Name: visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

우리는 마리아 라이헨바흐 박사와 크리스티안 히펜 박사가 흐름 설정 시스템에 대한 지원에 감사를 표하고 엘리너 폭스와 윤윤 샤오는 원고를 비판적으로 읽었습니다. P-L.M. 국제 막스 플랑크 연구 학교 IMPRS 생물학 및 계산에 의해 투자되었다 (IMPRS-BAC). PK는 DFG-SFB1444에 의해 자금을 받았다. 그림 1은 BioRender를 사용하여 만들어졌습니다.

1. 세포 배양 및 유체 전단 응력 노출
참고: 인간 배꼽 정맥 IC(HUVECs)는 SMADs의 SS 유도 상호 작용을 연구하는 예로 사용되었습니다. 아래에 설명된 프로토콜은 모든 SS 반응형 세포 유형에 적용될 수 있다.
<ol><li>PBS에서 0.1% 돼지 피부 젤라틴으로 6채널 슬라이드를 37°C에서 30분 동안 코팅합니다.</li>
	<li>M199 풀 배지의 30 μL에서 mL당 2.5 x 106 셀의 밀도로 미리 코팅된 6채널 ...

<ol>
	<li>Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+BMP+receptors:+Specificity,+activation+and+inhibition.">Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).</li><li>Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling.">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li><li>Hiepen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPR2+acts+as+a+gatekeeper+to+protect+endothelial+cells+from+increased+TGF&#946;+responses+and+altered+cell+mechanics.">BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGF&#946; responses and altered cell mechanics.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).</li><li>Hildebrandt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ActivinA+induced+SMAD1/5+Signaling+in+an+iPSC+derived+EC+model+of+Fibrodysplasia+Ossificans+Progressiva+(FOP)+can+be+rescued+by+the+drug+candidate+saracatinib.">ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+activation+state+of+the+endothelium+via+two+distinct+TGF-beta+type+I+receptors.">Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+receptor-like+kinase+(ALK)1+is+an+antagonistic+mediator+of+lateral+TGFbeta/ALK5+signaling.">Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling.</a> Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).</li><li>Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta-induced+Smad1/5+phosphorylation+in+epithelial+cells+is+mediated+by+novel+receptor+complexes+and+is+essential+for+anchorage-independent+growth.">Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).</li><li>Ramachandran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+uses+a+novel+mode+of+receptor+activation+to+phosphorylate+SMAD1/5+and+induce+epithelial-to-mesenchymal+transition.">TGF-&#946; uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition.</a> eLife. 7, 31756 (2018).</li><li>Flanders, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brightfield+proximity+ligation+assay+reveals+both+canonical+and+mixed+transforming+growth+factor-&#946;/bone+morphogenetic+protein+Smad+signaling+complexes+in+tissue+sections.">Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-&#946;/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).</li><li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).</li><li>Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+in+vascular+homeostasis+and+disease.">Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).</li><li>Cai, J., Pardali, E., S&#225;nchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+vascular+diseases.">BMP signaling in vascular diseases.</a> FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).</li><li>Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulated+TGF-&#946;/BMP+signaling+in+vascular+malformations.">Deregulated TGF-&#946;/BMP signaling in vascular malformations.</a> Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).</li><li>MacCarrick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loeys-Dietz+syndrome:+a+primer+for+diagnosis+and+management.">Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management.</a> Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Min, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Smad+2/3+signaling+by+low+shear+stress+mediates+artery+inward+remodeling.">Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling.</a> bioRxiv. , 691980 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+receptor-integrin+interaction+mediates+responses+of+vascular+endothelial+Smad1/5+and+proliferation+to+disturbed+flow.">BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-specific+activation+of+Smad1/5+regulates+vascular+endothelial+cell+cycle+progression+in+response+to+disturbed+flow.">Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).</li><li>van Dijk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+TGF-&#946;+and+BMP+signaling+in+human+atherosclerosis:+A+histological+evaluation+based+on+Smad+activation.">Visualizing TGF-&#946; and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation.</a> Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).</li><li>Derwall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+bone+morphogenetic+protein+signaling+reduces+vascular+calcification+and+atherosclerosis.">Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Alam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+Assay+(PLA).">Proximity Ligation Assay (PLA).</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).</li><li>Application Note 03: Growing Cells in &#181;-Channels. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf</a> (2012)</li><li>Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf</a> (2019)</li><li>ibidi. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Note+31:+Instructions+&#181;-Slide+VI+0.4.">Application Note 31: Instructions &#181;-Slide VI 0.4.</a> ibidi. , (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reichenbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+impact+of+fluid+shear+stress+and+YAP/TAZ+on+BMP/TGF-&#946;+induced+osteogenic+target+genes.">Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-&#946; induced osteogenic target genes.</a> Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).</li><li>Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+takes+two+to+tango:+Endothelial+TGF&#946;/BMP+signaling+crosstalk+with+mechanobiology.">It takes two to tango: Endothelial TGF&#946;/BMP signaling crosstalk with mechanobiology.</a> Cells. 9 (9), 1965 (2020).</li></ol>

여기에 설명된 PLA 기반 프로토콜은 정량적 및 공간 해상도를 가진 전단 응력에 노출된 IC에서 두 가지 단백질(예를 들어, 그들의 직접적인 상호 작용)의 근접성을 결정하는 효율적인 방법을 제공합니다. 여러 병렬 채널을 가진 유량 슬라이드를 사용하여 동일한 기계적 조건하에서 세포에서 동시에 여러 가지 단백질 상호 작용을 검사 할 수 있습니다. 대조적으로, 사용자 정의 빌드 흐름 챔버 시스?...

변형 성장 인자 베타 (TGFβ) 슈퍼 패밀리의 단백질은 TGFβs, 뼈 형태 유전학 단백질 (BmPs), 및 Activins1,2를 포함한 다양한 구성원을 가진 흉골 사이토카인이다. 리간드 결합은 인산화로 이어지는 수용체 올리고머의 형성을 유도하고, 이에 의해, 세포조절SMAD(R-SMAD)의 활성화를 유도한다. 리간드의 하위 패밀리에 따라 다른 R-SMAD가 활성화됩니다1,2. TGFβs 및 액티빈은 주로 SMAD2/3의 인산화를 유도하는 반면, BMP는 SMAD1/5/8 인산화를 유도합니다. 그러나, BmPs와 TGFβs/Activins는 또한 '측면 신호'3,4,5,6,7,8로 불리는 프로세스에서 각각다른 하위 가족의 R-SMADs를 활성화하고 SMAD1/5 및 SMAD2/3, 회원 으로 구성된 혼합 SMAD 복합체가 있다는 증거가 축적되어 있습니다. . 두 개의 활성 R-SMADs는 이후 공통 중재자 SMAD4와 트리메릭 복합체를 형성한다. 이러한 전사 인자 복합체는 핵으로 배분하고 표적 유전자의 전사를 조절할 수 있습니다. SMADs는 다양한 상이한 전사 공동 활성제 및 공동 억압자와 상호 작용할 수 있으며, 표적 유전자10을 조절할 수 있는 가능성의 다양화로 이어집니다. SMAD 신호의 규제 완화는 다양한 질병에 심각한 영향을 미칩니다. 이에 따라 불균형한 TGFβ/BMP 시그널링은 폐 동맥 고혈압, 유전출혈성 혈관기암증 또는 죽상 경화증3,11,12,13,14와 같은 심한 혈관 병리로 이어질 수 있다.
내피 세포 (EC)는 혈관의 가장 안쪽 층을 형성하고, 따라서, 전단 응력 (SS),에 노출, 혈액의 점성 흐름에 의해 가해지는 마찰 력. 흥미롭게도, 균일한, 라미나르 SS의 상부에 노출되는 혈관의 부분에 거주하는 IC는, 정각적이고 정지상태에 보관됩니다. 대조적으로, 비균일한 SS를 경험하는 EC는, 예를 들면, 양면 또는 대동맥 아치의 더 적은 곡률에서, 증식하고 선동적인 통로를 활성화합니다15. 차례로, 기능 장애 PC의 사이트는 동맥 경화증을 개발하는 경향이있다. 흥미롭게도, 이러한 atheroprone 지역에 있는 EC는 활성화된 SMAD2/3 및 SMAD1/516,17,18의 비정상적으로 높은 수준을 표시합니다. 이러한 맥락에서, 향상된 TGFβ/BMP 시그널링은 동맥경화성 병변19의 개발초기 발생으로 밝혀졌으며 BMP 신호와의 간섭은 혈관 염증, 무종 형성 및 관련 석회화20을 현저하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
근접 결찰 분석법(PLA)은 situ21,22에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 생화학 적 기술입니다. 그것은 관심있는 표적 단백질을 결합할 수 있는 상이한 종의 항체의 특이성에 의존하여 단일 세포 수준에서 내인성 단백질 상호 작용의 매우 특이적인 검출을 허용합니다. 여기서, 1차 항체는 검출을 허용하기 위해 40nm 미만의 거리에서 표적 에피토프에 결합해야 한다.23. 따라서 PLA는 내인성 단백질 상호 작용을 감지하기 위해 수백만 개의 세포가 필요한 전통적인 공동 면역 침전 접근 에 크게 유용합니다. PLA에서, 종 특정 이차 항체는, DNA 단편에 공유하게 연결됩니다 (플러스와 마이너스 프로브라고 합니다), 1 차적인 항체를 묶고 관심의 단백질이 상호 작용하는 경우에, 플러스와 마이너스 프로브는 가까이에 옵니다. DNA는 다음 단계에서 결찰되고 원형 DNA의 롤링 원 증폭이 가능하게 된다. 증폭 하는 동안, 형광 표지 보완 올리고 뉴클레오티드 합성 된 DNA에 바인딩, 이러한 단백질 상호 작용을 허용 하는 기존의 형광 현미경 검사법에 의해 시각화 될 수.
여기에 설명된 프로토콜은 과학자들이 PLA를 사용하여 시험관내 의 에로히어로프로텍션 및 아로테경향이 있는 SS 조건에서 활성 SMAD 전사 복합체의 수를 정량적으로 비교할 수 있게 합니다. SS는 정의된 레벨의 라미나르 단방향 흐름을 생성할 수 있고 유량의 단계별 증가를 허용하는 프로그래밍 가능한 공압 펌프 시스템을 통해 생성됩니다. 이 방법을 사용하면 SMAD1/5 또는 SMAD2/3과 SMAD4 및 혼합 R-SMAD 복합체 간의 상호 작용을 감지할 수 있습니다. SMAD와 전사 공동 규제 기관과의 상호 작용을 분석하거나 SMAD 이외의 전사 인자 복합체로 쉽게 확장할 수 있습니다. 그림 1 은 아래에 제시된 프로토콜의 주요 단계를 보여 주세요.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> 그림 1: 설명된 프로토콜의 회로도 표현입니다. (A) 6채널 슬라이드에서 시드된 셀은 공압 펌프 시스템으로 전단 응력에 노출된다. (B) 고정 셀은 PLA 실험 또는 제어 조건에 사용됩니다. (C) PLA 실험의 이미지는 형광 현미경으로 획득하고 ImageJ 분석 소프트웨어를 사용하여 분석된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80606</td>
			<td>6-channel slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K298.1</td>
			<td>Quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.4</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stain DNA/Nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td>PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>MINUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>PLUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>PLA wash buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium (ECGS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf Serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4% buffered</td>
			<td>KLINIPATH/VWR</td>
			<td>VWRK4186.BO1</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&#160; 25 &#181;g/mL Hep +&#160;&#160; 50 &#181;g/mL ECGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, Type A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td>Use 0.1% in PBS for coating of flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v.7</td>
			<td>GarphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Program used for the Plots and statistical calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>supplement for medium (Hep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVECs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Mounting Medium</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Liquid mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Pump System</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>pneumatic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-80100</td>
			<td>supplement for medium (L-Glu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2154</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53745</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD2/3 Antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610843</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with CST 9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mousee anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Sanata Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7966</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>supplement for medium (P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set WHITE</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10963</td>
			<td>Tubings used for 1 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set YELLOW and GREEN</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Tubings used for 30 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9516</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>8685</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9515</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with BD 610843</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial Connector for &#181;-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10830</td>
			<td>serial connection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6683.1</td>
			<td>Permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay

성장인자 β 변형(TGFβ)/뼈 형태유전학 단백질(BMP) 시그널링은 혈관시스템의 발달 및 항상성 동안 엄격하게 조절되고 균형을 이루며, 따라서 이 신호 경로에서 의변조절은 폐동맥 고혈압, 유전출혈성 및 혈관경화와 같은 심한 혈관 병리를 초래한다. 혈관의 가장 안쪽 층인 내피 세포(EC)는 유체 전단 응력(SS)에 지속적으로 노출됩니다. 유체 SS의 비정상적인 패턴은 TGFβ/BMP 시그널링을 향상시키는 것으로 나타났으며, 이는 다른 자극과 함께, 괴로발생을 유도한다. 이와 관련하여, 아테로경향이, 낮은 라미나르 SS는 TGFβ/BMP 신호를 향상시키는 동시에 높은 라미나르 SS를 향상시키는 것으로 밝혀졌으며, 이 신호는 감소시킨다. 이러한 경로의 활성화를 효율적으로 분석하기 위해, 우리는 상용 공압 펌프 시스템과 근접 계합 분석 (PLA)를 사용하여 낮은 라미나르 SS 및 높은 라미나르 SS 조건하에서 전사 인자 복합체의 형성을 조사하기 위해 워크플로우를 설계했습니다.
활성 TGFβ/BMP 신호는 두 개의 규제 SMADs(R-SMAD)로 구성된 트리메릭 SMAD 복합체의 형성을 필요로 한다. SMAD2/3 및 SMAD1/5/8 TGFβ 및 BMP 시그널링에 대한 각각)을 공통 중재자 SMAD(공동 SMAD; SMAD4). 트리메릭 SMAD 복합체, 즉 R-SMAD/공동 SMAD 또는 R-SMAD/R-SMAD의 상이한 하위 단위를 대상으로 하는 PLA를 사용하여 활성 SMAD 전사 인자 복합체의 형성은 형광 현미경을 사용하여 정량적으로 그리고 공간적으로 측정될 수 있다.
6개의 작은 병렬 채널이 있는 플로우 슬라이드를 사용하면 연재하여 연결할 수 있으며, 전사 인자 복합 형성 및 필요한 컨트롤의 포함에 대한 조사를 가능하게 합니다. 
여기에 설명된 워크플로우는 다른 유체 SS 조건에서 SMAD가 아닌 다른 전사 인자 복합체에 대한 SMAD의 근접성을 대상으로 하는 연구에 쉽게 적응할 수 있습니다. 여기에 제시된 워크플로우는 정량적으로나 공간적으로 모두 EC에서 유도된 TGFβ/BMP 신호를 연구하는 빠르고 효과적인 방법을 보여줍니다.

우리는 이전에 다른 SMAD 단백질3의 상호 작용을 검출하기 위하여 PLA를 사용하고 SMAD 인산화28에 있는 전단 응력 유도한 변경을 분석했습니다.
여기서, 두 방법은 위에서 설명한 프로토콜과 결합되었다. HUVECs는 1 dyn/cm2 및 30 dyn/cm2 의 전단 응력에 복종하고 SMAD 전사 요인의 상호 작용을 위해 분석되었습니다. 높은 전단 응력(30dy...

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Visualization and Quantification of TGFÃƒÅ½Ã‚Â²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

여기서, 병리학및 생리학적 유체 전단 응력 조건에 노출된 내피 세포에서 근접 계각 분석(PLA)을 사용하여 여러 SMAD 복합체를 동시에 시각화하고 분석하는 프로토콜을 수립합니다.

근접-리깅-분석기 사용 이체 유체 전단 응력 조건 하에서 TGFβ/BMP/SMAD 신호의 시각화 및 정량화

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

이 프로토콜은 과학자들이 다른 전단 응력 조건하에서 전사 인자 복합체의 수를 정량적으로 비교할 수 있게 해주며 혈관 생물학 연구에 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 각각의 대조군을 포함하여 여러 항체 쌍의 조사를 동시에 허용하는 미세 유체 흐름 채널의 사용입니다. 우선, PBS에서 제조된 0.1%의 돼지 피부 젤라틴을 37도에서 30분간 채널에 추가하여 6개의 채널 슬라이드를 코팅합니다.M199 의 30 마이크로리터에서 밀리리터당 6세포로 2.5배 10배 의 밀도로 미리 코딩된 6개의 채널 슬라이드에서 젤라틴 용액및 종자 Huvecs에서 채널을 비웁니다. 가습 된 인큐베이터에서 세포가 섭씨 37도에서 1 시간 동안 부착되도록하십시오. 미리 경고된 M199 의 마이크로리터 60개를 각 저장소에 추가합니다.24 시간 후에 중간 보충을 가진 가습된 인큐베이터에서 2 일 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 실리콘 튜브를 유체 단위에 장착하고, 미리 경고된 M199 의 최소 10 밀리리터로 저장소를 채웁니다. 유체 단위를 튜브와 튜브를 펌프 시스템에 연결하고 세포 없이 사전 실행을 수행하여 배지를 평형화하고 남은 공기를 제거합니다.직렬 연결 튜브를 사용하여 6개 채널 슬라이드의 단일 채널을 연결합니다. 슬라이드의 첫 번째 및 마지막 채널을 유체 장치에 장착된 튜브에 연결합니다. 높은 수준의 스트레스에 세포를 노출하려면 적응 단계에서 현명하게 스트레스 단계를 늘려 30분당 평방 센티미터당 5개의 왕조의 증분 단계를 설정합니다.튜브의 덩어리를 사용하여 유체 전단 응력 노출 후 펌프에서 슬라이드를 분리하고 인큐베이터의 중간 유출을 피하고 얼음에 흐름 슬라이드를 전달합니다. 저수지에서 튜브를 분리하는 동안 손가락을 사용하여 저장소의 반대편을 닫아 채널의 기포를 포획하지 마십시오. 얼음에 흐름 슬라이드를 유지, 조심스럽게 저수지에서 매체를 흡인하지만 세포가 거주하는 채널에서.한 저수지에 PBS를 추가하고 다른 저수지에서 조심스럽게 흡인하여 90 마이크로리터의 냉멸 PBS로 샘플을 세척한 다음 모든 채널에서 반복합니다. PBS가 첨가된 동일한 저장소에 완충된 4%PFA 용액90마이크로리터를 추가하여 세포를 수정하고 입증된 바와 같이 다른 저수지에서 액체를 흡인시합니다. 6개의 채널에서 세포를 고정한 후, 샘플을 얼음에서 실온으로 옮기고 20분 동안 배양합니다.PBS를 하나의 저수지에 추가하고 모든 채널의 다른 저수지에서 조심스럽게 흡입하여 PBS로 세포를 세 번 세척하여 채널을 건조시키지 않도록주의하십시오. PBS에서 제조된 주변 15 밀리머암모늄 염화암모늄의 90마이크로리터를 저수지 중 하나에 추가하여 PFA에 대한 담금질 액세스 PFA. 다른 저수지에서 흡인하고 10 분 동안 세포를 배양합니다.빈 저수지에서 PBS에서 제조된 0.3%트리톤 X 100의 90 마이크로리터를 추가하여 세포를 투과화한다. 각 채널에 대한 다른 저수지에서 흡인하고 10 분 동안 배양 한 다음 이전에 설명 한 대로 PBS로 세 번 세척했습니다. 멸균 PLA 차단 용액의 90 마이크로 리터에서 하나의 저수지에.각 채널에 대해 다른 쪽에서 흡인하고 가습 챔버에서 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양합니다. PLA 항체 희석제 및 소용돌이에 1 차적인 항체를 추가합니다. 조심스럽게 저수지와 채널에서 차단 솔루션을 흡인.1차 항체 용액의 마이크로리터 30개를 즉시 빈 채널에 추가하여 슬라이드를 기울이면서 용액을 추가합니다. 모든 채널에 대해 반복하고 밤새 가습 챔버에서 섭씨 4도또는 1 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. PLA 항체 희석제에서 빼기 토끼와 마우스 PLA 프로브를 1~5개 희석시 희석시.90 마이크로리터의 워시 버퍼 A를 추가하고 입증된 대로 흡입하여 모든 채널을 두 번 세척하십시오. 세척 버퍼를 심은 후 PLA 프로브 용액 30 마이크로리터를 추가하고 가습 챔버에 배양합니다. 디이온화 수에서 결찰 버퍼를 1~5개 희석시키고 희석된 결찰 버퍼에서 1~40개의 리거스 효소를 희석시켰다.세척 버퍼 A를 세척하고 완전히 흡입한 후, 슬라이드를 기울이면서 빈 채널에 30 마이크로리터의 리칭 용액을 추가하고 가습 챔버에서 배양합니다. 증액 버퍼를 탈온화 된 물에 1 ~ 5 개를 희석 한 다음 얼음에 희석 된 증폭 완충제에서 폴리머 라제 효소를 1 ~ 80으로 희석시. 세척 버퍼 A를 세척하고 완전히 흡입한 후, 슬라이드를 기울이면서 빈 채널에 30 마이크로리터의 증폭 용액을 추가하고 가습 챔버에 배양합니다.DAPI를 세척 버퍼 B에서 1~500개까지 희석하고 세척 버퍼 B를 함유한 DAPI의 90마이크로리터를 추가하고 핵을 증기로 스며들기 위해 멸망시킴으로써 모든 채널을 한 번 세척한다. 그런 다음 모든 채널을 DAPI없이 세척 버퍼 B로 한 번 씻으시면됩니다. 세척 버퍼 B를 1~10으로 희석하고 희석된 세척 버퍼 B.aspirating wash 버퍼 B의 90 마이크로리터로 모든 채널을 한 번 세척한 후, 즉시 액체 장착 중간에 2~3방울을 넣고 모든 채널에 장착 매체를 분배합니다.이미징까지 가습된 환경에서 샘플을 섭씨 4도에 저장합니다. Huvecs는 높고 낮은 깎아지른 듯한 스트레스에 노출되었습니다. 낮은 전단 스트레스는 사이토솔과 핵에서 SMAD 단백질 상호 작용을 증가시켰습니다.단일 항체 대조군은 극소수의 신호에 나타나지 않았으며, 실험의 성공을 입증하였다. 항체 농도가 증가하여 세포당 PLA 이벤트가 더 많이 발생했지만, 높은 및 낮은 투명 응력 노출 세포 사이의 PLA 신호의 차이는 감소되었다. 차단 및 항체 희석을 위한 자체 제작 버퍼는 상업적 완충제의 대안으로 사용될 수 있다.상업 및 자체 수제 희석제 및 차단 용액에 대한 PLA 이벤트의 정량화는 세포및 핵 영역에서 PLA 신호의 동일한 패턴을 보여 주었다. 그러나 상업적 용액으로 셀당 총 PLA 이벤트 수가 더 많았습니다. SMAD 2/3의 조합, SMAD 4 항체는 면역 형광 실험에 적합하지 않은 곳에서 사용되었다.실험 대 대조군 조건에서 PLA 이벤트에 차이가 없었으며, PLA 이벤트를 검출하기 위해 올바른 항체 조합을 선택하는 것이 중요하다는 것을 나타낸다. 설명된 프로토콜은 SMAD와 다른 전사 인자 복합체의 상호 작용을 검출하기 위하여 적응될 수 있고 그러므로 영웅 경향이 있고 영웅 보호 조건에서 유전자 조절을 이해하는 것을 돕습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

연구

생화학

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

보호 그룹 산 - 불안정의 보존에 적합한 니켈 쉬프 - 자료의 가수 분해 복잡한 사용 조건

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions

엄격하게 혐기성 /안산 조건하에서 미생물의 재배를위한 중간 준비

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

세포와 조직에서 코엔자임 A의 정량화

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...