#946;+responses+and+altered+cell+mechanics.">BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGF&#946; responses and altered cell mechanics.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).</li><li>Hildebrandt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ActivinA+induced+SMAD1/5+Signaling+in+an+iPSC+derived+EC+model+of+Fibrodysplasia+Ossificans+Progressiva+(FOP)+can+be+rescued+by+the+drug+candidate+saracatinib.">ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+activation+state+of+the+endothelium+via+two+distinct+TGF-beta+type+I+receptors.">Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+receptor-like+kinase+(ALK)1+is+an+antagonistic+mediator+of+lateral+TGFbeta/ALK5+signaling.">Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling.</a> Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).</li><li>Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta-induced+Smad1/5+phosphorylation+in+epithelial+cells+is+mediated+by+novel+receptor+complexes+and+is+essential+for+anchorage-independent+growth.">Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).</li><li>Ramachandran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+uses+a+novel+mode+of+receptor+activation+to+phosphorylate+SMAD1/5+and+induce+epithelial-to-mesenchymal+transition.">TGF-&#946; uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition.</a> eLife. 7, 31756 (2018).</li><li>Flanders, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brightfield+proximity+ligation+assay+reveals+both+canonical+and+mixed+transforming+growth+factor-&#946;/bone+morphogenetic+protein+Smad+signaling+complexes+in+tissue+sections.">Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-&#946;/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).</li><li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).</li><li>Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+in+vascular+homeostasis+and+disease.">Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).</li><li>Cai, J., Pardali, E., S&#225;nchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+vascular+diseases.">BMP signaling in vascular diseases.</a> FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).</li><li>Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulated+TGF-&#946;/BMP+signaling+in+vascular+malformations.">Deregulated TGF-&#946;/BMP signaling in vascular malformations.</a> Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).</li><li>MacCarrick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loeys-Dietz+syndrome:+a+primer+for+diagnosis+and+management.">Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management.</a> Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Min, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Smad+2/3+signaling+by+low+shear+stress+mediates+artery+inward+remodeling.">Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling.</a> bioRxiv. , 691980 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+receptor-integrin+interaction+mediates+responses+of+vascular+endothelial+Smad1/5+and+proliferation+to+disturbed+flow.">BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-specific+activation+of+Smad1/5+regulates+vascular+endothelial+cell+cycle+progression+in+response+to+disturbed+flow.">Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).</li><li>van Dijk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+TGF-&#946;+and+BMP+signaling+in+human+atherosclerosis:+A+histological+evaluation+based+on+Smad+activation.">Visualizing TGF-&#946; and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation.</a> Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).</li><li>Derwall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+bone+morphogenetic+protein+signaling+reduces+vascular+calcification+and+atherosclerosis.">Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Alam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+Assay+(PLA).">Proximity Ligation Assay (PLA).</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).</li><li>Application Note 03: Growing Cells in &#181;-Channels. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf</a> (2012)</li><li>Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf</a> (2019)</li><li>ibidi. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Note+31:+Instructions+&#181;-Slide+VI+0.4.">Application Note 31: Instructions &#181;-Slide VI 0.4.</a> ibidi. , (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reichenbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+impact+of+fluid+shear+stress+and+YAP/TAZ+on+BMP/TGF-&#946;+induced+osteogenic+target+genes.">Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-&#946; induced osteogenic target genes.</a> Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).</li><li>Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+takes+two+to+tango:+Endothelial+TGF&#946;/BMP+signaling+crosstalk+with+mechanobiology.">It takes two to tango: Endothelial TGF&#946;/BMP signaling crosstalk with mechanobiology.</a> Cells. 9 (9), 1965 (2020).</li></ol>

ここで説明するPLAベースのプロトコルは、定量的および空間的解像度でせん断応力にさらされたECにおける2つのタンパク質の近接性(例えば、その直接相互作用)を効率的に決定する方法を提供します。複数の並列チャネルを有するフロースライドを使用することにより、複数の異なるタンパク質相互作用を同一の機械的条件下で細胞内で同時に検査することができます。対照的に、カスタム?...

トランスフォーム成長因子β(TGFβ)スーパーファミリーのタンパク質は、TGFβs、骨形態形成タンパク質(BMP)、およびアクティビンズ1,2を含む様々なメンバーを有する多方性サイトカインである。リガンド結合は、リン酸化に至る受容体オリゴマーの形成を誘導し、それにより、細胞ゾーリック調節SMAD(R−SMAD)の活性化を行う。リガンドのサブファミリーに応じて、異なるR-SMAが活性化される1,2。TGFβsおよびアクチビンは主にSMAD2/3のリン酸化を誘導するが、BMPはSMAD1/5/8リン酸化を誘導する。しかし、BMPとTGFβs/アクティビンは、他のサブファミリーのR-SMAを活性化し、「横信号」3,4,5,6,7,8と呼ばれるプロセスで、SMAD1/5とSMAD2/3の両方からなる混合SMAD複合体があるという証拠が蓄積されています。.2つの活性化されたR-SMADは、その後、一般的なメディエーターSMAD4と三量体複合体を形成する。これらの転写因子複合体は、核に転写し、標的遺伝子の転写を調節することができる。SMADは、様々な転写共活性化因子および共抑制因子と相互作用し、標的遺伝子10を調節する可能性の多様化につながる。SMADシグナル伝達の調節緩和は、様々な疾患において深刻な影響を及ぼす。これに伴い、不均衡なTGFβ/BMPシグナル伝達は、肺動脈高血圧症、遺伝性出血性血管拡張症、またはアテローム性動脈硬化症3、11、12、13、14などの重度の血管病理を引き起こす可能性がある。
内皮細胞(ECs)は血管の最も内側の層を形成し、したがって、せん断応力(SS)に曝露され、血液の粘性流によって作用される摩擦力である。興味深いことに、高レベルの均一な層状SSにさらされる血管構造の一部に存在するECは、ホメオスタティックで静止状態に保たれています。対照的に、低い非均一なSSを経験するICは、例えば、大動脈弓の分岐またはより少ない湾曲において、増殖し、炎症経路を活性化する15。さらに、機能不全のICの部位はアテローム性動脈硬化症を発症しやすい。興味深いことに、これらのアテローム発生領域のICは、活性化されたSMAD2/3およびSMAD1/516,17,18の異常に高いレベルを表示します。この文脈において、増強されたTGFβ/BMPシグナル伝達は、アテローム硬化性病変19の発症における早期の事象であることが判明し、BMPシグナル伝達との干渉は、血管炎症、アテローム形成、および関連する石灰化20を著しく減少させることが判明した。
近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、in situ21,22におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するための生化学的手法です。これは、目的の標的タンパク質を結合することができる異なる種の抗体の特異性に依存し、単一細胞レベルでの内因性タンパク質相互作用の高度に特異的な検出を可能にする。ここで、一次抗体は、検出23を可能にするために40nm未満の距離で標的エピトープに結合する必要がある。したがって、PLAは、内因性タンパク質相互作用を検出するために数百万個の細胞が必要な従来の共免疫沈降アプローチよりも非常に有益です。PLAでは、種特異的な二次抗体は、DNA断片(プラスおよびマイナスプローブと呼ぶ)に共有結合し、一次抗体に結合し、関心のあるタンパク質が相互作用する場合、プラスおよびマイナスプローブが近接して来る。DNAは次のステップで結紮され、円形DNAの転環増幅が可能になる。増幅の間、蛍光標識された相補オリゴヌクレオチドは合成されたDNAに結合し、これらのタンパク質相互作用を従来の蛍光顕微鏡で可視化することを可能にする。
ここで説明するプロトコルは、プラを使用して、科学者がアテロプロテク保護およびアテローム化SS条件で活性SMAD転写複合体の数を定量的に比較することを可能 に する。SSは定義されたレベルの層の単方向流れを生成し、流量の段階的な増加を可能にすることができるプログラム可能な空気ポンプシステムを介して生成される。この方法により、SMAD1/5またはSMAD2/3とSMAD4との相互作用、および混合R-SMAD複合体の相互作用を検出することができます。転写共調整因子とのSMADの相互作用を分析したり、SMAD以外の転写因子複合体に分析したりすることが容易に可能です。 図 1 は、以下に示すプロトコルの主要な手順を示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> 図1:記載されたプロトコルの概略表現。 (A)6チャンネルスライドに播種された細胞は、空気圧ポンプシステムでせん断応力にさらされます。(B) 固定細胞はPLA実験や制御条件に使用されます。(C) PLA実験の画像は蛍光顕微鏡で取得し、ImageJ解析ソフトを用いて解析します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80606</td>
			<td>6-channel slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K298.1</td>
			<td>Quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.4</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stain DNA/Nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td>PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>MINUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>PLUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>PLA wash buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium (ECGS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf Serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4% buffered</td>
			<td>KLINIPATH/VWR</td>
			<td>VWRK4186.BO1</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&#160; 25 &#181;g/mL Hep +&#160;&#160; 50 &#181;g/mL ECGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, Type A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td>Use 0.1% in PBS for coating of flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v.7</td>
			<td>GarphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Program used for the Plots and statistical calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>supplement for medium (Hep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVECs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Mounting Medium</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Liquid mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Pump System</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>pneumatic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-80100</td>
			<td>supplement for medium (L-Glu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2154</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53745</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD2/3 Antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610843</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with CST 9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mousee anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Sanata Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7966</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>supplement for medium (P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set WHITE</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10963</td>
			<td>Tubings used for 1 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set YELLOW and GREEN</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Tubings used for 30 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9516</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>8685</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9515</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with BD 610843</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial Connector for &#181;-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10830</td>
			<td>serial connection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6683.1</td>
			<td>Permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay

変形成長因子β(TGFβ)/骨形態形成タンパク質(BMP)シグナル伝達は、血管系の発達および恒常性の間に厳しく調節され、バランスがとれ、従って、このシグナル伝達経路の調節緩和は、肺動脈高血圧症、遺伝性血性動脈硬化症、アテローム硬化症などの重度の血管病理をもたらす。血管の最も内側の層として、血管内皮細胞(IC)は、常に流体せん断応力(SS)にさらされています。流体SSの異常パターンは、TGFβ/BMPシグナル伝達を増強することが示されており、これは、他の刺激と共に、アテローム発生を誘発する。これに関連して、アテローム化、低層SSは、アテロープロテクティブ、高層SS、このシグナル伝達を減少させながらTGFβ/ BMPシグナル伝達を強化することが判明した。これらの経路の活性化を効率的に解析するため、市販の空気圧ポンプシステムと近接ライゲーションアッセイ(PLA)を用いて、低層SSおよび高層SS条件下での転写因子複合体の形成を調査するワークフローを設計しました。
アクティブTGFβ/BMPシグナル伝達は、2つの調節SMAD(R-SMAD)からなる三量体SMAD複合体の形成を必要とする;共通のメディター SMAD (コ-SMAD;スマッド4)。三量体SMAD複合体の異なるサブユニット、すなわちR-SMAD/co-SMADまたはR-SMADまたはR-SMADのいずれかの異なるサブユニットを標的とするPLAを用いて、活性SMAD転写因子複合体の形成は、蛍光顕微鏡を用いて定量的および空間的に測定することができる。
連続で接続することができる6つの小さな並列チャネルを有するフロースライドの使用は、転写因子の複雑な形成および必要な制御の包含の調査を可能にする。 
ここで説明するワークフローは、SMADの近接性を他の転写因子に対して対象とする研究や、異なる流体SS条件でSMAD以外の転写因子複合体に容易に適応させることができる。ここで示したワークフローは、定量的にも空間的にも、ECsにおける流体SS誘導TGFβ/BMPシグナリングを迅速かつ効果的に研究する方法を示しています。

我々は、以前、PLAを用いて異なるSMADタンパク質3 の相互作用を検出し、SMADリン酸化28におけるせん断応力誘発変化を解析した。
ここで、両方の方法を上記のプロトコルと組み合わせた。ハヴェックは1 dyn/cm2 および30 dyn/cm2 のせん断応力を受け、SMAD転写因子の相互作用について分析した。我々は、高剪断応力(30 dyn/cm...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

Visualization and Quantification of TGFÃƒÅ½Ã‚Â²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

ここでは、病理的および生理的な流体せん断ストレス条件に曝露した内皮細胞における近接ライゲーションアッセイ(PLA)を用いて、複数のSMAD複合体を同時に可視化・解析するプロトコルを確立する。

近接ライゲーションアッセイを用いた異流体せん断応力条件下でのTGFβ/BMP/SMADシグナル伝達の可視化と定量化

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

このプロトコルは、科学者が異なるせん断応力条件下で転写因子複合体の数を定量的に比較することを可能にし、血管生物学の研究に有益である。このプロトコルの主な利点は、複数の抗体ペアの調査を可能にするマイクロ流体流路の使用であり、それぞれの制御を同時に含む。まず、PBSで作られた0.1%のブタの皮ゼラチンを37°Cで30分間チャネルに加えて、6つのチャンネルスライドをコーティングします。事前にコード化された6つのチャンネルスライドのゼラチン溶液とシードHuvecsのチャネルを、M199完全培地の30マイクロリットルで1ミリリットル当たり6細胞に2.5倍の密度で空にします。加湿インキュベーターで37°Cで細胞が1時間接着するようにします。各リザーバに警告済みのM199完全培地60マイクロリットルを加えます。24時間後に培地交換を加湿したインキュベーターで2日間摂氏37度で細胞を培養する。シリコンチューブを流体ユニットに取り付け、事前に警告されたM199完全培地の最低10ミリリットルで貯水池を満たします。流体ユニットをチューブとポンプシステムに接続し、セルなしでプリランを実行して、媒体を平衡化し、残りの空気を取り除きます。シリアル接続チューブを使用して、6 チャンネルスライドの単一チャネルを接続します。スライドの最初と最後のチャンネルを、流体ユニットに取り付けられたチューブに接続します。細胞を高レベルの応力にさらした場合は、適応段階で完全な応力ステップを上げ、30分あたり平方センチメートルあたり5つのダイン単位でステップを設定します。チューブ上の束を使用して、流体せん断応力暴露後のポンプからスライドを取り外し、インキュベーター内での媒体のこぼれを避け、氷上の流れスライドを移動します。貯留槽からチューブを取り外しながら、指を使って貯留槽の反対側を閉じ、チャネル内の気泡をトラップしないようにします。流れは氷の上に流れ続け、細胞が存在するチャネルから慎重に貯留から媒体を吸引する。1つの貯水池にPBSを加え、もう一方の貯水池から慎重に吸引して90マイクロリットルの冷たい無菌PBSでサンプルを洗い、すべてのチャネルについて繰り返します。90マイクロリットルの緩衝された4%PFA溶液をPBSを加えた同じリザーバに加えて細胞を固定し、示されているように他のリザーバから液体を吸引する。6つのチャネルすべてで細胞を固定した後、氷から室温にサンプルを移し、20分間インキュベートします。PBSを1つの貯留層に加え、すべてのチャネルの他の貯水池から慎重に吸い込んでPBSで細胞を3回洗い、チャネルを乾燥させないように注意してください。クエンチは、PBSで調製した塩化アンモニウム15ミリモルの90マイクロリットルを貯留槽の1つに加えることによってPFAにアクセスする。他の貯蔵所から吸気し、10分間細胞をインキュベートする。空の貯留槽内のPBSで調製した0.3%トリトンX 100の90マイクロリットルを加えることによって細胞を透過させる。各チャネルに対して他の貯留層から吸引し、10分間インキュベートし、前に示したようにPBSで3回洗浄した。1つの貯蔵所に無菌PLA遮断液の90マイクロリットルで。各チャネルの反対側から吸気し、加湿室で摂氏37度で1時間インキュベートする。PLA抗体希釈剤および渦液中の一次抗体を添加する。慎重に貯蔵所およびチャネルからのブロッキング溶液を吸引する。一次抗体溶液の30マイクロリットルを、溶液を加えながらスライドを傾けることで、すぐに空のチャネルに加えます。すべてのチャンネルで繰り返し、加湿室で一晩または37°Cで1時間インキュベートします。希釈マイナスウサギおよびプラスマウスPLAはPLA抗体希釈剤中で1〜5個をプローブする。90マイクロリットルの洗浄バッファーAを加え、実証したように吸い出すことによって、すべてのチャネルを2回洗浄します。洗浄バッファーを吸引した後、PLAプローブ溶液の30マイクロリットルを加え、加湿チャンバ内でインキュベートする。Dイオン化水でライゲーションバッファーを1~5個希釈し、希釈したライゲーションバッファーでライガス酵素を 1 ~ 40 希釈します。洗浄バッファーAを洗浄し完全に吸引した後、スライドを傾けながら30マイクロリットルのライゲーション溶液を空のチャネルに加え、加湿チャンバ内でインキュベートする。増幅バッファーを脱イオン水で1~5個希釈し、氷上の希釈増幅バッファーでポリメラーゼ酵素を1~80で希釈します。洗浄バッファーAを洗浄して完全に吸引した後、スライドを傾けながら30マイクロリットルの増幅溶液を空のチャネルに加え、加湿チャンバーにインキュベートする。洗浄バッファーBでDAPIを1~500まで希釈し、洗浄バッファーBを含むDAPIを90マイクロリットル加えて、核を蒸すため発汗して、全てのチャネルを1回洗浄する。次に、DAPIなしで洗浄バッファBで一度すべてのチャネルを洗浄します。洗浄バッファーBを脱イオン水で1~10に希釈し、90マイクロリットルの希釈洗浄バッファーBですべてのチャネルを1回洗浄し、洗浄バッファーBを吸引した後、すぐに2~3滴の液体取り付け媒体を1つのリザーバに加え、スライドを傾けてすべてのチャネルに実装媒体を分配します。サンプルは、イメージングまで加湿環境で摂氏4度で保存します。Huvecsは高い、低い完全なストレスにさらされました。低剪断応力は、細胞質ゾルおよび核におけるSMADタンパク質相互作用を増加した。単一の抗体コントロールは、実験の成功を証明し、非常に少数の信号にノーを示しました。抗体濃度の上昇は細胞当たりのPLA事象の数が多くなったが、高い、低い純粋なストレス暴露細胞間のPLA信号の差は減少した。ブロッキングおよび抗体希釈用の自作バッファーは、市販バッファーの代替として使用できます。商業的および自作の希釈剤およびブロッキング溶液のPLA事象の定量化は、サイトソリックおよび核領域におけるPLA信号の同じパターンを示した。しかし、市販のソリューションでは、セルあたりのPLAイベントの総数が多かった。SMAD Two/Threeの組み合わせにより、SMAD Four抗体が免疫蛍光実験に適していない場所にSMAD Four抗体が使用されました。実験と対照条件におけるPLA事象に違いはなく、PLA事象を検出するための正しい抗体組み合わせを選択することの重要性を示す。記載されたプロトコルは、SMADとは異なる転写因子複合体の相互作用を検出するために適応することができ、したがって、アテロームの起こりやすいおよびアテローレの保護条件における遺伝子調節を理解するのに役立つ。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

ニトロセルロース結合アッセイを用いて細菌ヒスチジンキナーゼ自己リン酸化の定量化

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

共免疫沈降により核および細胞質画分中のタンパク質間相互作用の可視化と<em&gt;その場で</em&gt;近接ライゲーションアッセイ

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

酸に不安定な保護基を保持するのに適したNi-シッフ塩基錯体の使用条件の加水分解

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

多量ホモ測定器と無料、フリー、オープン ソースの明るさ解析ソフトウェアを使用しての体外校正無料定量化

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

培養色素脱失活動の定量化

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

多重共免疫沈殿を用いたタンパク質相互作用ネットワークダイナミクスの定量化

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions

厳密嫌気性/無酸素条件下での微生物の培養のための培地製剤

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

細胞および組織におけるコエンザイムAの定量

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...