Name: visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

Vi tackar Dr. Maria Reichenbach och Dr. Christian Hiepen för deras stöd för flödessystemet och Eleanor Fox och Yunyun Xiao för att de kritiskt läste manuskriptet. P-L.M. finansierades av den internationella Max Planck Research School IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK fick finansiering av DFG-SFB1444. Figur 1 skapades med BioRender.

1. Cellkultur och vätskeskjuvning stress exponering
OBS: Human umbilical ven ECs (HUVECs) användes som ett exempel för att studera SS inducerad interaktion av SMADs. Protokollet som beskrivs nedan kan tillämpas på alla SS-responsiva celltyper.
<ol><li>Täck 6-kanalsrutschbanan med 0,1% svinhudgelatin i PBS i 30 min vid 37 °C.</li>
	<li>Frö HUVECs i förbelagda 6-kanalsbilder med en densitet av 2,5 x 106 celler per ml i 30 μL M199 fullt medium. OBS: Mer information om hu...

<ol>
	<li>Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+BMP+receptors:+Specificity,+activation+and+inhibition.">Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).</li><li>Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling.">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li><li>Hiepen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPR2+acts+as+a+gatekeeper+to+protect+endothelial+cells+from+increased+TGF&#946;+responses+and+altered+cell+mechanics.">BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGF&#946; responses and altered cell mechanics.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).</li><li>Hildebrandt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ActivinA+induced+SMAD1/5+Signaling+in+an+iPSC+derived+EC+model+of+Fibrodysplasia+Ossificans+Progressiva+(FOP)+can+be+rescued+by+the+drug+candidate+saracatinib.">ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+activation+state+of+the+endothelium+via+two+distinct+TGF-beta+type+I+receptors.">Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+receptor-like+kinase+(ALK)1+is+an+antagonistic+mediator+of+lateral+TGFbeta/ALK5+signaling.">Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling.</a> Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).</li><li>Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta-induced+Smad1/5+phosphorylation+in+epithelial+cells+is+mediated+by+novel+receptor+complexes+and+is+essential+for+anchorage-independent+growth.">Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).</li><li>Ramachandran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+uses+a+novel+mode+of+receptor+activation+to+phosphorylate+SMAD1/5+and+induce+epithelial-to-mesenchymal+transition.">TGF-&#946; uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition.</a> eLife. 7, 31756 (2018).</li><li>Flanders, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brightfield+proximity+ligation+assay+reveals+both+canonical+and+mixed+transforming+growth+factor-&#946;/bone+morphogenetic+protein+Smad+signaling+complexes+in+tissue+sections.">Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-&#946;/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).</li><li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).</li><li>Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+in+vascular+homeostasis+and+disease.">Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).</li><li>Cai, J., Pardali, E., S&#225;nchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+vascular+diseases.">BMP signaling in vascular diseases.</a> FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).</li><li>Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulated+TGF-&#946;/BMP+signaling+in+vascular+malformations.">Deregulated TGF-&#946;/BMP signaling in vascular malformations.</a> Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).</li><li>MacCarrick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loeys-Dietz+syndrome:+a+primer+for+diagnosis+and+management.">Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management.</a> Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Min, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Smad+2/3+signaling+by+low+shear+stress+mediates+artery+inward+remodeling.">Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling.</a> bioRxiv. , 691980 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+receptor-integrin+interaction+mediates+responses+of+vascular+endothelial+Smad1/5+and+proliferation+to+disturbed+flow.">BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-specific+activation+of+Smad1/5+regulates+vascular+endothelial+cell+cycle+progression+in+response+to+disturbed+flow.">Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).</li><li>van Dijk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+TGF-&#946;+and+BMP+signaling+in+human+atherosclerosis:+A+histological+evaluation+based+on+Smad+activation.">Visualizing TGF-&#946; and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation.</a> Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).</li><li>Derwall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+bone+morphogenetic+protein+signaling+reduces+vascular+calcification+and+atherosclerosis.">Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Alam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+Assay+(PLA).">Proximity Ligation Assay (PLA).</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).</li><li>Application Note 03: Growing Cells in &#181;-Channels. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf</a> (2012)</li><li>Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf</a> (2019)</li><li>ibidi. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Note+31:+Instructions+&#181;-Slide+VI+0.4.">Application Note 31: Instructions &#181;-Slide VI 0.4.</a> ibidi. , (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reichenbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+impact+of+fluid+shear+stress+and+YAP/TAZ+on+BMP/TGF-&#946;+induced+osteogenic+target+genes.">Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-&#946; induced osteogenic target genes.</a> Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).</li><li>Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+takes+two+to+tango:+Endothelial+TGF&#946;/BMP+signaling+crosstalk+with+mechanobiology.">It takes two to tango: Endothelial TGF&#946;/BMP signaling crosstalk with mechanobiology.</a> Cells. 9 (9), 1965 (2020).</li></ol>

Det PLA-baserade protokollet som beskrivs här erbjuder ett effektivt sätt att bestämma närheten till två proteiner (t.ex. deras direkta interaktion) i ECs som utsätts för skjuvstress med kvantitativ och rumslig upplösning. Genom att använda flödesbilder med flera parallella kanaler kan flera olika proteininteraktioner undersökas samtidigt i celler under identiska mekaniska förhållanden. Däremot använder specialbyggda flödeskammare ofta en enda kanal som är byggd kring ett glasöverdrag, vilket endast sku...

Proteiner i de transformerande tillväxtfaktorerna beta (TGFβ) superfamilj är pleiotropiska cytokiner med en mängd olika medlemmar, inklusive TGFβs, benmorfogenetiska proteiner (BMPs) och Activins1,2. Ligandbindning inducerar bildandet av receptoroligomerer som leder till fosforylering och därmed aktivering av cytosolisk regulatorisk SMAD (R-SMAD). Beroende på ligandernas underfamilj aktiveras olika R-SMADs1,2. Medan TGFβs och Activins huvudsakligen inducerar fosforylering av SMAD2/3, inducerar BMPs SMAD1/5/8 fosforylering. Det finns dock ackumulerande bevis för att BSP och TGFβs/Activins också aktiverar R-SMADs av respektive annan underfamilj, i en process som kallas "lateral signalering"3,4,5,6,7,8 och att det finns blandade SMAD-komplex bestående av både SMAD1/5 och SMAD2/3, medlemmar3,9 . Två aktiverade R-SMADs bildar därefter trimeric komplex med den gemensamma medlaren SMAD4. Dessa transkriptionsfaktorkomplex kan sedan flytta in i kärnan och reglera transkriptionen av målgener. SMADs kan interagera med en mängd olika transkriptionskoaktivatorer och co-repressorer, vilket leder till diversifiering av möjligheterna att reglera målgener10. Avreglering av SMAD-signalering har allvarliga konsekvenser i en mängd olika sjukdomar. I linje med detta kan obalanserad TGFβ/BMP-signalering leda till allvarliga vaskulär patologier, såsom pulmonell artärhytoni, ärftlig hemorragisk telangiectasia eller ateroskleros3,11,12,13,14.
Endotelceller (ECs) bildar det innersta lagret av blodkärl och utsätts därför för skjuvstress (SS), en friktionskraft som utövas av blodets trögflytade flöde. Intressant nog hålls ECs som bor i de delar av vaskulaturen, som utsätts för höga nivåer av enhetliga, laminära SS, i ett homeostatiskt och quiescent tillstånd. Däremot är ECs som upplever låg, icke-enhetlig SS, t.ex. vid bifurcations eller den mindre krökningen av aortabågen, proliferativa och aktiverar inflammatoriska vägar15. I sin tur är platser av dysfunktionella ECs benägna att utveckla åderförkalkning. Intressant nog visar ECs i dessa atheroprone-områden avvikande höga nivåer av aktiverade SMAD2/3 och SMAD1/516,17,18. I detta sammanhang konstaterades förbättrad TGFβ/BMP signalering vara en tidig händelse i utvecklingen av aterosklerotiska skador19 och interferens med BMP signalering konstaterades markant minska vaskulär inflammation, ateroma bildas och tillhörande förkalkning20.
Proximity Ligation Assay (PLA) är en biokemisk teknik för att studera protein-proteininteraktioner in situ21,22. Det förlitar sig på specificiteten hos antikroppar av olika arter som kan binda målproteiner av intresse, vilket möjliggör mycket specifik detektion av endogena proteininteraktioner på encellsnivå. Här måste primära antikroppar binda till sin måletop på ett avstånd av mindre än 40 nm för att möjliggöra detektion23. Därför är PLA mycket fördelaktigt jämfört med traditionella co-immunoprecipitation metoder, där flera miljoner celler behövs för att upptäcka endogena protein interaktioner. I PLA binder artspecifika sekundära antikroppar, kovalent kopplade till DNA-fragment (kallade Plus- och Minussonder), de primära antikropparna och om proteinerna av intresse samverkar kommer Plus- och Minussonderna i närheten. DNA:t blir ligerat i följande steg och förstärkningen av det cirkulära DNA:t möjliggörs. Under förstärkning binder fluorescerande märkta kompletterande oligonukleotider till det syntetiserade DNA, vilket gör att dessa proteininteraktioner kan visualiseras genom konventionell fluorescensmikroskopi.
Protokollet som beskrivs här gör det möjligt för forskare att kvantitativt jämföra antalet aktiva SMAD-transkriptionskomplex vid ateroprotektiva och atheroprone SS-villkor in vitro med HJÄLP AV PLA. SS genereras via ett programmerbart pneumatiskt pumpsystem som kan generera laminärt enkelriktat flöde av definierade nivåer och möjliggör stegvisa ökningar av flödeshastigheter. Denna metod gör det möjligt att upptäcka interaktioner mellan SMAD1/5 eller SMAD2/3 med SMAD4, liksom blandade R-SMAD-komplex. Det kan enkelt utökas för att analysera interaktioner mellan SMADs med transkriptionella medregulatorer eller till andra transkriptionsfaktorkomplex än SMADs. Figur 1 visar de viktigaste stegen i protokollet som presenteras nedan.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> Bild 1: Schematisk representation av det beskrivna protokollet. (A) Celler som sås i 6-kanalsrutschbanor utsätts för skjuvspänning med ett pneumatiskt pumpsystem. B) Fasta celler används för PLA-experiment eller för kontrollförhållanden. (C) Bilder av PLA-experiment förvärvas med ett fluorescensmikroskop och analyseras med hjälp av ImageJ-analysprogramvara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80606</td>
			<td>6-channel slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K298.1</td>
			<td>Quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.4</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stain DNA/Nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td>PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>MINUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>PLUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>PLA wash buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium (ECGS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf Serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4% buffered</td>
			<td>KLINIPATH/VWR</td>
			<td>VWRK4186.BO1</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&#160; 25 &#181;g/mL Hep +&#160;&#160; 50 &#181;g/mL ECGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, Type A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td>Use 0.1% in PBS for coating of flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v.7</td>
			<td>GarphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Program used for the Plots and statistical calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>supplement for medium (Hep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVECs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Mounting Medium</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Liquid mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Pump System</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>pneumatic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-80100</td>
			<td>supplement for medium (L-Glu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2154</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53745</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD2/3 Antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610843</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with CST 9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mousee anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Sanata Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7966</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>supplement for medium (P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set WHITE</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10963</td>
			<td>Tubings used for 1 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set YELLOW and GREEN</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Tubings used for 30 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9516</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>8685</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9515</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with BD 610843</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial Connector for &#181;-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10830</td>
			<td>serial connection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6683.1</td>
			<td>Permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay

Transformering tillväxtfaktor β (TGFβ)/Benmorfogenetiskt protein (BMP) signalering är tätt reglerad och balanserad under utvecklingen och homeostas av vaskulatursystemet Därför resulterar avreglering i denna signalväg i allvarliga vaskulär patologier, såsom pulmonell arteriell hypertoni, ärftlig hemorragisk telangiectasia och ateroskleros. Endotelceller (ECs), som det innersta lagret av blodkärl, utsätts ständigt för vätskeskjuvning stress (SS). Onormala mönster av vätska SS har visat sig förbättra TGFβ/BMP signalering, som, tillsammans med andra stimuli, inducerar aterogenes. I förhållande till detta konstaterades atheroprone, låg laminär SS att förbättra TGFβ/BMP signalering medan ateroprotective, hög laminar SS, minskar denna signalering. För att effektivt analysera aktiveringen av dessa vägar utformade vi ett arbetsflöde för att undersöka bildandet av transkriptionsfaktorkomplex under låga laminära SS- och höga laminära SS-förhållanden med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt pneumatiskt pumpsystem och närhetsligaturanalys (PLA).
Aktiv TGFβ/BMP-signalering kräver bildandet av trimeriska SMAD-komplex som består av två reglerande SMADs (R-SMAD). SMAD2/3 och SMAD1/5/8 för TGFβ respektive BMP-signalering) med en gemensam medlare SMAD (co-SMAD; SMAD4). Med hjälp av PLA som är inriktade på olika underenheter till det trimeriska SMAD-komplexet, dvs.
Användningen av flödesbilder med 6 små parallella kanaler, som kan anslutas i serie, möjliggör undersökning av transkriptionsfaktorkomplexbildning och införande av nödvändiga kontroller. 
Arbetsflödet som förklaras här kan enkelt anpassas för studier som riktar sig till närheten av SMADs till andra transkriptionsfaktorer eller till andra transkriptionsfaktorkomplex än SMADs, i olika flytande SS-förhållanden. Arbetsflödet som presenteras här visar ett snabbt och effektivt sätt att studera vätskan SS inducerad TGFβ/BMP signalering i ECs, både kvantitativt och rumsligt.

Vi har tidigare använt PLA för att upptäcka interaktioner av olika SMAD-proteiner3 och analyserat skjuvstress inducerade förändringar i SMAD fosforylering28.
Här kombinerades båda metoderna med protokollet som beskrivs ovan. HUVECs utsattes för skjuvning stress av 1 dyn/cm2 och 30 dyn/cm2 och analyseras för interaktioner av SMAD transkription faktorer. Vi visar att jämfört med den höga skjuvningsstressen (30 dyn/...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

Visualization and Quantification of TGFÃƒÅ½Ã‚Â²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Här upprättar vi ett protokoll för att samtidigt visualisera och analysera flera SMAD-komplex med hjälp av närhet ligatur analys (PLA) i endotel celler utsätts för patologiska och fysiologiska vätska skjuvning stress villkor.

Visualisering och kvantifiering av TGFβ/BMP/SMAD-signalering under olika vätskeskjuvningsstressförhållanden med hjälp av Proximity-Ligation-Assay

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Detta protokoll gör det möjligt för forskare att kvantitativt jämföra antalet transkriptionsfaktorkomplex under olika skjuvstressförhållanden, och kommer att vara fördelaktigt för forskning inom kärlbiologi. Den största fördelen med detta protokoll är användningen av mikrofluidiska flödeskanaler som möjliggör undersökningar av flera antikroppspar, inklusive respektive kontroller samtidigt. Till att börja med, belägga sexkanalsrutschbanan genom att tillsätta 0,1% svinhudgelatin som bereds i PBS i kanalerna i 30 minuter vid 37 grader Celsius.Töm kanalerna från gelatinlösningen och frö Huvecs i de förkodade sexkanalsbilderna med en densitet av 2,5 gånger 10 till de sjätte cellerna per milliliter i 30 mikroliter M199 komplett medium. Låt cellerna klibba i en timme vid 37 grader Celsius i den fuktade inkubatorn. Tillsätt 60 mikroliter förvarna M199 komplett medium till var och en av reservoarerna.Odla cellerna vid 37 grader Celsius i två dagar i en fuktad inkubator med medelbyte efter 24 timmar. Montera silikonslangarna på de fluida enheterna, fyll reservoarerna med minst 10 milliliter förvarnat M199 komplett medium. Anslut de flytande enheterna med slangar till pumpsystemet och utför förkörningen utan celler för att balansera mediet och avlägsna eventuell återstående luft.Anslut de enskilda kanalerna på den sex kanaler glider med hjälp av den seriella anslutningsslangen. Anslut den första och sista kanalen på bilden till rören monterade på fluidikenheten. För exponering av cellerna för höga nivåer av ren stress, öka den rena stresssteget klokt med anpassningsfaser och ställ in stegen i steg om fem dynes per kvadratcentimeter per 30 minuter.Använd klumparna på slangen för att lossa bilderna från pumpar efter exponering för vätskeskjuvning, undvika medelstort spill i inkubatorn och överföra flödesrutschbanor på is. När du lossar slangen från reservoarerna, använd fingret för att stänga den andra sidan av behållaren för att undvika att fånga luftbubblorna i kanalen. Håll flödet glida på is, aspirera mediet försiktigt från reservoarerna men inte från kanalen där cellerna bor.Tvätta proverna med 90 mikroliter kall steril PBS genom att tillsätta PBS i en reservoar och aspirera försiktigt från den andra behållaren och upprepa sedan för alla kanaler. Fixera cellerna genom att tillsätta 90 mikroliter buffrad 4%PFA-lösning till samma reservoar där PBS tillsattes och aspirera vätskan från den andra behållaren enligt vad som visats. Efter fixering av cellerna i alla sex kanalerna överför du proverna från is till rumstemperatur och inkuberar i 20 minuter.Tvätta cellerna tre gånger med PBS genom att tillsätta PBS till en reservoar och aspirera den försiktigt från den andra behållaren i alla kanaler, var noga med att inte torka ut kanalerna. Släck åtkomst PFA genom att tillsätta 90 mikroliter omgivande 15 millimolar ammoniumklorid som bereds i PBS till en av reservoarerna. Aspirera från den andra behållaren och inkubera cellerna i 10 minuter.Permeabilisera cellerna genom att tillsätta 90 mikroliter på 0,3%Triton X 100 beredda i PBS i den tomma behållaren. Aspirera från den andra behållaren för varje kanal och inkubera i 10 minuter och tvättas sedan tre gånger med PBS som visats tidigare. Vid 90 mikroliter steril PLA-blockeringslösning till en reservoar.Aspirera från andra sidan för varje kanal och inkubera i en timme vid 37 grader Celsius i en fuktad kammare. Tillsätt primära antikroppar i PLA-antikroppsdluent och virvel. Aspirera försiktigt blockeringslösningen från reservoarerna och kanalerna.Tillsätt 30 mikroliter av den primära antikroppslösningen omedelbart i den tomma kanalen genom att luta bilden samtidigt som lösningen tillsätts. Upprepa för alla kanaler och inkubera vid fyra grader Celsius i den fuktade kammaren över natten eller vid 37 grader Celsius i en timme. Späd minus kanin och plus mus PLA sonder ett till fem i PLA-antikroppen diluent.Tvätta alla kanaler två gånger genom att tillsätta 90 mikroliter tvättbuffert A och aspirera enligt vad som visas. Efter inandning av tvättbufferten tillsätt 30 mikroliter PLA-sondlösning och inkubera i den fuktade kammaren. Späd ligaturbufferten ett till fem i D joniserat vatten och späd lygusenzymet ett till 40 i den utspädda ligaturbufferten.Efter tvätt och helt inandning av tvättbufferten A, tillsätt 30 mikroliter ligaturlösning till de tomma kanalerna medan du lutar glidningen och inkubera i den fuktade kammaren. Späd förstärkningsbufferten ett till fem i avjoniserat vatten och späd sedan polymerasenzymet ett till 80 i den utspädda förstärkningsbufferten på is. Efter tvätt och helt inandning av tvättbufferten A, tillsätt 30 mikroliter förstärkningslösning till de tomma kanalerna medan du lutar glidningen och inkuberar den i den fuktade kammaren.Späd DAPI en till 500 i tvättbuffert B och tvätta alla kanaler en gång genom att tillsätta 90 mikroliter DAPI som innehåller tvättbuffert B och aspirera som visat sig ånga kärnorna. Tvätta sedan alla kanaler en gång med tvättbuffert B utan DAPI. Späd tvättbuffert B en till 10 i avjoniserat vatten och tvätta alla kanaler en gång med 90 mikroliter utspädd tvättbuffert B.Efter inandning av tvättbuffert B tillsätt omedelbart två till tre droppar av vätskemonteringsmediet till en reservoar och luta glidbilden för att fördela monteringsmediet i alla kanaler.Förvara proverna vid fyra grader Celsius i en fuktad miljö tills de avbildas. Huvecs utsattes för hög och låg stress. Den låga skjuvningsstressen ökade SMAD-proteininteraktionerna i cytosolen och atomkärnorna.Enstaka antikroppskontroller visade nej till mycket få signaler, vilket bevisar experimentets framgång. Ökad antikroppskoncentration resulterade i ett högre antal PLA-händelser per cell, men skillnaden i PLA-signaler mellan höga och låga stressexponerade celler minskade. Egentillverkade buffertar för blockering och antikroppsutspädning kan användas som ett alternativ för kommersiella buffertar.Kvantifieringen av PLA-händelser för kommersiella och självtillverkade spädnings- och blockeringslösningar visade samma mönster av PLA-signaler i cytosoliska och nukleära områden. Det totala antalet PLA-händelser per cell var dock högre med kommersiella lösningar. En kombination av SMAD Two/Three, SMAD Four antikroppar användes där SMAD Four antikroppen inte var lämplig för immunofluorescens experiment.Det fanns ingen skillnad i PLA-händelser i det experimentella kontra kontrolltillståndet, vilket indikerar vikten av att välja rätt antikroppskombination för att upptäcka PLA-händelserna. Det beskrivna protokollet kan anpassas för att upptäcka interaktioner av transkriptionsfaktorkomplex som skiljer sig från SMADs och därför hjälpa till att förstå genreglering i atero benägna och ateriska skyddande villkor.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifiering av Bacterial Histidin Kinase-autofosforylering med hjälp av en Nitrocellulosabindningsanalys

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisering av protein-proteininteraktion i nukleära och cytoplasmiska fraktioner av Co-immunoprecipitation och<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligation Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolys av en Ni-Schiff-Base Complex Använda betingelser som är lämpliga för Bibehållande av syralabil skydds Grupper

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detektion och visualisering av DNA-skada-inducerad proteinkomplex i suspensionscellkulturer med användning av Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Påvisande av Heterodimerization av Protein isoformer använder en in Situ närhet Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-gratis In Vitro kvantifiering av Protein Homo-oligomerisering använder kommersiella instrumentering och fri, öppen källkod ljusstyrka analys programvara

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifiering av hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifiering av proteininteraktion Nätverksdynamik med hjälp av multiplexerade Co-immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions

Medellång förberedelse för odling av mikroorganismer under strängt anaeroba/syrefria förhållanden

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantifiering av coenzym A i celler och vävnader

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...