Name: longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging
Uploaded: 2021-06-14T13:30:00
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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation pour la recherche - Flandre (FWO Vlaanderen; G0A6113N), le Conseil de recherche de la KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. et W.E.) et le VIB (à la télévision). W.E. est chercheur clinique senior de la Research Foundation - Flanders (FWO Vlaanderen). La souche UTI89-lux était un don généreux du laboratoire du professeur Seed13.

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux lignes directrices du Conseil communautaire de l’Union européenne et ont été approuvées par le comité d’éthique animale de la KU Leuven (P158/2018).
1. Cultiver des bactéries (adaptées de7,13,14)
<ol><li>Préparation<ol>
<li>Choisissez une variété UPEC luminescente qui correspond le mieux aux besoins expérimen...

<ol>
	<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+urinary+tract+infections:+incidence,+morbidity,+and+economic+costs.">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).</li><li>O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+vaccine+development+for+the+treatment+and+prevention+of+urinary+tract+infections.">Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections.</a> Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).</li><li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection.">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).</li><li>Carey, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+of+mice+to+model+human+disease:+Practicalities,+implications+and+limitations.">Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations.</a> Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).</li><li>Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+model+systems+for+the+study+of+urinary+tract+infections+and+related+pathologies.">Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).</li><li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+indicators+in+living+mammals.">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+monitoring+of+infectious+diseases+in+living+animals+using+bioluminescence+imaging.">In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging.</a> Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).</li><li>Balsara, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+susceptibility+to+urinary+tract+infection+in+the+spinal+cord-injured+host+with+neurogenic+bladder.">Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).</li><li>Huang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy+mediated+by+methylene+blue+and+potassium+iodide+to+treat+urinary+tract+infection+in+a+female+rat+model.">Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).</li><li>Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+persistent+Escherichia+coli+reservoir+during+the+acute+phase+of+a+bladder+infection.">Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection.</a> Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).</li><li>Hannan, T. J., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+E.+coli+urinary+tract+infection.">A murine model for E. coli urinary tract infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).</li><li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains.">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Nonsteroidal+Anti-inflammatory+Drugs+for+Treatment+of+Uncomplicated+Lower+Urinary+Tract+Infections+in+Women:+A+Meta-analysis.">Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis.</a> Infectious Microbes &amp; Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+bioluminescence+imaging+of+fungal+dissemination+to+the+brain+in+mouse+models+of+cryptococcosis.">Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).</li><li>Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+looking+beyond+the+light.">Bioluminescence imaging: looking beyond the light.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).</li><li>Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancy+between+viable+counts+and+light+output+as+viability+measurements,+following+ciprofloxacin+challenge+of+self-bioluminescent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).</li><li>Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+increases+in+vivo+screening+efficiency+for+antifungal+activity+against+device-associated+Candida+albicans+biofilms.">Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilm+development+on+medically-relevant+foreign+bodies+in+a+mouse+subcutaneous+model+followed+by+bioluminescence+imaging.">Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).</li><li>Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+non-invasive+monitoring+of+pathogen-host+interactions+during+Candida+albicans+biofilm+formation+using+in+vivo+bioluminescence.">Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence.</a> Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).</li></ol>

Avantages de BLI par rapport au nombre d’UFC Données longitudinales Un inconvénient majeur de la méthode traditionnelle de comptage de l’UFC pour quantifier la charge microbienne est l’exigence d’homogénats d’organes post-mortem, ne fournissant qu’un seul point de données transversale par animal. Inversement, BLI permet un suivi longitudinal non invasif des animaux infectés. Les animaux peuvent être photographiés 2 à 3 fois par jour, fournissant un aperçu détaillé d...

Les infections des voies urinaires (IVU) sont parmi les infections bactériennes les plus courantes chez l’homme. Près de la moitié des femmes connaîtront une infection urinaire symptomatique au cours de leur vie1. Les infections limitées à la vessie peuvent donner lieu à des symptômes urinaires tels qu’une augmentation de la fréquence urinaire, l’urgence, l’hématurie, l’incontinence et la douleur. Lorsque l’infection monte dans les voies urinaires supérieures, les patients développent une pyélonéphrite, avec malaise, fièvre, frissons et maux de dos. En outre, jusqu’à 20% des patients atteints d’infections urinaires souffrent d’infections récurrentes entraînant une diminution spectaculaire de la sensibilité aux antibiotiques2,3,4. Au cours des dernières années, il y a eu un intérêt croissant pour les nouvelles thérapies pour le traitement et la prévention des infections urinaires récurrentes. Malgré une meilleure compréhension de l’immunité innée et adaptative des voies urinaires inférieures et des facteurs de virulence bactérienne nécessaires à l’invasion et à la colonisation, aucun changement radical dans le régime de traitement n’a été traduit dans la pratique urologique quotidienne2. Afin d’étudier la pathogenèse et la susceptibilité aux infections urinaires in vivo,un test reproductible et non invasif est indispensable.
Plusieurs modèles d’infection urinaire animale ont été décrits allant des nématodes aux primates, mais le modèle murin est principalement utilisé5,6. Ce modèle consiste en un cathétérisme transurétral de souris (femelles) et l’instillation ultérieure d’une suspension bactérienne, le plus souvent escherichia coli uropathogène (UPEC), directement dans la lumière de la vessie7. Après l’inoculation, la charge bactérienne a traditionnellement été quantifiée en déterminant les unités formant des colonies (UFC). Cette technique nécessite de sacrifier des animaux pour obtenir des homogénats d’organes post-mortem et des dilutions en série, ce qui limite la production de données et la reproductibilité. De plus, le suivi longitudinal de la charge bactérienne chez les animaux individuels n’est pas possible en utilisant cette technique.
En 1995, Contag et al. ont suggérél’utilisation d’agents pathogènes marqués au bioluminescent pour surveiller les processus pathologiques chez les animaux vivants8,9. Depuis lors, l’imagerie par bioluminescence (BLI) a été appliquée à de nombreux modèles d’infection tels que la méningite, l’endocardite, l’ostéomyélite, les infections de la peau et des tissus mous, etc.10,11,12. Dans le modèle UTI murin, une souche UPEC avec l’opéron lux complet(luxCDABE)de Photorhabdus luminescens peut être utilisée13. Une réaction enzymatique est catalysée par la luciférase bactérienne qui dépend de l’oxydation des aldéhydes à longue chaîne réagissant avec le mononucléotide de flavine réduit en présence d’oxygène, donnant la flavine oxydée, un acide gras à longue chaîne et la lumière12. L’opéron lux code pour la luciférase et d’autres enzymes nécessaires à la synthèse des substrats. Par conséquent, toutes les bactéries métaboliquement actives émettront continuellement de la lumière bleu-vert (490 nm) sans avoir besoin de l’injection d’un substrat exogène12. Les photons émis par les bactéries marquées luxpeuvent être capturés à l’aide de caméras CCD (Charge-Coupled Device) refroidies très sensibles.
L’utilisation de bactéries bioluminescentes dans un modèle d’infection urinaire permet la quantification longitudinale et non invasive de la charge bactérienne, en omettant la nécessité de sacrifier des animaux à des moments fixes pendant le suivi de la détermination de l’UFC. Malgré le large éventail de possibilités, l’accumulation de preuves de la robustesse de cette technique BLI dans d’autres domaines et de ses avantages par rapport aux modèles classiques d’infection urinaire, elle n’a pas été largement mise en œuvre dans la recherche sur les infections urinaires. Le protocole présenté ici fournit un guide détaillé étape par étape et met en évidence les avantages de BLI pour toutes les futures recherches sur les infections urinaires.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3925</td>
			<td>for in vitro imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap ISIS</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>hair trimmer, with GT608 cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer</td>
			<td>Harvard apparatus limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 100 mg/mL</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte Autoguard 24 GA</td>
			<td>BD</td>
			<td>382912</td>
			<td>Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6J mice</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropsense 16</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>Trinean</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Gibco</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>REF 14040-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% denaturated 5L</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>85825360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50ml cellstart</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 &#181;L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26203</td>
			<td>to ensure slow bacterial instillation of 50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6174.1</td>
			<td>holder: Art. No. 6189.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-Vet 1000mg/g</td>
			<td>Dechra Veterinary products</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>REF 124262</td>
			<td>imaging device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine solution 50 mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BLI acquisition software, version 4.7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L3022</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth with agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L2897</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish Sterilin 90mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>to fill with LB agar supplemented with Km</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Culture flask 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLW1141/08-20EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide 200 Trinean</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>701-2007</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTI89-lux</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generous gift from Prof. Seed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>444-1372</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging

Les infections des voies urinaires (IVU) se classent parmi les infections bactériennes les plus courantes chez l’homme et sont systématiquement traitées avec des antibiotiques empiriques. Cependant, en raison de l’augmentation de la résistance microbienne, l’efficacité des antibiotiques les plus utilisés a diminué. Pour trouver d’autres options de traitement, il est très nécessaire de mieux comprendre la pathogenèse des infections urinaires et les mécanismes qui déterminent la susceptibilité aux infections urinaires. Afin d’étudier cela dans un modèle animal, un test reproductible et non invasif pour étudier l’évolution de l’infection urinaire est indispensable.
Pendant des années, l’étalon-or pour le dénombrement de la charge bactérienne a été la détermination des unités formant des colonies (UFC) pour un volume d’échantillon particulier. Cette technique nécessite des homogénats d’organes post-mortem et des dilutions en série, ce qui limite la production de données et la reproductibilité. Comme alternative, l’imagerie par bioluminescence (BLI) gagne en popularité pour déterminer la charge bactérienne. Le marquage des agents pathogènes à l’aide d’un opéron lux permet la détection et la quantification sensibles de manière non invasive, permettant ainsi un suivi longitudinal. Jusqu’à présent, l’adoption de l’BLI dans la recherche sur les infections urinaires reste limitée.
Ce manuscrit décrit la mise en œuvre pratique de BLI dans un modèle d’infection des voies urinaires chez la souris. Ici, un guide étape par étape pour la culture des bactéries, l’instillation intravésicale et l’imagerie est fourni. La corrélation in vivo avec l’UFC est examinée et une preuve de concept est fournie en comparant la charge bactérienne d’animaux infectés non traités avec des animaux traités aux antibiotiques. En outre, les avantages, les limites et les considérations spécifiques à la mise en œuvre de BLI dans un modèle d’infection urinaire in vivo sont discutés. La mise en œuvre de l’BLI dans le domaine de la recherche sur les infections urinaires facilitera grandement la recherche sur la pathogenèse des infections urinaires et la découverte de nouvelles façons de prévenir et de traiter les infections urinaires.

In vivo BLI est en corrélation avec l’UFC de l’inoculum au moment de l’instillation. Pour évaluer la limite de détection de BLI in vivo et la corrélation avec l’UFC de l’inoculum, des souris ont été infectées par différentes concentrations d’UTI89-lux et de PBS comme témoin négatif. Avant l’instillation, les animaux non infectés ont été scannés pour déterminer la luminescence de fond. Les images suivantes ont été obtenues imm?...

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Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

Ce manuscrit décrit l’administration intravésicale de bactéries uropathogènes avec un opéron lux pour induire une infection des voies urinaires chez la souris et l’analyse longitudinale in vivo ultérieure de la charge bactérienne à l’aide de l’imagerie par bioluminescence.

Suivi longitudinal des infections des voies urinaires et leur traitement chez la souris à l’aide de l’imagerie par bioluminescence

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

Le dénombrement des unités formant des colonies limitait la reproductibilité de la recherche dans le domaine des infections urinaires. L’imagerie par bioluminescence fera progresser la recherche in vivo sur les infections urinaires sur la physiologie de la vessie, la pathogenèse des infections urinaires et la susceptibilité. L’imagerie par bioluminescence permet un suivi longitudinal avec un aperçu en temps réel de l’évolution de l’infection.De plus, il réduit considérablement le nombre d’animaux nécessaires. L’imagerie par bioluminescence facilite la recherche sur les infections récurrentes ou chroniques, qui sont fréquentes chez l’homme. De plus, les chercheurs peuvent identifier les infections ascendantes ou la dissémination dans le sang à l’aide de l’imagerie par bioluminescence.Obtenir des colonies uniques en striant le stock de glycérol des bactéries avec une boucle d’inoculation sur des plaques LB complétées en sulfate de kanamycine et en cultivant pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Remplissez un tube inférieur rond stérile en polystyrène de 14 millilitres, avec des bouchons à double position avec cinq millilitres de bouillon LB complétés par du sulfate de kanamycine. Choisissez une seule colonie bactérienne avec une boucle d’inoculation et ajoutez-la au bouillon LB.Vortex pendant 10 secondes pour assurer un bon mélange. Culture statique avec le capuchon en position ouverte à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation, vortex le tube pendant 10 secondes pour assurer une homogénéisation correcte de la culture bactérienne.Faire une sous-culture dans l’Erlenmeyer en ajoutant 25 microlitres de la suspension bactérienne à 25 millilitres de milieu LB frais sans antibiotiques. Fermez l’Erlenmeyer et la culture statiquement pendant la nuit. Le jour de l’installation, versez la culture de l’Erlennmeyer dans un tube de culture de 50 millilitres et centrifugez.Décantez le surnageant et remettez en suspension la pastille bactérienne dans 10 millilitres de PBS stérile. Vortex à nouveau le tube pendant 10 secondes. Choisissez la concentration expérimentale de l’inoculum et déterminez la DO correspondante à 600 nanomètres à l’aide de la courbe standard.Ajouter un millilitre de la culture bactérienne remise en suspension dans neuf millilitres de PBS stérile et ajuster jusqu’à ce que le DO souhaité 600 nanomètres soit atteint. Montez une pointe d’angiocathéter stérile de calibre 24 sur une seringue de 100 microlitres. Remplissez la seringue avec la solution bactérienne préparée.Placez un animal sur une surface de travail en position couchée et maintenez une anesthésie stable à l’isoflurane à l’aide d’un cône nasal pendant l’installation. Appliquez la pommade pour les yeux. Expulser l’urine résiduelle en appliquant une compression douce et en effectuant des mouvements circulaires sur la région sus-pubienne, puis nettoyer le bas-ventre avec de l’éthanol à 70%.Lubrifiez l’extrémité du cathéter avec une solution saline normale. Placez l’index sur la main non dominante sur l’abdomen et poussez-le doucement vers le haut. Commencez le cathétérisme de l’urètre verticalement dans un angle de 90 degrés.Une fois la résistance rencontrée, inclinez-la horizontalement avant de l’insérer davantage. Effectuer une installation lente de 50 microlitres de l’inoculum bactérien. Après l’installation, maintenez la seringue et le cathéter en place pendant quelques secondes de plus, puis rétractez-vous lentement pour éviter les fuites.Utilisez un cathéter par groupe expérimental. Placez l’animal en position couchée dans le cône du nez pour le préparer à l’imagerie et préparez-le pour l’imagerie à l’aide d’un cathéter par groupe expérimental. Si nécessaire, administrer des antibiotiques ou des médicaments expérimentaux, comme mentionné dans le manuscrit du texte.Ouvrez le logiciel d’acquisition BLI et cliquez sur Initialiser dans le dispositif d’imagerie pour tester la caméra et le système de contrôleur de scène et pour refroidir la caméra de l’appareil à couplage de charge à moins 90 degrés Celsius. Cliquez sur Acquisition, Enregistrement automatique vers.Sélectionnez Luminescence et Photographie. Vérifiez les paramètres luminescents par défaut en réglant le filtre d’excitation sur Bloquer et le filtre d’émission sur Ouvrir.Réglez le temps d’exposition sur auto lors de la prise de la première image. Pour les mesures in vivo et les signaux lumineux, réglez le temps d’exposition à environ 30 secondes. Réduisez le temps d’exposition si un avertissement apparaît en raison d’une image saturée.Sélectionnez le binning moyen, F/stop one, puis choisissez le champ de vision approprié. Réglez la hauteur du sujet sur un centimètre lors de l’imagerie de souris. Imagez jusqu’à cinq miles simultanément et séparez les animaux à l’aide du déflecteur de lumière pour empêcher la réflexion.Fermez la porte et cliquez sur Acquérir pour démarrer la séquence d’imagerie, puis remplissez des informations détaillées sur l’expérience. Retirez les souris de la chambre d’imagerie et retournez-les dans leur cage. Vérifiez la récupération complète après l’anesthésie, puis retournez les cages dans les racks ventilés jusqu’au prochain cycle d’imagerie.Démarrez le logiciel d’imagerie et chargez le fichier expérimental en cliquant sur Parcourir. Utilisez la palette d’outils pour ajuster l’échelle de couleurs de l’image. Utilisez les outils de retour sur investissement pour dessiner une région d’intérêt sur l’image, en vous assurant qu’elle est suffisamment grande pour couvrir toute la zone et en utilisant les mêmes dimensions pour toutes les images.Cliquez ensuite sur Mesure du retour sur investissement pour quantifier l’intensité lumineuse. Des images ultérieures de souris obtenues immédiatement après l’installation ont montré qu’elles étaient solidement détectables au-dessus de 20 000 unités formant des colonies, et une corrélation linéaire entre les unités formant des colonies de l’inoculum et la bioluminescence in vivo a été établie. L’évolution naturelle d’une infection des voies urinaires a été étudiée dans un groupe témoin qui n’a reçu aucun traitement.L’effet du traitement antibiotique sur la cinétique de l’infection a été visualisé en détail dans un groupe d’animaux traités aux antibiotiques. Une diminution immédiate de la charge bactérienne, mesurée par le flux total de photons, a été observée après la première dose d’enrofloxacine. Aucun des animaux traités n’a connu une augmentation ultérieure de la charge bactérienne.La charge bactérienne globale de chaque animal a été calculée en utilisant l’aire sous la courbe du flux total de photons transformé logarithmique, montrant une différence significative entre les animaux traités avec De l’enrofloxacine et les animaux non traités sur une période de 10 jours. Ces résultats fournissent une preuve de concept que le BLI peut être utilisé pour évaluer les différences dans la cinétique de l’infection urinaire. L’imagerie par bioluminescence est une technique non invasive qui peut être combinée avec d’autres méthodes telles que la collecte régulière d’échantillons urinaires pour l’analyse bactérienne ou biochimique ou pour les expériences.Ici, nous avons démontré que l’imagerie par bioluminescence est un outil puissant pour évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques sur l’évolution de la maladie des infections des voies urinaires.

Research

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