Name: visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

Vi takker Dr. Maria Reichenbach og Dr. Christian Hiepen for deres støtte til flytoppsettsystemet og Eleanor Fox og Yunyun Xiao for kritisk lesing av manuskriptet. P-L.M. ble finansiert av den internasjonale Max Planck Research School IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK fikk støtte av DFG-SFB1444. Figur 1 ble opprettet ved hjelp av BioRender.

1. Cellekultur og væskeskjær stresseksponering
MERK: Humane navlestrenger (HUVECs) ble brukt som et eksempel for å studere SS indusert interaksjon av SMADs. Protokollen beskrevet nedenfor kan brukes på alle SS responsive celletyper.
<ol><li>Frakk 6-kanals lysbilde med 0,1% porcin hud gelatin i PBS i 30 min ved 37 °C.</li>
	<li>Frø HUVECer i forhåndsbelagte 6-kanals lysbilder med en tetthet på 2,5 x 106 celler per ml i 30 μL M199 fullt medium. MERK: Hvis du vil ha mer i...

<ol>
	<li>Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+BMP+receptors:+Specificity,+activation+and+inhibition.">Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).</li><li>Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling.">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li><li>Hiepen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPR2+acts+as+a+gatekeeper+to+protect+endothelial+cells+from+increased+TGF&#946;+responses+and+altered+cell+mechanics.">BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGF&#946; responses and altered cell mechanics.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).</li><li>Hildebrandt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ActivinA+induced+SMAD1/5+Signaling+in+an+iPSC+derived+EC+model+of+Fibrodysplasia+Ossificans+Progressiva+(FOP)+can+be+rescued+by+the+drug+candidate+saracatinib.">ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+activation+state+of+the+endothelium+via+two+distinct+TGF-beta+type+I+receptors.">Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+receptor-like+kinase+(ALK)1+is+an+antagonistic+mediator+of+lateral+TGFbeta/ALK5+signaling.">Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling.</a> Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).</li><li>Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta-induced+Smad1/5+phosphorylation+in+epithelial+cells+is+mediated+by+novel+receptor+complexes+and+is+essential+for+anchorage-independent+growth.">Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).</li><li>Ramachandran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+uses+a+novel+mode+of+receptor+activation+to+phosphorylate+SMAD1/5+and+induce+epithelial-to-mesenchymal+transition.">TGF-&#946; uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition.</a> eLife. 7, 31756 (2018).</li><li>Flanders, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brightfield+proximity+ligation+assay+reveals+both+canonical+and+mixed+transforming+growth+factor-&#946;/bone+morphogenetic+protein+Smad+signaling+complexes+in+tissue+sections.">Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-&#946;/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).</li><li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).</li><li>Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+in+vascular+homeostasis+and+disease.">Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).</li><li>Cai, J., Pardali, E., S&#225;nchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+vascular+diseases.">BMP signaling in vascular diseases.</a> FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).</li><li>Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulated+TGF-&#946;/BMP+signaling+in+vascular+malformations.">Deregulated TGF-&#946;/BMP signaling in vascular malformations.</a> Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).</li><li>MacCarrick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loeys-Dietz+syndrome:+a+primer+for+diagnosis+and+management.">Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management.</a> Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Min, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Smad+2/3+signaling+by+low+shear+stress+mediates+artery+inward+remodeling.">Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling.</a> bioRxiv. , 691980 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+receptor-integrin+interaction+mediates+responses+of+vascular+endothelial+Smad1/5+and+proliferation+to+disturbed+flow.">BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-specific+activation+of+Smad1/5+regulates+vascular+endothelial+cell+cycle+progression+in+response+to+disturbed+flow.">Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).</li><li>van Dijk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+TGF-&#946;+and+BMP+signaling+in+human+atherosclerosis:+A+histological+evaluation+based+on+Smad+activation.">Visualizing TGF-&#946; and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation.</a> Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).</li><li>Derwall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+bone+morphogenetic+protein+signaling+reduces+vascular+calcification+and+atherosclerosis.">Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Alam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+Assay+(PLA).">Proximity Ligation Assay (PLA).</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).</li><li>Application Note 03: Growing Cells in &#181;-Channels. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf</a> (2012)</li><li>Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf</a> (2019)</li><li>ibidi. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Note+31:+Instructions+&#181;-Slide+VI+0.4.">Application Note 31: Instructions &#181;-Slide VI 0.4.</a> ibidi. , (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reichenbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+impact+of+fluid+shear+stress+and+YAP/TAZ+on+BMP/TGF-&#946;+induced+osteogenic+target+genes.">Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-&#946; induced osteogenic target genes.</a> Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).</li><li>Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+takes+two+to+tango:+Endothelial+TGF&#946;/BMP+signaling+crosstalk+with+mechanobiology.">It takes two to tango: Endothelial TGF&#946;/BMP signaling crosstalk with mechanobiology.</a> Cells. 9 (9), 1965 (2020).</li></ol>

Den PLA-baserte protokollen som er beskrevet her, gir en effektiv måte å bestemme nærhet til to proteiner (f.eks. deres direkte interaksjon) i ES utsatt for skjærspenning med kvantitativ og romlig oppløsning. Ved å bruke strømningslysbilder med flere parallelle kanaler, kan flere forskjellige proteininteraksjoner undersøkes samtidig i celler under identiske mekaniske forhold. I motsetning benytter spesialbygde strømningskammersystemer ofte en enkelt kanal som er bygget rundt en glassdekslelip, noe som bare vil t...

Proteiner av de transformerende vekstfaktorene beta (TGFβ) superfamilie er pleiotrope cytokiner med en rekke medlemmer, inkludert TGFβs, benmorfogenetiske proteiner (BMPer) og Activins1,2. Ligandbinding induserer dannelsen av reseptor oligomerer som fører til fosforylering og dermed aktivering av cytosolisk regulatorisk SMAD (R-SMAD). Avhengig av underfamilien av ligander, aktiveres forskjellige R-SMADer1,2. Mens TGFβs og Activins hovedsakelig induserer fosforylering av SMAD2/3, induserer BMPer SMAD1/5/8 fosforylering. Imidlertid er det akkumulerende bevis for at BMPer og TGFβs / Activins også aktiverer R-SMADs av de respektive andre underfamiliene, i en prosess som betegnes som 'lateral signalering'3,4,5,6,7,8 og at det er blandede SMAD-komplekser som består av begge deler, SMAD1/5 og SMAD2/3, medlemmer3,9 . To aktiverte R-SMADer danner deretter trimeriske komplekser med den vanlige megleren SMAD4. Disse transkripsjonsfaktorkompleksene er da i stand til å omfordele seg til kjernen og regulere transkripsjonen av målgener. SMAD-er kan samhandle med en rekke forskjellige transkripsjonelle medaktivatorer og medundertrykkere, noe som fører til diversifisering av mulighetene for å regulere målgener10. Deregulering av SMAD-signalering har alvorlige implikasjoner ved en rekke sykdommer. I tråd med dette kan ubalansert TGFβ/BMP-signalering føre til alvorlige vaskulære patologier, som pulmonal arterie hypertensjon, arvelig hemorragisk telangiectasia, eller aterosklerose3,11,12,13,14.
Endotelceller (ECs) danner det innerste laget av blodkar og er derfor utsatt for skjærspenning (SS), en friksjonskraft som utøves av blodets viskøse strøm. Interessant nok holdes ECer som bor i de delene av vaskulaturen, som er utsatt for høye nivåer av uniform, laminær SS, i en homeostatisk og passiv tilstand. Derimot er ECer som opplever lav, ikke-ensartet SS, for eksempel ved bifurkasjoner eller den mindre krumningen i aortabuen, proliferative og aktiverer inflammatoriske veier15. I sin tur er steder med dysfunksjonelle ECer tilbøyelige til å utvikle aterosklerose. Interessant nok viser ECer i disse ateropronområdene avvikende høye nivåer av aktivert SMAD2/3 og SMAD1/516,17,18. I denne sammenhengen ble forbedret TGFβ/BMP-signalering funnet å være en tidlig hendelse i utviklingen av aterosklerotiske lesjoner19, og forstyrrelser med BMP-signalering ble funnet å redusere vaskulær betennelse, ateromadannelse og tilhørende forkalkning20.
Proximity Ligation Assay (PLA) er en biokjemisk teknikk for å studere proteinproteininteraksjoner i situ21,22. Det er avhengig av spesifisiteten av antistoffer av forskjellige arter som kan binde målproteiner av interesse, noe som tillater svært spesifikk påvisning av endogene proteininteraksjoner på et enkeltcellet nivå. Her må primære antistoffer binde seg til målepilotopen i en avstand på mindre enn 40 nm for å tillate deteksjon23. Derfor er PLA svært gunstig i forhold til tradisjonelle co-immunoprecipitation tilnærminger, hvor flere millioner celler er nødvendig for å oppdage endogene proteininteraksjoner. I PLA binder artsspesifikke sekundære antistoffer, kovalent knyttet til DNA-fragmenter (kalt Plus- og Minus-sonder), de primære antistoffene, og hvis proteinene av interesse samhandler, kommer Plus- og Minus-sonder i nærheten. DNA-et blir ligatert i følgende trinn, og den rullende sirkelforsterkningen av det sirkulære DNA-et er muliggjort. Under forsterkning binder fluorescerende merket komplementære oligonukleotider seg til det syntetiserte DNA-et, slik at disse proteininteraksjonene kan visualiseres ved konvensjonell fluorescensmikroskopi.
Protokollen beskrevet her gjør det mulig for forskere å kvantitativt sammenligne antall aktive SMAD-transkripsjonskomplekser ved ateroprotektive og atheroprone SS-forhold in vitro ved hjelp av PLA. SS genereres via et programmerbart pneumatisk pumpesystem som er i stand til å generere laminær enveisstrøm av definerte nivåer og tillater trinnvise økninger av strømningshastigheter. Denne metoden gjør det mulig å oppdage interaksjoner mellom SMAD1/5 eller SMAD2/3 med SMAD4, samt blandede R-SMAD-komplekser. Det kan enkelt utvides for å analysere interaksjoner mellom SMADer med transkripsjonelle medregulatorer eller til andre transkripsjonsfaktorkomplekser enn SMADer. Figur 1 viser hovedtrinnene i protokollen som presenteres nedenfor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk representasjon av protokollen som er beskrevet. (A) Celler frøet i 6-kanals lysbilder er utsatt for skjærspenning med et pneumatisk pumpesystem. (B) Faste celler brukes til PLA-eksperiment eller for kontrollforhold. (C) Bilder av PLA-eksperimenter er anskaffet med et fluorescensmikroskop og analyseres ved hjelp av ImageJ analyseprogramvare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80606</td>
			<td>6-channel slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K298.1</td>
			<td>Quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.4</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stain DNA/Nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td>PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>MINUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>PLUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>PLA wash buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium (ECGS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf Serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4% buffered</td>
			<td>KLINIPATH/VWR</td>
			<td>VWRK4186.BO1</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&#160; 25 &#181;g/mL Hep +&#160;&#160; 50 &#181;g/mL ECGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, Type A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td>Use 0.1% in PBS for coating of flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v.7</td>
			<td>GarphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Program used for the Plots and statistical calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>supplement for medium (Hep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVECs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Mounting Medium</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Liquid mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Pump System</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>pneumatic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-80100</td>
			<td>supplement for medium (L-Glu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2154</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53745</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD2/3 Antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610843</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with CST 9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mousee anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Sanata Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7966</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>supplement for medium (P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set WHITE</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10963</td>
			<td>Tubings used for 1 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set YELLOW and GREEN</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Tubings used for 30 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9516</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>8685</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9515</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with BD 610843</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial Connector for &#181;-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10830</td>
			<td>serial connection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6683.1</td>
			<td>Permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay

Transformerende vekstfaktor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signalering er tett regulert og balansert under utvikling og homeostase av vaskulatursystemet Derfor resulterer deregulering i denne signalveien i alvorlige vaskulære patologier, som lungearterie hypertensjon, arvelig hemorragisk telangiectasia og aterosklerose. Endotelceller (ECs), som det innerste laget av blodkar, blir stadig utsatt for væskeskjærspenning (SS). Unormale mønstre av flytende SS har vist seg å forbedre TGFβ / BMP-signalering, som sammen med andre stimuli induserer aterogenese. I forhold til dette ble det funnet ateropron, lav laminær SS for å forbedre TGFβ / BMP-signalering mens ateroprotektive, høy laminære SS, reduserer denne signalingen. For effektivt å analysere aktiveringen av disse veiene, designet vi en arbeidsflyt for å undersøke dannelsen av transkripsjonsfaktorkomplekser under lav laminær SS og høye laminære SS-forhold ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig pneumatisk pumpesystem og nærhetsligasjonsanalyse (PLA).
Aktiv TGFβ/BMP-signalering krever dannelse av trimeriske SMAD-komplekser som består av to regulatoriske SMADer (R-SMAD); SMAD2/3 og SMAD1/5/8 for TGFβ- og BMP-signalering) med en felles mellommann SMAD (co-SMAD; SMAD4). Ved hjelp av PLA rettet mot ulike underenheter av det trimeriske SMAD-komplekset, det vil si enten R-SMAD/co-SMAD eller R-SMAD/R-SMAD, kan dannelsen av aktive SMAD-transkripsjonsfaktorkomplekser måles kvantitativt og romlig ved hjelp av fluorescensmikroskopi.
Bruken av strømningslysbilder med 6 små parallelle kanaler, som kan kobles i serie, muliggjør undersøkelse av transkripsjonsfaktorkompleksdannelsen og inkludering av nødvendige kontroller. 
Arbeidsflyten som forklares her, kan enkelt tilpasses for studier rettet mot nærhet av SMADer til andre transkripsjonsfaktorer eller til transkripsjonsfaktorkomplekser annet enn SMADs, under forskjellige flytende SS-forhold. Arbeidsflyten som presenteres her viser en rask og effektiv måte å studere den flytende SS-induserte TGFβ / BMP-signalisering i ECs, både kvantitativt og romlig.

Vi har tidligere brukt PLA til å oppdage interaksjoner mellom ulike SMAD-proteiner3 og analysert skjærspenning induserte endringer i SMAD fosforylering28.
Her ble begge metodene kombinert med protokollen beskrevet ovenfor. HUVEC ble utsatt for skjærspenning på 1 dyn/cm2 og 30 dyn/cm2 og analysert for interaksjoner mellom SMAD-transkripsjonsfaktorer. Vi viser at sammenlignet med høy skjærspenning (30 dyn/cm2)...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

Visualization and Quantification of TGFÃƒÅ½Ã‚Â²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Her etablerer vi en protokoll for samtidig å visualisere og analysere flere SMAD-komplekser ved hjelp av nærhetsligasjonsanalyse (PLA) i endotelceller utsatt for patologiske og fysiologiske væskeskjærstressforhold.

Visualisering og kvantifisering av TGFβ/BMP/SMAD-signalering under ulike væskeskjærespenningsforhold ved hjelp av Proximity-Ligation-Assay

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Denne protokollen gjør det mulig for forskere å kvantitativt sammenligne antall transkripsjonsfaktorkomplekser under forskjellige skjærspenningsforhold, og vil være gunstig for forskning i vaskulær biologi. Den største fordelen med denne protokollen er bruken av mikrofluidiske strømningskanaler som tillater undersøkelser av flere antistoffpar, inkludert de respektive kontrollene samtidig. Til å begynne med, belegge sekskanals lysbilde ved å legge til 0,1% porcin hud gelatin tilberedt i PBS i kanalene i 30 minutter ved 37 grader Celsius.Tøm kanalene fra gelatinoppløsningen og frø huvecs i forhåndskodede sekskanals lysbilder med en tetthet på 2,5 ganger 10 til sjette celler per milliliter i 30 mikroliter M199 komplett medium. La cellene holde seg i en time ved 37 grader Celsius i den fuktede inkubatoren. Tilsett 60 mikroliter med forhåndsvarslet M199 komplett medium til hvert av reservoarene.Kultur cellene ved 37 grader Celsius i to dager i en fuktet inkubator med middels erstatning etter 24 timer. Monter silisiumslangen på de fluidiske enhetene, fyll reservoarene med minst 10 milliliter forhåndsvarslet M199 komplett medium. Koble de fluidiske enhetene med slanger til pumpesystemet og utfør forløpet uten celler for å likevekte mediet og fjerne eventuell gjenværende luft.Koble til enkeltkanalene på de seks kanallysbildene ved hjelp av den serielle tilkoblingsslangen. Koble den første og siste kanalen på lysbildet til rørene som er montert på fluidikkenheten. For eksponering av cellene til høye nivåer av ren stress, øk det rene stresstrinnet klokt med tilpasningsfaser, og sett trinnene i trinn på fem dyner per kvadratcentimeter per 30 minutter.Bruk klumpene på slangen til å løsne skliene fra pumper etter væskesaksens stresseksponering, unngå middels søl i inkubatoren og overføre strømningsskred på is. Mens du løsner slangen fra reservoarene, bruk fingeren til å lukke den andre siden av reservoaret for å unngå å fange luftboblene i kanalen. Hold strømningsskredet på is, aspirer mediet forsiktig fra reservoarene, men ikke fra kanalen der cellene ligger.Vask prøvene med 90 mikroliter kaldsteril PBS ved å tilsette PBS i ett reservoar og aspirere forsiktig fra det andre reservoaret, og gjenta deretter for alle kanaler. Fest cellene ved å tilsette 90 mikroliter bufret 4% PFA-løsning i samme reservoar der PBS ble tilsatt og aspirer væsken fra det andre reservoaret som vist. Etter å ha fikset cellene i alle seks kanaler, overfør prøvene fra is til romtemperatur, og inkuber i 20 minutter.Vask cellene tre ganger med PBS ved å legge PBS til ett reservoar og aspirere det forsiktig fra det andre reservoaret i alle kanaler, og pass på at du ikke tørker ut kanalene. Slukk tilgangen til PFA ved å tilsette 90 mikroliter omgivelses-15 millimolar ammoniumklorid tilberedt i PBS til et av reservoarene. Aspirer fra det andre reservoaret og inkuber cellene i 10 minutter.Permeabiliser cellene ved å tilsette 90 mikroliter 0,3% Triton X 100 fremstilt i PBS i det tomme reservoaret. Aspirer fra det andre reservoaret for hver kanal og inkuber i 10 minutter, deretter vasket tre ganger med PBS som vist før. Ved 90 mikroliter steril PLA-blokkeringsløsning til ett reservoar.Aspirer fra den andre siden for hver kanal og inkuber i en time ved 37 grader Celsius i et fuktet kammer. Tilsett primære antistoffer i PLA antistoff fortynningsmiddel og virvel. Aspirer forsiktig blokkeringsløsningen fra reservoarene og kanalene.Tilsett 30 mikroliter av den primære antistoffløsningen umiddelbart i den tomme kanalen ved å vippe lysbildet mens du legger til løsningen. Gjenta for alle kanaler og inkuber ved fire grader Celsius i det fuktede kammeret over natten eller ved 37 grader Celsius i en time. Fortynn minus kanin og pluss mus PLA sonder en til fem i PLA antistoff fortynningsmiddel.Vask alle kanalene to ganger ved å legge til 90 mikroliter vaskebuffer A og aspirere som vist. Etter å ha aspirert vaskebufferen, tilsett 30 mikroliter PLA-sondeoppløsning og inkuber i det fuktede kammeret. Fortynn ligasjonsbufferen en til fem i D ionisert vann og fortynn lygusenzymet en til 40 i den fortynnede ligasjonsbufferen.Etter vask og fullstendig aspirering av vaskebufferen A, tilsett 30 mikroliter ligasjonsløsning til de tomme kanalene mens du vipper lysbildet, og inkuber i det fuktede kammeret. Fortynn forsterkningsbufferen en til fem i deionisert vann, og fortynn deretter polymeraseenzymet en til 80 i den fortynnede forsterkningsbufferen på is. Etter vask og fullstendig aspirering av vaskebufferen A, tilsett 30 mikroliter forsterkningsløsning til de tomme kanalene mens du vipper lysbildet, og inkuber det i det fuktede kammeret.Fortynn DAPI en til 500 i vaskebuffer B og vask alle kanalene en gang ved å legge til 90 mikroliter DAPI som inneholder vaskebuffer B, og aspirere som vist for å dampe kjernene. Vask deretter alle kanalene en gang med vaskebuffer B uten DAPI. Fortynn vaskebufferen B en til 10 i deionisert vann og vask alle kanalene en gang med 90 mikroliter fortynnet vaskebuffer B.Etter aspirerende vaskebuffer B, tilsett umiddelbart to til tre dråper flytende monteringsmedium til ett reservoar, og vipp gliden for å fordele monteringsmediet i alle kanaler.Oppbevar prøvene ved fire grader Celsius i et fuktet miljø til avbildning. Huvecs ble utsatt for høy og lav ren stress. Det lave skjærstresset økte SMAD-proteininteraksjonene i cytosol og kjerner.Enkle antistoffkontroller viste nei til svært få signaler, noe som beviste suksessen til eksperimentet. Økt antistoffkonsentrasjon resulterte i et høyere antall PLA-hendelser per celle, men forskjellen i PLA-signaler mellom høye og lave stressutsatte celler ble redusert. Selvlagde buffere for blokkering og antistofffortynning kan brukes som et alternativ for kommersielle buffere.Kvantifiseringen av PLA-hendelser for kommersielle og selvlagde fortynnings- og blokkeringsløsninger viste samme mønster av PLA-signaler i de cytosoliske og kjernefysiske områdene. Det totale antallet PLA-hendelser per celle var imidlertid høyere med kommersielle løsninger. En kombinasjon av SMAD Two/Three, SMAD Fire antistoffer ble brukt der SMAD Four-antistoffet ikke var egnet for immunfluorescenseksperimenter.Det var ingen forskjell i PLA-hendelser i eksperimentell versus kontrolltilstand, noe som indikerer viktigheten av å velge riktig antistoffkombinasjon for å oppdage PLA-hendelsene. Den beskrevne protokollen kan tilpasses for å oppdage samspillet mellom transkripsjonsfaktorkomplekser forskjellig fra SMADs og derfor bidra til å forstå genregulering i atero utsatte og atero beskyttende forhold.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifisering av bakteriell histidin kinase Autofosforylering Ved hjelp av en Nitrocellulose bindingsanalyse

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisering av Protein-protein Interaksjon i Kjerne- og cytoplasmatiske Fraksjoner av Co-immunoprecipitation og<em&gt; In Situ</em&gt; Nærhet hemorroider Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolyse av en Ni-Schiff-basekompleks ved hjelp av betingelser som er egnet for oppbevaring av syre-labil beskyttelsesgrupper

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Deteksjon og visualisering av DNA-skadeinducerte proteinkomplekser i suspensjoncellekulturer ved bruk av næringslysanalysen

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Deteksjon av Heterodimerization av Protein isoformene bruker in Situ nærhet Ligation analysen

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifisering av Hypopigmentation aktivitet i Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifisering av protein samspill nettverk dynamikk ved hjelp av multiplekset co-Immunutfelling

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions

Medium forberedelse til dyrking av mikroorganismer under strengt anaerob/anoksisk forhold

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantifisering av koenzym A i celler og vev

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...