Name: visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

Dr. Maria Reichenbach ve Dr. Christian Hiepen'e akış sistemine verdikleri destek için, Eleanor Fox ve Yunyun Xiao'ya ise makaleyi eleştirel bir şekilde okudukları için teşekkür ederiz. P-L.M. uluslararası Max Planck Araştırma Okulu IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC) tarafından finanse edildi. PK, DFG-SFB1444 tarafından fon aldı. Şekil 1 BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

1. Hücre kültürü ve sıvı kesme stresine maruz kalma
NOT: SMAD'lerin SS kaynaklı etkileşimini incelemek için örnek olarak insan göbek damarı EBC'leri (HUVEC) kullanılmıştır. Aşağıda açıklanan iletişim kuralı her SS duyarlı hücre türüne uygulanabilir.
<ol><li>37 °C'de 30 dakika boyunca PBS'de % 0,1 porcine cilt jelatin ile 6 kanallı kaydırağı kapleyin.</li>
	<li>30 μL M199 tam ortamda mL başına 2,5 x 106 hücre yoğunluğunda önceden kaplanmış 6...

<ol>
	<li>Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+BMP+receptors:+Specificity,+activation+and+inhibition.">Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).</li><li>Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling.">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li><li>Hiepen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPR2+acts+as+a+gatekeeper+to+protect+endothelial+cells+from+increased+TGF&#946;+responses+and+altered+cell+mechanics.">BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGF&#946; responses and altered cell mechanics.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).</li><li>Hildebrandt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ActivinA+induced+SMAD1/5+Signaling+in+an+iPSC+derived+EC+model+of+Fibrodysplasia+Ossificans+Progressiva+(FOP)+can+be+rescued+by+the+drug+candidate+saracatinib.">ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+activation+state+of+the+endothelium+via+two+distinct+TGF-beta+type+I+receptors.">Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).</li><li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+receptor-like+kinase+(ALK)1+is+an+antagonistic+mediator+of+lateral+TGFbeta/ALK5+signaling.">Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling.</a> Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).</li><li>Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta-induced+Smad1/5+phosphorylation+in+epithelial+cells+is+mediated+by+novel+receptor+complexes+and+is+essential+for+anchorage-independent+growth.">Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).</li><li>Ramachandran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+uses+a+novel+mode+of+receptor+activation+to+phosphorylate+SMAD1/5+and+induce+epithelial-to-mesenchymal+transition.">TGF-&#946; uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition.</a> eLife. 7, 31756 (2018).</li><li>Flanders, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brightfield+proximity+ligation+assay+reveals+both+canonical+and+mixed+transforming+growth+factor-&#946;/bone+morphogenetic+protein+Smad+signaling+complexes+in+tissue+sections.">Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-&#946;/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).</li><li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).</li><li>Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins+in+vascular+homeostasis+and+disease.">Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).</li><li>Cai, J., Pardali, E., S&#225;nchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+vascular+diseases.">BMP signaling in vascular diseases.</a> FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).</li><li>Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulated+TGF-&#946;/BMP+signaling+in+vascular+malformations.">Deregulated TGF-&#946;/BMP signaling in vascular malformations.</a> Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).</li><li>MacCarrick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loeys-Dietz+syndrome:+a+primer+for+diagnosis+and+management.">Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management.</a> Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Min, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Smad+2/3+signaling+by+low+shear+stress+mediates+artery+inward+remodeling.">Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling.</a> bioRxiv. , 691980 (2019).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+receptor-integrin+interaction+mediates+responses+of+vascular+endothelial+Smad1/5+and+proliferation+to+disturbed+flow.">BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-specific+activation+of+Smad1/5+regulates+vascular+endothelial+cell+cycle+progression+in+response+to+disturbed+flow.">Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).</li><li>van Dijk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+TGF-&#946;+and+BMP+signaling+in+human+atherosclerosis:+A+histological+evaluation+based+on+Smad+activation.">Visualizing TGF-&#946; and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation.</a> Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).</li><li>Derwall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+bone+morphogenetic+protein+signaling+reduces+vascular+calcification+and+atherosclerosis.">Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).</li><li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays.">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Alam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Ligation+Assay+(PLA).">Proximity Ligation Assay (PLA).</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).</li><li>Application Note 03: Growing Cells in &#181;-Channels. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf</a> (2012)</li><li>Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf</a> (2019)</li><li>ibidi. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Note+31:+Instructions+&#181;-Slide+VI+0.4.">Application Note 31: Instructions &#181;-Slide VI 0.4.</a> ibidi. , (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reichenbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+impact+of+fluid+shear+stress+and+YAP/TAZ+on+BMP/TGF-&#946;+induced+osteogenic+target+genes.">Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-&#946; induced osteogenic target genes.</a> Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).</li><li>Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+takes+two+to+tango:+Endothelial+TGF&#946;/BMP+signaling+crosstalk+with+mechanobiology.">It takes two to tango: Endothelial TGF&#946;/BMP signaling crosstalk with mechanobiology.</a> Cells. 9 (9), 1965 (2020).</li></ol>

Burada açıklanan PLA tabanlı protokol, nicel ve mekansal çözünürlükle kesme stresine maruz kalan VC'lerde iki proteinin (örneğin doğrudan etkileşimlerinin) yakınlığını belirlemenin etkili bir yolunu sunar. Birden fazla paralel kanallı akış slaytları kullanılarak, aynı mekanik koşullar altında hücrelerde aynı anda birkaç farklı protein etkileşimi incelenebilir. Buna karşılık, özel yapım akış odası sistemleri genellikle bir cam kapak parçası etrafında inşa edilen tek bir kanaldan y...

Dönüşen büyüme faktörleri beta (TGFβ) süper ailenin proteinleri, TGFβs, kemik morfogenetik proteinleri (BMP'ler) ve Activins1,2 dahil olmak üzere çeşitli üyelere sahip pleiotropik sitokinlerdir. Ligand bağlama, fosforilasyona ve böylece sitosolik düzenleyici SMAD'nin (R-SMAD) aktivasyonuna yol açan reseptör oligomerlerinin oluşumuna neden olandır. Ligandların alt ailesine bağlı olarak, farklı R-SMAD'ler etkinleştirilir1,2. TGFβs ve Activins esas olarak SMAD2/3 fosforilasyonuna neden olurken, BMP'ler SMAD1/5/8 fosforilasyona neden olur. Bununla birlikte, BMP'lerin ve TGFβs/Activins'in de ilgili diğer alt ailenin R-SMAD'lerini etkinleştirdiğine dair kanıtlar vardır, 'yanal sinyal'3,4,5,6,7,8 olarak adlandırılan bir süreçte ve her iki SMAD1/5 ve SMAD2/3, üyeden oluşan karışık SMAD kompleksleri vardır. . İki aktif R-SMAD daha sonra ortak mediatör SMAD4 ile trimerik kompleksler oluşturur. Bu transkripsiyon faktörü kompleksleri daha sonra çekirdeğe yerle bir olabilir ve hedef genlerin transkripsiyonunu düzenleyebilir. SMAD'ler çeşitli transkripsiyonal ko-aktivatörler ve yardımcı baskılayıcılarla etkileşime girebilir ve bu da hedef genleri düzenleme olanaklarının çeşitlendirilmesine yol açabilir10. SMAD sinyalinin deregülasyonunun çeşitli hastalıklarda ciddi etkileri vardır. Buna paralel olarak dengesiz TGFβ/BMP sinyali pulmoner arter hipertansiyonu, kalıtsal hemorajik telanjiektazi veya ateroskleroz3,11,12,13,14 gibi ciddi damar patolojilerine yol açabilir.
Endotel hücreleri (VC' ler) kan damarlarının en iç tabakasını oluşturur ve bu nedenle kanın viskoz akışı tarafından uygulanan sürtünme kuvveti olan kesme stresine (SS) maruz kalır. İlginçtir ki, vaskülatın yüksek düzeyde üniforma, laminar SS'ye maruz kalan kısımlarında bulunan VC'ler homeostatik ve sessiz bir durumda tutulur. Buna karşılık, düşük, homojen olmayan SS deneyimine sahip VC'ler, örneğin bifurkasyonlarda veya aort kemerinin daha az eğriliğinde, proliferatiftir ve enflamatuar yolları aktive eder15. Buna karşılık, işlevsiz EC siteleri ateroskleroz geliştirmeye eğilimlidir. İlginçtir ki, bu ateropron alanlarındaki VC'ler anormal derecede yüksek aktif SMAD2/3 ve SMAD1/516,17,18 seviyeleri gösterir. Bu bağlamda, gelişmiş TGFβ/BMP sinyalinin aterosklerotik lezyonların gelişiminde erken bir olay olduğu saptanmıştır19 ve BMP sinyaline müdahalenin damar iltihabını, aterom oluşumunu ve ilişkili kireçlenmeyi belirgin şekilde azalttığı bulunmuştur20.
Yakınlık Ligasyon Tahlil (PLA), protein-protein etkileşimlerini yerinde incelemek için kullanılan biyokimyasal bir tekniktir21,22. Hedef proteinleri birbirine bağlayabilen farklı türlerdeki antikorların özgüllüğüne dayanır ve endojen protein etkileşimlerinin tek hücre düzeyinde son derece spesifik olarak tespit edilmesine izin verir. Burada, primer antikorların tespite izin vermek için 40 nm'den daha az bir mesafede hedef epitoplarına bağlanmaları gerekir23. Bu nedenle PLA, endojen protein etkileşimlerini tespit etmek için birkaç milyon hücreye ihtiyaç duyulan geleneksel eş-immüno-immün premünipitasyon yaklaşımları üzerinde büyük ölçüde faydalıdır. PLA'da, DNA parçalarına (Artı ve Eksi problar olarak added) yaygın olarak bağlanan türe özgü ikincil antikorlar, birincil antikorları bağlar ve ilgi proteinleri etkileşime girerse, Artı ve Eksi probları yakın mesafededir. DNA aşağıdaki adımda liglenir ve dairesel DNA'nın yuvarlanan daire amplifikasyonu mümkün olur. Amplifikasyon sırasında, floresan olarak etiketlenmiş tamamlayıcı oligonükleotidler sentezlenmiş DNA'ya bağlanır ve bu protein etkileşimlerinin geleneksel floresan mikroskopi ile görselleştirilmesini sağlar.
Burada açıklanan protokol, bilim adamlarının PLA kullanarak ateroprotektif ve ateropron SS koşullarındaki aktif SMAD transkripsiyon komplekslerinin sayısını nicel olarak karşılaştırmalarını sağlar. SS, tanımlanmış seviyelerde laminar tek yönlü akış üretebilen ve akış hızlarının adım adım artmasına izin veren programlanabilir bir pnömatik pompa sistemi ile üretilir. Bu yöntem, SMAD4 ile SMAD1/5 veya SMAD2/3 arasındaki etkileşimlerin yanı sıra karışık R-SMAD komplekslerinin algılanmasını sağlar. SMAD'lerin transkripsiyonal yardımcı düzenleyicilerle etkileşimlerini analiz etmek veya SMAD'ler dışındaki transkripsiyon faktörü komplekslerine kolayca genişletilebilir. Şekil 1 aşağıda sunulan protokolün ana adımlarını göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> Şekil 1: Açıklanan protokolün şematik gösterimi. (A) 6 kanallı kaydıraklarda tohumlanan hücreler pnömatik pompa sistemi ile kesme stresine maruz kalır. (B) Sabit hücreler PLA deneyi veya kontrol koşulları için kullanılır. (C) PLA deneylerinin görüntüleri floresan mikroskop ile elde edilir ve ImageJ analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80606</td>
			<td>6-channel slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K298.1</td>
			<td>Quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076.4</td>
			<td>Blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stain DNA/Nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td>PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>MINUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>PLUS probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma Aldrich/ Merck</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>PLA wash buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium (ECGS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf Serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4% buffered</td>
			<td>KLINIPATH/VWR</td>
			<td>VWRK4186.BO1</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&#160; 25 &#181;g/mL Hep +&#160;&#160; 50 &#181;g/mL ECGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, Type A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td>Use 0.1% in PBS for coating of flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism v.7</td>
			<td>GarphPad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Program used for the Plots and statistical calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>supplement for medium (Hep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVECs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Mounting Medium</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Liquid mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Pump System</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>pneumatic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin 200mM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-80100</td>
			<td>supplement for medium (L-Glu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2154</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53745</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti- SMAD2/3 Antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610843</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with CST 9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mousee anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Sanata Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7966</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>supplement for medium (P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set WHITE</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10963</td>
			<td>Tubings used for 1 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set YELLOW and GREEN</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Tubings used for 30 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9516</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>8685</td>
			<td>Suited for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti- SMAD4 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9515</td>
			<td>Not suited for PLA in combination with BD 610843</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial Connector for &#181;-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10830</td>
			<td>serial connection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6683.1</td>
			<td>Permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of tgf&#946;/bmp/smad signaling under different fluid shear stress conditions using proximity-ligation-assay

Büyüme Faktörü β (TGFβ)/Kemik Morfogenetik Protein (BMP) sinyalinin dönüştürülmesi, vaskülür sisteminin gelişimi ve homeostazı sırasında sıkı bir şekilde düzenlenir ve dengelenir Bu nedenle, bu sinyal yolundaki deregülasyon pulmoner arter hipertansiyonu, kalıtsal hemorajik telanjiektazi ve ateroskleroz gibi ciddi vasküler patolojilerle sonuçlanır. Kan damarlarının en iç tabakası olarak endotel hücreleri (VC' ler) sürekli olarak sıvı kesme stresine (SS) maruz kalır. Anormal sıvı SS paternlerinin, diğer uyaranlarla birlikte aterogenez indükleyen TGFβ/BMP sinyalini arttırdığı gösterilmiştir. Bununla ilgili olarak, ateroprotektif, yüksek laminar SS bu sinyali azaltırken, ateroprotektif, düşük laminar SS'nin TGFβ/ BMP sinyalini artırdığı bulunmuştur. Bu yolların aktivasyonunu verimli bir şekilde analiz etmek için, piyasada bulunan bir pnömatik pompa sistemi ve yakınlık ligasyon tahlilini (PLA) kullanarak düşük laminar SS ve yüksek laminar SS koşulları altında transkripsiyon faktörü komplekslerinin oluşumunu araştırmak için bir iş akışı tasarladık.
Aktif TGFβ/BMP-sinyalizasyon, iki düzenleyici SMAD'den (R-SMAD) oluşan trimerik SMAD komplekslerinin oluşumunu gerektirir; SMAD2/3 ve SMAD1/5/8 sırasıyla TGFβ ve BMP sinyalizasyon için) ortak bir arabulucu SMAD (ortak SMAD; SMAD4). Trimerik SMAD kompleksinin farklı alt birimlerini, yani R-SMAD/co-SMAD veya R-SMAD/R-SMAD'ı hedefleyen PLA kullanılarak, aktif SMAD transkripsiyon faktörü komplekslerinin oluşumu floresan mikroskopisi kullanılarak nicel ve mekansal olarak ölçülebilir.
Seri olarak bağlanabilen 6 küçük paralel kanallı akış slaytlarının kullanımı, transkripsiyon faktörü karmaşık oluşumunun araştırılmasına ve gerekli kontrollerin dahil edilmesine olanak tanır. 
Burada açıklanan iş akışı, farklı sıvı SS koşullarında SMAD'lerin diğer transkripsiyon faktörlerine veya SMAD'ler dışındaki transkripsiyon faktörü komplekslerine yakınlığını hedefleyen çalışmalar için kolayca uyarlanabilir. Burada sunulan iş akışı, VC'lerde sıvı SS kaynaklı TGFβ/BMP sinyalini hem nicel hem de mekansal olarak incelemenin hızlı ve etkili bir yolunu göstermektedir.

Daha önce farklı SMAD proteinlerinin etkileşimlerini tespit etmek için PLA kullandık3 ve SMAD fosforilasyonundaki kesme stresi kaynaklı değişiklikleri analiz ettik28.
Burada her iki yöntem de yukarıda açıklanan protokol ile birleştirildi. HUVEC'ler 1 dyn/cm2 ve 30 dyn/cm2 kesme stresine maruz kaldı ve SMAD transkripsiyon faktörlerinin etkileşimleri için analiz edildi. Yüksek kesme stresi (30 dyn/cm2</s...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of TGFÃŽÂ²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay at JoVE.com

Visualization and Quantification of TGFÃƒÅ½Ã‚Â²/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Burada, patolojik ve fizyolojik sıvı kesme stres koşullarına maruz kalan endotel hücrelerinde yakınlık ligasyon testini (PLA) kullanarak birden fazla SMAD kompleksini aynı anda görselleştirmek ve analiz etmek için bir protokol oluşturuyoruz.

Yakınlık-Ligasyon-Tahlil Kullanarak Farklı Sıvı Kesme Stres Koşulları Altında TGFβ/BMP/SMAD Sinyalinin Görselleştirilmesi ve Nicelleştirilmesi

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Bu protokol, bilim adamlarının transkripsiyon faktörü komplekslerinin sayısını farklı kesme stres koşulları altında nicel olarak karşılaştırmalarını sağlar ve vasküler biyolojideki araştırmalar için faydalı olacaktır. Bu protokolün ana avantajı, ilgili kontroller de dahil olmak üzere çeşitli antikor çiftlerinin aynı anda araştırılmasına izin veren mikroakışkan akış kanallarının kullanımıdır. Başlamak için, PBS'de hazırlanan %0,1'lik porcine cilt jelatinini 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca kanallara ekleyerek altı kanallı slaydı kaplayın.Kanalları jelatin çözeltisinden boşaltın ve önceden kodlanmış altı kanallı slaytlardaki Huvecs tohumunu 2,5 çarpı 10 yoğunlukta M199 tam ortasının 30 mikrolitresinde mililitre başına altıncı hücrelere boşaltın. Hücrelerin nemlendirilmiş inkübatörde 37 santigrat derecede bir saat yapışmasına izin verin. Rezervuarların her birine önceden uyarılmış 60 mikrolitre M199 komple ortam ekleyin.Hücreleri 24 saat sonra orta değiştirme ile nemli bir inkübatörde iki gün boyunca 37 santigrat derecede kültürlendirin. Silikon boruyu akışkan ünitelere monte edin, rezervuarları önceden uyarılmış M199 komple ortamı ile en az 10 mililitre ile doldurun. Akışkan üniteleri boru ile pompa sistemine bağlayın ve ortamın dengesini sağlamak ve kalan havayı çıkarmak için hücreler olmadan ön çalıştırmayı gerçekleştirin.Seri bağlantı borusunu kullanarak altı kanallı slayttaki tek kanalları bağlayın. Slayttaki ilk ve son kanalı akışkanlar ünitesine monte edilen tüplere bağlayın. Hücrelerin yüksek düzeyde saf strese maruz kalması için, adaptasyon aşamaları ile akıllıca saf stres adımını artırın ve adımları 30 dakikada santimetrekare başına beş dynes artışlarla ayarlayın.Sıvı kesme stresine maruz kalmadan sonra slaytları pompalardan ayırmak, inkübatörde orta dökülmeyi önlemek ve akış slaytlarını buz üzerinde aktarmak için boru üzerindeki kümeleri kullanın. Boruyu rezervuarlardan ayırırken, hava kabarcıklarını kanala hapsetmekten kaçınmak için rezervuarın diğer tarafını kapatmak için parmağı kullanın. Akış kaydırağını buz üzerinde tutarak, ortamı rezervuarlardan dikkatlice epire edin, ancak hücrelerin bulunduğu kanaldan değil.Numuneleri bir rezervuara PBS ekleyerek 90 mikrolitre soğuk steril PBS ile yıkayın ve diğer rezervuardan dikkatlice emiş yapın, ardından tüm kanallar için tekrarlayın. PBS'nin eklendiği aynı rezervuara 90 mikrolitre tamponlanmış %4 PFA çözeltisi ekleyerek hücreleri sabitlayın ve gösterildiği gibi sıvıyı diğer rezervuardan emişlendirin. Hücreleri altı kanalda da sabitladıktan sonra, numuneleri buzdan oda sıcaklığına aktarın ve 20 dakika kuluçkaya yatırın.Bir rezervuara PBS ekleyerek ve tüm kanallarda diğer rezervuardan dikkatlice sopire ederek, kanalları kurutmamaya dikkat ederek hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. PBS'de hazırlanan 90 mikrolitre ortam 15 milimolar amonyum klorürü rezervuarlardan birine ekleyerek PFA'ya erişimi söndür. Diğer rezervuardan aspire edin ve hücreleri 10 dakika kuluçkaya bırakın.Boş rezervuarda PBS olarak hazırlanan %0,3 Triton X 100'ün 90 mikrolitresini ekleyerek hücrelerin dengesini bozun. Her kanal için diğer rezervuardan aspire edin ve 10 dakika kuluçkaya yaslayın, daha sonra daha önce gösterildiği gibi PBS ile üç kez yıkanır. Bir rezervuara 90 mikrolitre steril PLA blokaj çözeltisi.Her kanal için diğer taraftan aspire edin ve nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yaslanın. PLA antikor seyreltici ve girdap primer antikorları ekleyin. Engelleme çözeltisini rezervuarlardan ve kanallardan dikkatlice emiş edin.Çözeltiyi eklerken slaydı yatırarak birincil antikor çözeltisinin 30 mikrolitresini hemen boş kanala ekleyin. Tüm kanallar için tekrarlayın ve bir gece boyunca nemlendirilmiş odada dört santigrat derecede veya bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Pla antikor seyrelticisinde eksi tavşan ve artı fare PLA problarını bir ila beş arasında seyreltin.90 mikrolitre yıkama tamponu A ekleyerek ve gösterildiği gibi aspire ederek tüm kanalları iki kez yıkayın. Yıkama tamponunu aspire ettikten sonra, 30 mikrolitre PLA prob çözeltisi ekleyin ve nemlendirilmiş haznede kuluçkaya yatın. Ligasyon tamponunu D iyonize suda bir ila beş arasında seyreltin ve seyreltilmiş ligasyon tamponunda lygus enzimini bir ila 40 arasında seyreltin.Yıkama tamponu A'yı yıkadıktan ve tamamen aspire ettikten sonra, kaydırağı yatırırken boş kanallara 30 mikrolitre ligasyon çözeltisi ekleyin ve nemlendirilmiş odada kuluçkaya yatırın. Amplifikasyon tamponunu deiyonize suda bir ila beş seyreltin, ardından polimeraz enzimini buz üzerindeki seyreltilmiş amplifikasyon tamponunda bir ila 80 arasında seyreltin. Yıkama tamponu A'yı yıkadıktan ve tamamen aspire ettikten sonra, kaydırağı yatırırken boş kanallara 30 mikrolitre amplifikasyon çözeltisi ekleyin ve nemli bölmede kuluçkaya yatırın.Dapi'yi B yıkama tamponunda 1 ila 500 arasında seyreltin ve tüm kanalları bir kez yıkayın, B yıkama tamponu içeren 90 mikrolitre DAPI ekleyerek ve çekirdeği buharda buharlamak için gösterildiği gibi emişli. Ardından tüm kanalları DAPI olmadan B yıkama tamponu ile bir kez yıkayın. Yıkama tamponu B'yi deiyonize suda bir ila 10 arasında seyreltin ve tüm kanalları 90 mikrolitre seyreltilmiş yıkama tamponu B ile bir kez yıkayın.B yıkama tamponunu epire ettikten sonra, hemen bir rezervuara sıvı montaj ortamının iki ila üç damlasını ekleyin ve montaj ortamını tüm kanallara dağıtmak için slaydı eğin.Örnekleri görüntülemeye kadar nemli bir ortamda dört santigrat derecede saklayın. Huvecs yüksek ve düşük strese maruz kaldı. Düşük kesme stresi sitozol ve çekirdeklerde SMAD protein etkileşimlerini artırdı.Tek antikor kontrolleri çok az sinyale hayır göstererek deneyin başarısını kanıtladı. Artan antikor konsantrasyonu hücre başına daha fazla PLA olayı ile sonuçlandı, ancak yüksek ve düşük strese maruz kalan hücreler arasındaki PLA sinyallerindeki fark azaldı. Blokaj ve antikor seyreltme için kendi kendine yapılan tamponlar ticari tamponlar için alternatif olarak kullanılabilir.Pla olaylarının ticari ve kendi kendine yapılan seyreltici ve bloke edici çözümler için ölçülmesi, sitosolik ve nükleer alanlarda aynı PLA sinyallerinin desenini göstermiştir. Bununla birlikte, hücre başına toplam PLA olayı sayısı ticari çözümlerle daha yüksekti. SMAD İki/Üç, SMAD Dört antikorunun bir kombinasyonu, SMAD Four antikorunun immünofluoresans deneyleri için uygun olmadığı yerlerde kullanıldı.Deneysel ve kontrol durumunda PLA olaylarında bir fark yoktu, bu da PLA olaylarını tespit etmek için doğru antikor kombinasyonunun seçilmesinin önemini gösteriyordu. Açıklanan protokol, SMAD'lerden farklı transkripsiyon faktörü komplekslerinin etkileşimlerini tespit etmek için uyarlanabilir ve bu nedenle atero eğilimli ve atero koruyucu koşullarda gen düzenlemesini anlamaya yardımcı olur.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Koruma Grupları aside dayanıksız Saklanmasına için uygun bir Ni-Schiff-Base hidrolizi Kompleksi kullanma Koşullar

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions

Kesinlikle Anaerobik/Anoksik Koşullarda Mikroorganizmaların Yetiştirilmesi için Orta Hazırlık

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Hücre ve Dokularda Koenzim A'nın Sayısallaştırılması

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...