Name: visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

Agradecemos a la Dra. Maria Reichenbach y al Dr. Christian Hiepen por su apoyo en el sistema de configuración de flujo y a Eleanor Fox y Yunyun Xiao por leer críticamente el manuscrito. P-L.M. fue financiado por la escuela internacional de investigación Max Planck IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK recibió financiación de la DFG-SFB1444. La Figura 1 se creó utilizando BioRender.

1. Cultivo celular y exposición al estrés por cizallamiento de fluidos
NOTA: Las CE de vena umbilical humana (HUVEC) se utilizaron como ejemplo para estudiar la interacción inducida por SS de los SMAD. El protocolo que se describe a continuación se puede aplicar a cada tipo de célula sensible a SS.
<ol><li>Cubra el portaobjetos de 6 canales con gelatina de piel porcina al 0,1% en PBS durante 30 min a 37 °C.</li>
	<li>HUVEC de semillas en portaobjetos pre-recubiertos de 6 canales a una ...

<ol>
	<li>Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+BMP+receptors:+Specificity,+activation+and+inhibition.">Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).</li><li>Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling.">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li><li>Hiepen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPR2+acts+as+a+gatekeeper+to+protect+endothelial+cells+from+increased+TGF&#946;+responses+and+altered+cell+mechanics.">BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGF&#946; responses and altered cell mechanics.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).</li><li>Hildebrandt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ActivinA+induced+SMAD1/5+Signaling+in+an+iPSC+derived+EC+model+of+Fibrodysplasia+Ossificans+Progressiva+(FOP)+can+be+rescued+by+the+drug+candidate+saracatinib.">ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+activation+state+of+the+endothelium+via+two+distinct+TGF-beta+type+I+receptors.">Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+receptor-like+kinase+(ALK)1+is+an+antagonistic+mediator+of+lateral+TGFbeta/ALK5+signaling.">Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling.</a> Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).</li><li>Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta-induced+Smad1/5+phosphorylation+in+epithelial+cells+is+mediated+by+novel+receptor+complexes+and+is+essential+for+anchorage-independent+growth.">Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).</li><li>Ramachandran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+uses+a+novel+mode+of+receptor+activation+to+phosphorylate+SMAD1/5+and+induce+epithelial-to-mesenchymal+transition.">TGF-&#946; uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition.</a> eLife. 7, 31756 (2018).</li><li>Flanders, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brightfield+proximity+ligation+assay+reveals+both+canonical+and+mixed+transforming+growth+factor-&#946;/bone+morphogenetic+protein+Smad+signaling+complexes+in+tissue+sections.">Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-&#946;/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).</li><li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).</li><li>Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+in+vascular+homeostasis+and+disease.">Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).</li><li>Cai, J., Pardali, E., S&#225;nchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+vascular+diseases.">BMP signaling in vascular diseases.</a> FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).</li><li>Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulated+TGF-&#946;/BMP+signaling+in+vascular+malformations.">Deregulated TGF-&#946;/BMP signaling in vascular malformations.</a> Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).</li><li>MacCarrick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loeys-Dietz+syndrome:+a+primer+for+diagnosis+and+management.">Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management.</a> Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Min, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Smad+2/3+signaling+by+low+shear+stress+mediates+artery+inward+remodeling.">Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling.</a> bioRxiv. , 691980 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+receptor-integrin+interaction+mediates+responses+of+vascular+endothelial+Smad1/5+and+proliferation+to+disturbed+flow.">BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-specific+activation+of+Smad1/5+regulates+vascular+endothelial+cell+cycle+progression+in+response+to+disturbed+flow.">Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).</li><li>van Dijk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+TGF-&#946;+and+BMP+signaling+in+human+atherosclerosis:+A+histological+evaluation+based+on+Smad+activation.">Visualizing TGF-&#946; and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation.</a> Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).</li><li>Derwall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+bone+morphogenetic+protein+signaling+reduces+vascular+calcification+and+atherosclerosis.">Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Alam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+Assay+(PLA).">Proximity Ligation Assay (PLA).</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).</li><li>Application Note 03: Growing Cells in &#181;-Channels. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf</a> (2012)</li><li>Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf</a> (2019)</li><li>ibidi. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Note+31:+Instructions+&#181;-Slide+VI+0.4.">Application Note 31: Instructions &#181;-Slide VI 0.4.</a> ibidi. , (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reichenbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+impact+of+fluid+shear+stress+and+YAP/TAZ+on+BMP/TGF-&#946;+induced+osteogenic+target+genes.">Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-&#946; induced osteogenic target genes.</a> Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).</li><li>Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+takes+two+to+tango:+Endothelial+TGF&#946;/BMP+signaling+crosstalk+with+mechanobiology.">It takes two to tango: Endothelial TGF&#946;/BMP signaling crosstalk with mechanobiology.</a> Cells. 9 (9), 1965 (2020).</li></ol>

El protocolo basado en PLA descrito aquí ofrece una forma eficiente de determinar la proximidad de dos proteínas (por ejemplo, su interacción directa) en CE expuestas a tensión cortante con resolución cuantitativa y espacial. Mediante el uso de portaobjetos de flujo con múltiples canales paralelos, se pueden examinar varias interacciones de proteínas diferentes al mismo tiempo en células en condiciones mecánicas idénticas. Por el contrario, los sistemas de cámara de flujo personalizados a menudo hacen uso de u...

Las proteínas de la superfamilia de factores de crecimiento transformantes beta (TGFβ) son citoquinas pleiotrópicas con una variedad de miembros, incluyendo TGFβs, proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y activinas1,2. La unión al ligando induce la formación de oligómeros receptores que conducen a la fosforilación y, por lo tanto, a la activación del SMAD regulador citosólico (R-SMAD). Dependiendo de la subfamilia de ligandos, se activan diferentes R-SMADs1,2. Mientras que TGFβs y Activinas inducen principalmente la fosforilación de SMAD2/3, los BMP inducen la fosforilación de SMAD1/5/8. Sin embargo, se acumulan evidencias de que los BMP y TGFβs/Activinas también activan los R-SMAD de la otra subfamilia respectiva, en un proceso denominado como 'señalización lateral'3,4,5,6,7,8 y que existen complejos SMAD mixtos formados por ambos, SMAD1/5 y SMAD2/3, miembros3,9 . Dos R-SMAD activados posteriormente forman complejos triméricos con el mediador común SMAD4. Estos complejos de factores de transcripción son capaces de translocarse al núcleo y regular la transcripción de genes diana. Los SMADs pueden interactuar con una variedad de diferentes co-activadores transcripcionales y co-represores, lo que lleva a la diversificación de las posibilidades de regular los genes diana10. La desregulación de la señalización SMAD tiene graves implicaciones en una variedad de enfermedades. En línea con esto, la señalización desequilibrada de TGFβ/BMP puede conducir a patologías vasculares graves, como hipertensión arterial pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditaria o aterosclerosis3,11,12,13,14.
Las células endoteliales (CE) forman la capa más interna de los vasos sanguíneos y, por lo tanto, están expuestas al estrés cortante (SS), una fuerza de fricción ejercida por el flujo viscoso de la sangre. Curiosamente, las CE que residen en las partes de la vasculatura, que están expuestas a altos niveles de SS laminar uniforme, se mantienen en un estado homeostático y quiescente. Por el contrario, las CE que experimentan SS bajas y no uniformes, por ejemplo, en bifurcaciones o en la menor curvatura del arco aórtico, son proliferativas y activan vías inflamatorias15. A su vez, los sitios de CE disfuncionales son propensos a desarrollar aterosclerosis. Curiosamente, las CE en estas áreas de ateróprona muestran niveles aberrantemente altos de SMAD2/3 y SMAD1/516 activados,17,18. En este contexto, se encontró que la señalización mejorada de TGFβ/BMP era un evento temprano en el desarrollo de lesiones ateroscleróticas19 y se encontró que la interferencia con la señalización de BMP reduce notablemente la inflamación vascular, la formación de ateroma y la calcificación asociada20.
El Ensayo de Ligadura de Proximidad (PLA) es una técnica bioquímica para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína21,22. Se basa en la especificidad de anticuerpos de diferentes especies que pueden unirse a proteínas diana de interés, lo que permite una detección altamente específica de interacciones de proteínas endógenas a nivel de una sola célula. Aquí, los anticuerpos primarios tienen que unirse a su epítopo objetivo a una distancia de menos de 40 nm para permitir la detección23. Por lo tanto, el PLA es muy beneficioso sobre los enfoques tradicionales de coinmunoprecipitación, donde se necesitan varios millones de células para detectar interacciones endógenas de proteínas. En el PLA, los anticuerpos secundarios específicos de la especie, unidos covalentemente a fragmentos de ADN (denominados sondas Plus y Minus), se unen a los anticuerpos primarios y si las proteínas de interés interactúan, las sondas Plus y Minus se acercan mucho. El ADN se liga en el siguiente paso y la amplificación del círculo rodante del ADN circular es posible. Durante la amplificación, los oligonucleótidos complementarios marcados fluorescentemente se unen al ADN sintetizado, lo que permite que estas interacciones proteicas se visualicen mediante microscopía de fluorescencia convencional.
El protocolo descrito aquí permite a los científicos comparar cuantitativamente el número de complejos de transcripción SMAD activos en condiciones de SS ateroprotectoras y ateroprofónicas in vitro utilizando PLA. SS se genera a través de un sistema de bomba neumática programable que es capaz de generar flujo unidireccional laminar de niveles definidos y permite aumentos escalonados de los caudales. Este método permite la detección de interacciones entre SMAD1/5 o SMAD2/3 con SMAD4, así como complejos mixtos-R-SMAD. Se puede ampliar fácilmente para analizar las interacciones de los SMAD con los co-reguladores transcripcionales o con complejos de factores de transcripción distintos de los SMAD. La Figura 1 muestra los principales pasos del protocolo que se presentan a continuación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática del protocolo descrito. (A) Las células sembradas en portaobjetos de 6 canales se exponen a la tensión de cizallamiento con un sistema de bomba neumática. (B) Las células fijas se utilizan para experimentos de PLA o para condiciones de control. (C) Las imágenes de los experimentos de PLA se adquieren con un microscopio de fluorescencia y se analizan utilizando el software de análisis ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80606</td>
			<td>6-channel slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K298.1</td>
			<td>Quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.4</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stain DNA/Nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td>PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>MINUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>PLUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>PLA wash buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium (ECGS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf Serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4% buffered</td>
			<td>KLINIPATH/VWR</td>
			<td>VWRK4186.BO1</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&#160; 25 &#181;g/mL Hep +&#160;&#160; 50 &#181;g/mL ECGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, Type A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td>Use 0.1% in PBS for coating of flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v.7</td>
			<td>GarphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Program used for the Plots and statistical calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>supplement for medium (Hep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVECs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Mounting Medium</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Liquid mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Pump System</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>pneumatic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-80100</td>
			<td>supplement for medium (L-Glu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2154</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53745</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD2/3 Antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610843</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with CST 9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mousee anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Sanata Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7966</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>supplement for medium (P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set WHITE</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10963</td>
			<td>Tubings used for 1 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set YELLOW and GREEN</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Tubings used for 30 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9516</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>8685</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9515</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with BD 610843</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial Connector for &#181;-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10830</td>
			<td>serial connection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6683.1</td>
			<td>Permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay

La señalización del factor de crecimiento transformador β (TGFβ)/proteína morfogenética ósea (BMP) está estrechamente regulada y equilibrada durante el desarrollo y la homeostasis del sistema de vasculatura Por lo tanto, la desregulación en esta vía de señalización da como resultado patologías vasculares graves, como hipertensión arterial pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditaria y aterosclerosis. Las células endoteliales (CE), como la capa más interna de los vasos sanguíneos, están constantemente expuestas al estrés por cizallamiento de líquidos (SS). Se ha demostrado que los patrones anormales de SS de líquido mejoran la señalización TGFβ / BMP, que, junto con otros estímulos, inducen aterogénesis. En relación con esto, se encontró que la ateroprofona, SS laminar baja, mejora la señalización TGFβ / BMP, mientras que la SS ateroprotectora y laminar alta disminuye esta señalización. Para analizar de manera eficiente la activación de estas vías, diseñamos un flujo de trabajo para investigar la formación de complejos de factores de transcripción en condiciones de SS laminar baja y SS laminar alta utilizando un sistema de bomba neumática disponible comercialmente y un ensayo de ligadura de proximidad (PLA).
La señalización activa de TGFβ/BMP requiere la formación de complejos SMAD triméricos que consisten en dos SMAD reguladores (R-SMAD); SMAD2/3 y SMAD1/5/8 para la señalización TGFβ y BMP, respectivamente) con un mediador común SMAD (co-SMAD; SMAD4). Utilizando PLA dirigido a diferentes subunidades del complejo SMAD trimérico, es decir, R-SMAD /co-SMAD o R-SMAD/R-SMAD, la formación de complejos activos de factor de transcripción SMAD se puede medir cuantitativa y espacialmente utilizando microscopía de fluorescencia.
El uso de diapositivas de flujo con 6 pequeños canales paralelos, que se pueden conectar en serie, permite la investigación de la formación del complejo del factor de transcripción y la inclusión de los controles necesarios. 
El flujo de trabajo explicado aquí se puede adaptar fácilmente para estudios dirigidos a la proximidad de los SMAD a otros factores de transcripción o a complejos de factores de transcripción distintos de los SMAD, en diferentes condiciones de SS fluidos. El flujo de trabajo presentado aquí muestra una forma rápida y efectiva de estudiar la señalización fluida inducida por SS TGFβ / BMP en ECs, tanto cuantitativa como espacialmente.

Anteriormente hemos utilizado PLA para detectar interacciones de diferentes proteínas SMAD3 y analizado cambios inducidos por estrés cortante en la fosforilación de SMAD28.
Aquí, ambos métodos se combinaron con el protocolo descrito anteriormente. Los HUVEC fueron sometidos a un esfuerzo cortante de 1 dina/cm2 y 30 dinas/cm2 y analizados para detectar interacciones de factores de transcripción SMAD. Mostramos que, en c...

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Visualization and Quantification of TGFÃƒÅ½Ã‚Â²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Aquí, establecemos un protocolo para visualizar y analizar simultáneamente múltiples complejos SMAD utilizando el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) en células endoteliales expuestas a condiciones patológicas y fisiológicas de estrés por cizallamiento de fluidos.

Visualización y cuantificación de la señalización TGFβ/BMP/SMAD bajo diferentes condiciones de tensión por cizallamiento de fluidos mediante ensayo de ligadura de proximidad

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Este protocolo permite a los científicos comparar cuantitativamente el número de complejos de factores de transcripción en diferentes condiciones de estrés cortante, y será beneficioso para la investigación en biología vascular. La principal ventaja de este protocolo es el uso de canales de flujo microfluídico que permiten la investigación de varios pares de anticuerpos, incluidos los controles respectivos simultáneamente. Para comenzar, cubra la diapositiva de seis canales agregando gelatina de piel porcina al 0.1% preparada en PBS en los canales durante 30 minutos a 37 grados centígrados.Vacíe los canales de la solución de gelatina y sepe Huvecs en los portaobjetos de seis canales precodificados a una densidad de 2,5 veces 10 a la sexta celda por mililitro en 30 microlitros de medio completo M199. Deje que las células se adhieran durante una hora a 37 grados centígrados en la incubadora humidificada. Agregue 60 microlitros de medio completo M199 preadvertido a cada uno de los reservorios.Cultive las células a 37 grados centígrados durante dos días en una incubadora humidificada con reemplazo medio después de 24 horas. Monte el tubo de silicio en las unidades fluídicas, llene los depósitos con un mínimo de 10 mililitros de medio completo M199 preadvertido. Conecte las unidades fluídicas con tubos al sistema de bombeo y realice la pre-ejecución sin celdas para equilibrar el medio y eliminar el aire restante.Conecte los canales individuales en la diapositiva de seis canales utilizando el tubo de conexión serie. Conecte el primer y último canal de la corredera a los tubos montados en la unidad de fluidos. Para la exposición de las células a altos niveles de estrés puro, aumente el estrés puro paso a paso con fases de adaptación, estableciendo los pasos en incrementos de cinco dinas por centímetro cuadrado por 30 minutos.Use los grupos en el tubo para separar los portaobjetos de las bombas después de la exposición al esfuerzo de cizallamiento del fluido, evitando derrames medios en la incubadora y transfiera los portaobjetos de flujo en hielo. Mientras separa el tubo de los depósitos, use el dedo para cerrar el otro lado del depósito para evitar atrapar las burbujas de aire en el canal. Manteniendo el deslizamiento de flujo sobre hielo, aspire el medio cuidadosamente desde los reservorios, pero no desde el canal donde residen las células.Lave las muestras con 90 microlitros de PBS estéril en frío agregando PBS a un reservorio y aspire cuidadosamente desde el otro reservorio, luego repita para todos los canales. Fije las células agregando 90 microlitros de solución tamponada de 4% de PFA al mismo reservorio donde se agregó el PBS y aspire el líquido del otro reservorio como se demostró. Después de fijar las células en los seis canales, transfiera las muestras del hielo a temperatura ambiente e incube durante 20 minutos.Lave las células tres veces con PBS agregando PBS a un reservorio y arrancándolo cuidadosamente desde el otro reservorio en todos los canales, teniendo cuidado de no secar los canales. Apague el PFA de acceso agregando 90 microlitros de cloruro de amonio ambiental de 15 milimolares preparado en PBS a uno de los reservorios. Aspirar desde el otro reservorio e incubar las células durante 10 minutos.Permeabilizar las células añadiendo 90 microlitros de 0,3%Tritón X 100 preparados en PBS en el depósito vacío. Aspire desde el otro reservorio para cada canal e incube durante 10 minutos, luego lave tres veces con PBS como se demostró anteriormente. A 90 microlitros de solución estéril de bloqueo de PLA a un reservorio.Aspirar desde el otro lado para cada canal e incubar durante una hora a 37 grados centígrados en una cámara humidificada. Agregue anticuerpos primarios en el diluyente de anticuerpos PLA y el vórtice. Aspire cuidadosamente la solución de bloqueo de los reservorios y canales.Agregue 30 microlitros de la solución de anticuerpos primarios inmediatamente en el canal vacío inclinando la diapositiva mientras agrega la solución. Repita para todos los canales e incube a cuatro grados centígrados en la cámara humidificada durante la noche o a 37 grados centígrados durante una hora. Diluya menos conejo y más ratón las sondas PLA de uno a cinco en el diluyente de anticuerpos PLA.Lave todos los canales dos veces agregando 90 microlitros de tampón de lavado A y aspirando como se ha demostrado. Después de aspirar el tampón de lavado, agregue 30 microlitros de solución de sonda de PLA e incube en la cámara humidificada. Diluir el tampón de ligadura de uno a cinco en agua ionizada D y diluir la enzima lygus de uno a 40 en el tampón de ligadura diluido.Después de lavar y aspirar completamente el tampón de lavado A, agregue 30 microlitros de solución de ligadura a los canales vacíos mientras inclina el portaobjetos, e incube en la cámara humidificada. Diluya el tampón de amplificación de uno a cinco en agua desionizada, luego diluya la enzima polimerasa de uno a 80 en el tampón de amplificación diluido en hielo. Después de lavar y aspirar completamente el tampón de lavado A, agregue 30 microlitros de solución de amplificación a los canales vacíos mientras inclina el portaobjetos, e incube en la cámara humidificada.Diluya el DAPI de uno a 500 en el tampón de lavado B y lave todos los canales una vez agregando 90 microlitros de DAPI que contengan el tampón de lavado B, y aspirando como se ha demostrado para vaporizar los núcleos. A continuación, lave todos los canales una vez con el búfer de lavado B sin DAPI. Diluya el tampón de lavado B de uno a 10 en agua desionizada y lave todos los canales una vez con 90 microlitros de tampón de lavado diluido B.Después de aspirar el tampón de lavado B, agregue inmediatamente de dos a tres gotas del medio de montaje líquido a un depósito e incline la corredera para distribuir el medio de montaje en todos los canales.Guarde las muestras a cuatro grados centígrados en un ambiente humidificado hasta la toma de imágenes. Los huvecs estaban expuestos a un estrés alto y bajo. El bajo estrés cortante aumentó las interacciones de la proteína SMAD en el citosol y los núcleos.Los controles de anticuerpos individuales mostraron no a muy pocas señales, lo que demuestra el éxito del experimento. El aumento de la concentración de anticuerpos resultó en un mayor número de eventos de PLA por célula, pero la diferencia en las señales de PLA entre las células expuestas al estrés alto y bajo se redujo. Los tampones de fabricación propia para el bloqueo y la dilución de anticuerpos se pueden utilizar como una alternativa para los tampones comerciales.La cuantificación de los eventos de PLA para soluciones comerciales y de fabricación propia de diluyentes y bloqueantes mostró el mismo patrón de señales de PLA en las áreas citosólica y nuclear. Sin embargo, el número total de eventos de PLA por célula fue mayor con las soluciones comerciales. Se utilizó una combinación de anticuerpos SMAD Dos/Tres, SMAD Cuatro donde el anticuerpo SMAD Cuatro no era adecuado para experimentos de inmunofluorescencia.No hubo diferencias en los eventos de PLA en la condición experimental versus de control, lo que indica la importancia de seleccionar la combinación correcta de anticuerpos para detectar los eventos de PLA. El protocolo descrito se puede adaptar para detectar las interacciones de los complejos de factores de transcripción diferentes de los SMAD y, por lo tanto, ayudar a comprender la regulación génica en condiciones de protección del atero y el atero.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

La cuantificación de la histidina quinasa bacteriana autofosforilación mediante un ensayo de nitrocelulosa Encuadernación

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Investigación

Bioquímica

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y<em&gt; In Situ</em&gt; Ligadura ensayo de proximidad

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hidrólisis de un Ni-Schiff-base compleja usando condiciones adecuadas para la retención de los grupos protectores lábiles en medio ácido

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detección de Heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in Situ proximidad

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

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Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Cuantificación de hipopigmentación de la actividad In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Cuantificación de la dinámica de la red de interacción de proteínas mediante coinmunoprecipitación multiplexada

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Preparación media para el cultivo de microorganismos bajo condiciones estrictamente anaeróbicas/anóxicos

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Cuantificación de la coenzima A en células y tejidos

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...