Name: longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging
Uploaded: 2021-06-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek - Vlaanderen (FWO Vlaanderen; G0A6113N), de Onderzoeksraad van de KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. en W.E.) en de VIB (naar T.V.). W.E. is senior klinisch onderzoeker van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek - Vlaanderen (FWO Vlaanderen). De soort UTI89-lux was een gulle gift van prof. seed's laboratorium13.

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Gemeenschapsraad en werden goedgekeurd door de Commissie Voor Dierethiek van de KU Leuven (P158/2018).
1. Kweken van bacteriën (aangepast van7,13,14)
<ol><li>Voorbereiding<ol>
<li>Kies een luminescerende UPEC-soort die het beste past bij de experimentele behoeften. OPMERKING: Hier werd het klinische cystitis...

<ol>
	<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+urinary+tract+infections:+incidence,+morbidity,+and+economic+costs.">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).</li><li>O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+vaccine+development+for+the+treatment+and+prevention+of+urinary+tract+infections.">Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections.</a> Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).</li><li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection.">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).</li><li>Carey, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+of+mice+to+model+human+disease:+Practicalities,+implications+and+limitations.">Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations.</a> Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).</li><li>Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+model+systems+for+the+study+of+urinary+tract+infections+and+related+pathologies.">Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).</li><li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+indicators+in+living+mammals.">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+monitoring+of+infectious+diseases+in+living+animals+using+bioluminescence+imaging.">In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging.</a> Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).</li><li>Balsara, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+susceptibility+to+urinary+tract+infection+in+the+spinal+cord-injured+host+with+neurogenic+bladder.">Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).</li><li>Huang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy+mediated+by+methylene+blue+and+potassium+iodide+to+treat+urinary+tract+infection+in+a+female+rat+model.">Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).</li><li>Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+persistent+Escherichia+coli+reservoir+during+the+acute+phase+of+a+bladder+infection.">Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection.</a> Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).</li><li>Hannan, T. J., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+E.+coli+urinary+tract+infection.">A murine model for E. coli urinary tract infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).</li><li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains.">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Nonsteroidal+Anti-inflammatory+Drugs+for+Treatment+of+Uncomplicated+Lower+Urinary+Tract+Infections+in+Women:+A+Meta-analysis.">Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis.</a> Infectious Microbes &amp; Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+bioluminescence+imaging+of+fungal+dissemination+to+the+brain+in+mouse+models+of+cryptococcosis.">Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).</li><li>Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+looking+beyond+the+light.">Bioluminescence imaging: looking beyond the light.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).</li><li>Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancy+between+viable+counts+and+light+output+as+viability+measurements,+following+ciprofloxacin+challenge+of+self-bioluminescent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).</li><li>Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+increases+in+vivo+screening+efficiency+for+antifungal+activity+against+device-associated+Candida+albicans+biofilms.">Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilm+development+on+medically-relevant+foreign+bodies+in+a+mouse+subcutaneous+model+followed+by+bioluminescence+imaging.">Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).</li><li>Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+non-invasive+monitoring+of+pathogen-host+interactions+during+Candida+albicans+biofilm+formation+using+in+vivo+bioluminescence.">Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence.</a> Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).</li></ol>

Voordelen van BLI ten opzichte van CFU-tellingen Longitudinale gegevens Een groot nadeel van de traditionele methode voor het tellen van KVE om microbiële belasting te kwantificeren, is de vereiste van postmortemorganogenaten, die slechts één transversaal gegevenspunt per dier opleveren. Omgekeerd maakt BLI niet-invasieve longitudinale follow-up van geïnfecteerde dieren mogelijk. De dieren kunnen 2 tot 3 keer per dag in beeld worden gebracht, waardoor gedetailleerd inzicht wordt verkre...

Urineweginfecties (UTI) behoren tot de meest voorkomende bacteriële infecties bij de mens. Bijna de helft van alle vrouwen zal tijdens hun leven een symptomatische urineweginfectie ervaren1. Infecties beperkt tot de blaas kunnen aanleiding geven tot urinewegsymptomen zoals toename van de urinefrequentie, urgentie, hematurie, incontinentie en pijn. Wanneer de infectie opstijgt naar de bovenste urinewegen, ontwikkelen patiënten pyelonefritis, met malaise, koorts, koude rillingen en rugpijn. Bovendien lijdt tot 20% van de patiënten met urineweginfecties aan terugkerende infecties, wat resulteert in een dramatische afname van de gevoeligheid voor antibiotica2,3,4. In de afgelopen jaren is er een groeiende belangstelling voor nieuwe therapieën voor de behandeling en preventie van terugkerende urineweginfecties. Ondanks een beter begrip van de aangeboren en adaptieve immuniteit van de lagere urinewegen en van de bacteriële virulentiefactoren die nodig zijn voor invasie en kolonisatie, zijn er geen radicale veranderingen in het behandelingsregime vertaald naar de dagelijkse urologische praktijk2. Om UTI pathogenese en gevoeligheid in vivo te bestuderen,is een reproduceerbare en niet-invasieve test onmisbaar.
Er zijn meerdere dierlijke UTI-modellen beschreven, variërend van nematoden tot primaten, maar het muizenmodel wordt voornamelijk gebruikt5,6. Dit model bestaat uit transurethrale katheterisatie van (vrouwelijke) muizen en daaropvolgende instillatie van een bacteriële suspensie, meestal uropathogene Escherichia coli (UPEC), rechtstreeks in het blaaslumen7. Na inenting wordt de bacteriële belasting traditioneel gekwantificeerd door kolonievormende eenheden (CFU) te bepalen. Deze techniek vereist het offeren van dieren om postmortemorgaanhomogenaten en seriële verdunningen te verkrijgen, waardoor de gegevensuitvoer en reproduceerbaarheid worden beperkt. Bovendien is longitudinale follow-up van de bacteriële belasting bij individuele dieren niet mogelijk met deze techniek.
In 1995 suggereerden Contag etal. het gebruik van bioluminescent-gelabelde pathogenen om ziekteprocessen bij levende dieren te volgen8,9. Sindsdien is bioluminescentiebeeldvorming (BLI) toegepast op tal van infectiemodellen zoals meningitis, endocarditis, osteomyelitis, huid- en wekedeleninfecties, enz.10,11,12. In het murine UTI-model kan een UPEC-stam met de complete lux operon (luxCDABE) van Photorhabdus luminescens worden gebruikt13. Een enzymatische reactie wordt gekatalyseerd door het bacteriële luciferase dat afhankelijk is van de oxidatie van langeketenaldehyden die reageren met gereduceerd flavine mononucleotide in aanwezigheid van zuurstof, wat het geoxideerde flavine, een lange-keten vetzuur en lichtoplevert 12. Het lux operon codeert voor de luciferase en andere enzymen die nodig zijn voor de synthese van de substraten. Daarom zullen alle metabolisch actieve bacteriën continu blauwgroen (490 nm) licht uitzenden zonder dat de injectie van een exogene substraat nodig is12. Fotonen die worden uitgezonden door lux-gelabeldebacteriën kunnen worden vastgelegd met behulp van zeer gevoelige, gekoelde CCD-camera's (Charge Coupled Device).
Het gebruik van bioluminescente bacteriën in een model voor UTI maakt de longitudinale, niet-invasieve kwantificering van de bacteriële belasting mogelijk, waardoor de noodzaak om dieren op vaste tijdstippen op te offeren tijdens de follow-up voor CFU-bepaling wordt weggelaten. Ondanks het brede scala aan mogelijkheden, het verzamelen van bewijs voor de robuustheid van deze BLI-techniek op andere gebieden en de voordelen ervan ten opzichte van klassieke modellen van UTI, is het niet op grote schaal geïmplementeerd in het UTI-onderzoek. Het hier gepresenteerde protocol biedt een gedetailleerde stapsgewijze handleiding en belicht de voordelen van BLI voor al het toekomstige UTI-onderzoek.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3925</td>
			<td>for in vitro imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap ISIS</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>hair trimmer, with GT608 cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer</td>
			<td>Harvard apparatus limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 100 mg/mL</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte Autoguard 24 GA</td>
			<td>BD</td>
			<td>382912</td>
			<td>Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6J mice</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropsense 16</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>Trinean</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Gibco</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>REF 14040-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% denaturated 5L</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>85825360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50ml cellstart</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 &#181;L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26203</td>
			<td>to ensure slow bacterial instillation of 50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6174.1</td>
			<td>holder: Art. No. 6189.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-Vet 1000mg/g</td>
			<td>Dechra Veterinary products</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>REF 124262</td>
			<td>imaging device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine solution 50 mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BLI acquisition software, version 4.7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L3022</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth with agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L2897</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish Sterilin 90mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>to fill with LB agar supplemented with Km</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Culture flask 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLW1141/08-20EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide 200 Trinean</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>701-2007</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTI89-lux</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generous gift from Prof. Seed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>444-1372</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging

Urineweginfecties (UTI) behoren tot de meest voorkomende bacteriële infecties bij mensen en worden routinematig behandeld met empirische antibiotica. Door toenemende microbiële resistentie is de werkzaamheid van de meest gebruikte antibiotica echter afgenomen. Om alternatieve behandelingsopties te vinden, is er een grote behoefte aan een beter begrip van de pathogenese van UTI en de mechanismen die de gevoeligheid voor UTI bepalen. Om dit in een diermodel te onderzoeken, is een reproduceerbare, niet-invasieve test om het beloop van urineweginfecties te bestuderen onmisbaar.
Jarenlang was de gouden standaard voor het opsommen van bacteriële belasting de bepaling van Colony Forming Units (CFU) voor een bepaald monstervolume. Deze techniek vereist postmortale orgaanhomogenaten en seriële verdunningen, waardoor de gegevensuitvoer en reproduceerbaarheid worden beperkt. Als alternatief wint bioluminescentiebeeldvorming (BLI) aan populariteit om de bacteriële belasting te bepalen. Het labelen van pathogenen met een lux operon maakt de gevoelige detectie en kwantificering op een niet-invasieve manier mogelijk, waardoor longitudinale follow-up mogelijk wordt. Tot nu toe blijft de adoptie van BLI in UTI-onderzoek beperkt.
Dit manuscript beschrijft de praktische implementatie van BLI in een muis urineweginfectie model. Hier wordt een stapsgewijze handleiding gegeven voor het kweken van bacteriën, intravesicale instillatie en beeldvorming. De in vivo correlatie met CFU wordt onderzocht en een proof-of-concept wordt geleverd door de bacteriële belasting van onbehandelde geïnfecteerde dieren te vergelijken met met antibiotica behandelde dieren. Verder worden de voordelen, beperkingen en overwegingen die specifiek zijn voor de implementatie van BLI in een in vivo UTI-model besproken. De implementatie van BLI in het UTI-onderzoeksveld zal het onderzoek naar de pathogenese van UTI en de ontdekking van nieuwe manieren om UTI te voorkomen en te behandelen aanzienlijk vergemakkelijken.

In vivo BLI correleert met CFU van het entmateriaal op het moment van instillatie. Om de detectiegrens van BLI in vivo en de correlatie met CFU van het entmateriaal te evalueren, werden muizen geïnfecteerd met verschillende concentraties UTI89-lux en PBS als negatieve controle. Vóór instillatie werden niet-geïnfecteerde dieren gescand om de achtergrondluminescentie te bepalen. Latere beelden werden onmiddellijk na instillatie verkregen<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging at JoVE.com

Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

Dit manuscript beschrijft de intravesicale toediening van uropathogene bacteriën met een lux operon om een urineweginfectie bij muizen te induceren en de daaropvolgende longitudinale in vivo analyse van de bacteriële belasting met behulp van bioluminescentie beeldvorming.

Longitudinale follow-up van urineweginfecties en hun behandeling bij muizen met behulp van bioluminescentiebeeldvorming

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

De opsomming van kolonievormende eenheden beperkte de reproduceerbaarheid van onderzoek op het gebied van UTI. Bioluminescentie beeldvorming zal in vivo UTI-onderzoek naar blaasfysiologie, UTI pathogenese en gevoeligheid bevorderen. Bioluminescentie beeldvorming maakt longitudinale follow-up mogelijk met real-time inzicht in de evolutie van de infectie.Bovendien vermindert het drastisch het aantal dieren dat nodig is. Bioluminescentie beeldvorming vergemakkelijkt onderzoek naar terugkerende of chronische infecties, die vaak voorkomen bij mensen. Bovendien kunnen onderzoekers oplopende infecties of verspreiding naar het bloed identificeren met behulp van bioluminescentiebeeldvorming.Verkrijg enkele kolonies door de glycerolvoorraad bacteriën uit te streep met een inentingslus op LB-platen aangevuld met kanamycinesulfaat en 's nachts te kweken bij 37 graden Celsius. Vul een steriele 14 milliliter polystyreen ronde onderbuis, met snap caps met dubbele positie met vijf milliliter LB bouillon aangevuld met kanamycinesulfaat. Kies een enkele bacteriekolonie met een inentingslus en voeg dit toe aan de LB-bouillon.Vortex gedurende 10 seconden om een goede menging te garanderen. Cultuur statisch met de klikdop 's nachts in de open positie bij 37 graden Celsius. Na de incubatie vortex de buis gedurende 10 seconden om een goede homogenisatie van de bacteriecultuur te garanderen.Maak een subcultuur in de Erlenmeyer door 25 microliter van de bacteriële suspensie toe te voegen aan 25 milliliter vers LB-medium zonder antibiotica. Sluit de Erlenmeyer en cultuur 's nachts statisch af. Giet op de dag van installatie de cultuur van de Erlennmeyer in een kweekbuis van 50 milliliter en centrifuge.Decanteer het supernatant en resuspend de bacteriële pellet in 10 milliliter steriel PBS. Draai de buis opnieuw gedurende 10 seconden. Kies de experimentele concentratie van het entmateriaal en bepaal de bijbehorende OD op 600 nanometer met behulp van de standaardcurve.Voeg één milliliter van de geresuspendeerde bacteriecultuur toe aan negen milliliter steriel PBS en pas aan totdat de gewenste OD 600 nanometer is bereikt. Monteer een steriele 24-gauge angiocatheter tip op een 100-microliter spuit. Vul de spuit met de bereide bacteriële oplossing.Plaats één dier op een werkoppervlak in rugligging en zorg voor een stabiele isofluraan-anesthesie met behulp van een neuskegel tijdens de installatie. Breng de oogzalf aan. Verdrijft de resterende urine door zachte compressie toe te passen en cirkelvormige bewegingen te maken op het suprapubische gebied en reinig vervolgens de onderbuik met 70% ethanol.Smeer de kathetertip in met een normale zoutoplossing. Leg de wijsvinger op de niet-dominante hand op de buik en duw deze zachtjes omhoog. Start de katheterisatie van de urethra verticaal in een hoek van 90 graden.Zodra weerstand wordt ondervonden, kantelt u het horizontaal voordat u het verder inbrengt. Voer een langzame installatie uit van 50 microliter van het bacteriële entmateriaal. Houd na de installatie de spuit en katheter nog een paar seconden op hun plaats en trek dan langzaam terug om lekkage te voorkomen.Gebruik één katheter per experimentele groep. Plaats het dier in rugligging in de neuskegel om het voor te bereiden op beeldvorming en bereid het voor op beeldvorming met behulp van één katheter per experimentele groep. Dien indien nodig antibiotica of experimentele geneesmiddelen toe, zoals vermeld in het teksthandschrift.Open de BLI-acquisitiesoftware en klik op Initialiseren in het beeldapparaat om de camera en het podiumcontrollersysteem te testen en de camera van het opgeladen apparaat te koelen tot min 90 graden Celsius. Klik op Acquisitie, AutoSave To.Select Luminescence en Photograph. Controleer de standaard lichtgevende instellingen door het excitatiefilter in te stellen op Blokkeren en het emissiefilter op Openen.Stel de belichtingstijd in op automatisch bij het maken van de eerste foto. Voor in vivo metingen en heldere signalen stelt u de belichtingstijd in op ongeveer 30 seconden. Verkort de belichtingstijd als er een waarschuwing verschijnt vanwege een verzadigd beeld.Selecteer de medium binning, F/stop one, en kies de juiste FOV. Stel de hoogte van het onderwerp in op één centimeter bij het fotograferen van muizen. Beeld tot vijf mijl tegelijkertijd in en scheid de dieren met behulp van de lichtbaffle om reflectie te voorkomen.Sluit de deur en klik op Verwerven om de beeldvormingssequentie te starten en vul vervolgens gedetailleerde informatie over het experiment in. Verwijder muizen uit de beeldvormingskamer en breng ze terug naar hun kooi. Controleer op volledig herstel na anesthesie en breng de kooien vervolgens terug naar de geventileerde rekken tot de volgende beeldvormingscyclus.Start de beeldvormingssoftware en laad het experimentele bestand door op Bladeren te klikken. Gebruik het gereedschapspalet om de kleurenschaal van de afbeelding aan te passen. Gebruik de ROI-tools om een interessant gebied op de afbeelding te tekenen, ervoor te zorgen dat deze groot genoeg is om het volledige gebied te bestrijken en dezelfde afmetingen te gebruiken voor alle afbeeldingen.Klik vervolgens op ROI-meting om de lichtintensiteit te kwantificeren. Latere beelden van muizen die onmiddellijk na de installatie werden verkregen, toonden aan dat robuust detecteerbaar was boven 20.000 kolonievormende eenheden, en een lineaire correlatie tussen de kolonievormende eenheden van het entmateriaal en de bioluminescentie in vivo werd vastgesteld. De natuurlijke evolutie van een urineweginfectie werd bestudeerd in een controlegroep die geen behandeling kreeg.Het effect van antibioticabehandeling op de infectiekinetiek werd in detail gevisualiseerd in een groep met antibiotica behandelde dieren. Een onmiddellijke afname van de bacteriële belasting, zoals gemeten door de totale fotonenflux, werd waargenomen na de eerste dosis Enrofloxacine. Geen van de behandelde dieren had een daaropvolgende stijging van de bacteriële belasting.De totale bacteriële belasting van elk dier werd berekend met behulp van het gebied onder de curve van de log getransformeerde totale fotonenflux, wat een significant verschil liet zien tussen dieren behandeld met Enrofloxacine en onbehandelde dieren in de loop van 10 dagen. Deze resultaten leveren het bewijs dat BLI kan worden gebruikt om verschillen in UTI-infectiekinetiek te evalueren. Bioluminescentie beeldvorming is een niet-invasieve techniek die kan worden gecombineerd met andere methoden, zoals het regelmatig verzamelen van urinemonsters voor bacteriële of biochemische analyse of voor de experimenten.Hier hebben we aangetoond dat bioluminescentie beeldvorming een krachtig hulpmiddel is om nieuwe therapeutische strategieën voor het ziekteverloop van urineweginfecties te evalueren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Transurethrale Inductie van Mouse urineweginfectie

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Bioluminescentie beeldvorming van NADPH-oxidase activiteit in verschillende diermodellen

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D multimodale beeldvorming van<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecties in Muizen

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronische<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luchtweginfectie in Muizen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Bioluminescentie Imaging te laat stadium Infectie van Afrikaanse trypanosomiasis Detect

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urineweginfectie in een kleine diermodel: transuretrale catheterisatie van mannelijke en vrouwelijke muizen

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In vivo onderzoek naar Antimicrobial Blue Light therapie voor Multiresistente Acinetobacter baumannii Burn Infecties met behulp van bioluminescentie Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Een multimodale Imaging aanpak op basis van Micro-CT en fluorescentie moleculaire tomografie voor longitudinale beoordeling van bleomycine-geïnduceerde Lung Fibrosis in muizen

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolatie van één intracellulaire bacteriële gemeenschappen gegenereerd op basis van een lymfkliertest Model van urine landstreekbesmetting Downstream eencellige p.a.

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...