Name: longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging
Uploaded: 2021-06-14T13:30:00
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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Forschungsstiftung - Flandern (FWO Vlaanderen; G0A6113N), der Forschungsrat der KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. und W.E.) und das VIB (an T.V.). W.E. ist leitender klinischer Forscher der Forschungsstiftung - Flandern (FWO Vlaanderen). Die Sorte UTI89-lux war ein großzügiges Geschenk aus dem Labor von Prof. Seed13.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Gemeinschaftsrates der Europäischen Union durchgeführt und von der Tierethikkommission der KU Leuven genehmigt (P158/2018).
1. Kultivierende Bakterien (angepasst an7,13,14)
<ol><li>Präparat<ol>
<li>Wählen Sie einen lumineszierenden UPEC-Stamm, der den experimentellen Anforderungen am besten entspricht. HINWEIS: Hier wurde da...

<ol>
	<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+urinary+tract+infections:+incidence,+morbidity,+and+economic+costs.">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).</li><li>O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+vaccine+development+for+the+treatment+and+prevention+of+urinary+tract+infections.">Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections.</a> Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).</li><li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection.">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).</li><li>Carey, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+of+mice+to+model+human+disease:+Practicalities,+implications+and+limitations.">Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations.</a> Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).</li><li>Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+model+systems+for+the+study+of+urinary+tract+infections+and+related+pathologies.">Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).</li><li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+indicators+in+living+mammals.">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+monitoring+of+infectious+diseases+in+living+animals+using+bioluminescence+imaging.">In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging.</a> Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).</li><li>Balsara, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+susceptibility+to+urinary+tract+infection+in+the+spinal+cord-injured+host+with+neurogenic+bladder.">Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).</li><li>Huang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy+mediated+by+methylene+blue+and+potassium+iodide+to+treat+urinary+tract+infection+in+a+female+rat+model.">Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).</li><li>Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+persistent+Escherichia+coli+reservoir+during+the+acute+phase+of+a+bladder+infection.">Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection.</a> Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).</li><li>Hannan, T. J., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+E.+coli+urinary+tract+infection.">A murine model for E. coli urinary tract infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).</li><li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains.">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Nonsteroidal+Anti-inflammatory+Drugs+for+Treatment+of+Uncomplicated+Lower+Urinary+Tract+Infections+in+Women:+A+Meta-analysis.">Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis.</a> Infectious Microbes &amp; Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+bioluminescence+imaging+of+fungal+dissemination+to+the+brain+in+mouse+models+of+cryptococcosis.">Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).</li><li>Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+looking+beyond+the+light.">Bioluminescence imaging: looking beyond the light.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).</li><li>Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancy+between+viable+counts+and+light+output+as+viability+measurements,+following+ciprofloxacin+challenge+of+self-bioluminescent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).</li><li>Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+increases+in+vivo+screening+efficiency+for+antifungal+activity+against+device-associated+Candida+albicans+biofilms.">Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilm+development+on+medically-relevant+foreign+bodies+in+a+mouse+subcutaneous+model+followed+by+bioluminescence+imaging.">Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).</li><li>Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+non-invasive+monitoring+of+pathogen-host+interactions+during+Candida+albicans+biofilm+formation+using+in+vivo+bioluminescence.">Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence.</a> Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).</li></ol>

Vorteile von BLI gegenüber CFU-Zählungen Längsschnittdaten Ein großer Nachteil der traditionellen Methode zur Zählung der KBE zur Quantifizierung der mikrobiellen Belastung ist die Anforderung von postmortalen Organhomogenaten, die nur einen Querschnittsdatenpunkt pro Tier liefern. Umgekehrt ermöglicht BLI eine nicht-invasive Längsschnitt-Nachsorge infizierter Tiere. Die Tiere können 2 bis 3 Mal am Tag abgebildet werden und geben einen detaillierten Einblick in die Kinetik der Infe...

Harnwegsinfektionen (UTI) gehören zu den häufigsten bakteriellen Infektionen beim Menschen. Fast die Hälfte aller Frauen wird im Laufe ihres Lebens eine symptomatische Harnwegsinfektion erfahren1. Infektionen, die auf die Blase beschränkt sind, können zu Harnwegssymptomen wie Zunahme der Harnfrequenz, Dringlichkeit, Hämaturie, Inkontinenz und Schmerzen führen. Wenn die Infektion in die oberen Harnwege aufsteigt, entwickeln die Patienten pyelonephritis mit Unwohlsein, Fieber, Schüttelfrost und Rückenschmerzen. Darüber hinaus leiden bis zu 20% der Patienten mit Harnwegsinfektionen an wiederkehrenden Infektionen, was zu einer dramatischen Abnahme der Antibiotikaempfindlichkeit führt2,3,4. In den letzten Jahren gab es ein wachsendes Interesse an neuartigen Therapien zur Behandlung und Prävention von rezidivierenden Harnwegsinfektionen. Trotz eines besseren Verständnisses der angeborenen und adaptiven Immunität der unteren Harnwege und der bakteriellen Virulenzfaktoren, die für die Invasion und Kolonisierung notwendig sind, wurden keine radikalen Veränderungen im Behandlungsregime auf die tägliche urologische Praxis übertragen2. Um die Pathogenese und Suszeptibilität von Harnwegsinfektionen in vivozu untersuchen, ist ein reproduzierbarer und nicht-invasiver Assay unerlässlich.
Mehrere tierische UTI-Modelle wurden beschrieben, die von Nematoden bis zu Primaten reichen, aber das murine Modell wird überwiegend verwendet5,6. Dieses Modell besteht aus der transurethralen Katheterisierung von (weiblichen) Mäusen und der anschließenden Instillation einer bakteriellen Suspension, am häufigsten uropathogenen Escherichia coli (UPEC), direkt in das Blasenlumen7. Nach der Impfung wurde die Keimbelastung traditionell durch Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (KBE) quantifiziert. Diese Technik erfordert das Opfern von Tieren, um postmortale Organhomogenate und serielle Verdünnungen zu erhalten, was die Datenausgabe und Reproduzierbarkeit einschränkt. Darüber hinaus ist eine longitudinale Nachsorge der Keimbelastung bei einzelnen Tieren mit dieser Technik nicht möglich.
1995 schlugen Contag etal. die Verwendung von biolumineszenzmarkierten Krankheitserregern zur Überwachung von Krankheitsprozessen beilebendenTieren vor 8,9. Seitdem wurde die Biolumineszenzbildgebung (BLI) auf zahlreiche Infektionsmodelle wie Meningitis, Endokarditis, Osteomyelitis, Haut- und Weichteilinfektionen usw. angewendet.10,11,12. Im murinen UTI-Modell kann eine UPEC-Dehnung mit dem kompletten Lux-Operon (luxCDABE) von Photorhabdus luminescens verwendet werden13. Eine enzymatische Reaktion wird durch die bakterielle Luciferase katalysiert, die von der Oxidation langkettiger Aldehyde abhängig ist, die mit reduziertem Flavinmononukleotid in Gegenwart von Sauerstoff reagieren und das oxidierte Flavin, eine langkettige Fettsäure und Licht12ergeben. Das Lux-Operon kodiert für die Luciferase und andere Enzyme, die für die Synthese der Substrate benötigt werden. Daher emittieren alle metabolisch aktiven Bakterien kontinuierlich blaugrünes (490 nm) Licht, ohne dass die Injektion eines exogenen Substrats erforderlich ist12. Photonen, die von lux-markiertenBakterien emittiert werden, können mit hochempfindlichen, gekühlten CCD-Kameras (Charge-Coupled Device) erfasst werden.
Die Verwendung von biolumineszierenden Bakterien in einem Modell für Harnwegsinfektionen ermöglicht die longitudinale, nicht-invasive Quantifizierung der Bakterienbelastung, wobei die Notwendigkeit entfällt, Tiere zu festen Zeitpunkten während der Nachbeobachtung für die CFU-Bestimmung zu opfern. Trotz der breiten Palette von Möglichkeiten, die Beweise für die Robustheit dieser BLI-Technik in anderen Bereichen und ihre Vorteile gegenüber klassischen Modellen der Harnwegsinfektion sammeln, wurde sie in der HWI-Forschung nicht weit verbreitet. Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung und hebt die Vorteile von BLI für die gesamte zukünftige UTI-Forschung hervor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3925</td>
			<td>for in vitro imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap ISIS</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>hair trimmer, with GT608 cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer</td>
			<td>Harvard apparatus limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 100 mg/mL</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte Autoguard 24 GA</td>
			<td>BD</td>
			<td>382912</td>
			<td>Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6J mice</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropsense 16</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>Trinean</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Gibco</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>REF 14040-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% denaturated 5L</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>85825360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50ml cellstart</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 &#181;L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26203</td>
			<td>to ensure slow bacterial instillation of 50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6174.1</td>
			<td>holder: Art. No. 6189.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-Vet 1000mg/g</td>
			<td>Dechra Veterinary products</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>REF 124262</td>
			<td>imaging device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine solution 50 mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BLI acquisition software, version 4.7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L3022</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth with agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L2897</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish Sterilin 90mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>to fill with LB agar supplemented with Km</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Culture flask 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLW1141/08-20EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide 200 Trinean</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>701-2007</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTI89-lux</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generous gift from Prof. Seed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>444-1372</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging

Harnwegsinfektionen (UTI) gehören zu den häufigsten bakteriellen Infektionen beim Menschen und werden routinemäßig mit empirischen Antibiotika behandelt. Aufgrund der zunehmenden mikrobiellen Resistenz ist die Wirksamkeit der am häufigsten verwendeten Antibiotika jedoch zurückgegangen. Um alternative Behandlungsmöglichkeiten zu finden, besteht ein großer Bedarf an einem besseren Verständnis der HWI-Pathogenese und der Mechanismen, die die UTI-Anfälligkeit bestimmen. Um dies im Tiermodell zu untersuchen, ist ein reproduzierbarer, nicht-invasiver Assay zur Untersuchung des Verlaufs der Harnwegsinfektion unabdingbar.
Der Goldstandard für die Aufzählung der Bakterienbelastung ist seit Jahren die Bestimmung von Colony Forming Units (CFU) für ein bestimmtes Probenvolumen. Diese Technik erfordert postmortale Organhomogenate und serielle Verdünnungen, die die Datenausgabe und Reproduzierbarkeit einschränken. Als Alternative gewinnt die Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) an Popularität, um die Bakterienbelastung zu bestimmen. Die Markierung von Krankheitserregern mit einem Lux-Operon ermöglicht den sensitiven Nachweis und die Quantifizierung auf nicht-invasive Weise und ermöglicht so eine longitudinale Nachsorge. Bisher ist die Einführung von BLI in der Harnwegsinfektionsforschung begrenzt.
Dieses Manuskript beschreibt die praktische Implementierung von BLI in einem Maus-Harnwegsinfektionsmodell. Hier wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Kultivierung von Bakterien, die intravesikale Instillation und die Bildgebung bereitgestellt. Die in vivo Korrelation mit CFU wird untersucht und ein Proof-of-Concept wird durch den Vergleich der Keimbelastung von unbehandelten infizierten Tieren mit antibiotikabehandelten Tieren erbracht. Darüber hinaus werden die Vorteile, Einschränkungen und Überlegungen speziell für die Implementierung von BLI in einem in vivo UTI-Modell diskutiert. Die Implementierung von BLI im UTI-Forschungsfeld wird die Erforschung der Pathogenese von UTI und die Entdeckung neuer Wege zur Prävention und Behandlung von UTI erheblich erleichtern.

In vivo BLI korreliert mit der KBE des Inokulums zum Zeitpunkt der Instillation. Um die Nachweisgrenze von BLI in vivo und die Korrelation mit der KBE des Inokulums zu bewerten, wurden Mäuse mit unterschiedlichen Konzentrationen von UTI89-lux und PBS als Negativkontrolle infiziert. Vor der Instillation wurden nicht infizierte Tiere gescannt, um die Hintergrundlumineszenz zu bestimmen. Nachfolgende Bilder wurden unmittelbar nach der Instillation aufgenommen...

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Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

Dieses Manuskript beschreibt die intravesikale Verabreichung von uropathogenen Bakterien mit einem Lux-Operon zur Induktion einer Harnwegsinfektion bei Mäusen und die anschließende longitudinale In-vivo-Analyse der Bakterienbelastung mittels Biolumineszenzbildgebung.

Longitudinale Nachsorge von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenz-Bildgebung

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

Die Aufzählung der koloniebildenden Einheiten schränkte die Reproduzierbarkeit der Forschung im Bereich der Harnwegsinfektion ein. Die Biolumineszenz-Bildgebung wird die In-vivo-UTI-Forschung zur Blasenphysiologie, Harnwegsinfektionspathogenese und Suszeptibilität vorantreiben. Die Biolumineszenz-Bildgebung ermöglicht eine longitudinale Nachsorge mit Echtzeit-Einblick in die Entwicklung der Infektion.Darüber hinaus reduziert es drastisch die Anzahl der benötigten Tiere. Die Biolumineszenz-Bildgebung erleichtert die Erforschung wiederkehrender oder chronischer Infektionen, die beim Menschen häufig auftreten. Darüber hinaus können Forscher aufsteigende Infektionen oder die Verbreitung im Blut mithilfe der Biolumineszenzbildgebung identifizieren.Erhalten Sie einzelne Kolonien, indem Sie den Glycerinbestand von Bakterien mit einer Impfschleife auf LB-Platten, die mit Kanamycinsulfat ergänzt werden, ausstreifen und über Nacht bei 37 Grad Celsius kultivieren. Füllen Sie ein steriles rundes 14-Milliliter-Polystyrol-Bodenrohr mit zweistufigen Schnappkappen mit fünf Millilitern LB-Brühe, ergänzt mit Kanamycinsulfat. Wählen Sie eine einzelne Bakterienkolonie mit einer Impfschleife und fügen Sie diese der LB-Brühe hinzu.Wirbel für 10 Sekunden, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Kultur statisch mit dem Schnappverschluss in geöffneter Position bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach der Inkubation das Röhrchen 10 Sekunden lang verwirbeln, um eine ordnungsgemäße Homogenisierung der Bakterienkultur zu gewährleisten.Machen Sie eine Subkultur im Erlenmeyer, indem Sie 25 Mikroliter der Bakteriensuspension zu 25 Millilitern frischem LB-Medium ohne Antibiotika hinzufügen. Schließen Sie den Erlenmeyer und die Kultur über Nacht statisch. Am Tag der Installation gießen Sie die Kultur aus dem Erlennmeyer in ein 50-Milliliter-Kulturrohr und zentrifugieren.Dekantieren Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Bakterienpellet in 10 Milliliter sterilem PBS. Wirbeln Sie die Röhre erneut für 10 Sekunden. Wählen Sie die experimentelle Konzentration des Inokulums und bestimmen Sie die entsprechende OD bei 600 Nanometern unter Verwendung der Standardkurve.Einen Milliliter der resuspendierten Bakterienkultur in neun Milliliter steriles PBS geben und justieren, bis die gewünschten OD 600 Nanometer erreicht sind. Montieren Sie eine sterile 24-Gauge-Angiokatheterspitze auf einer 100-Mikroliter-Spritze. Füllen Sie die Spritze mit der vorbereiteten Bakterienlösung.Legen Sie ein Tier auf eine Arbeitsfläche in Rückenlage und halten Sie während der Installation eine stabile Isofluran-Anästhesie mit einem Nasenkonus aufrecht. Tragen Sie die Augensalbe auf. Vertreiben Sie den Resturin durch sanfte Kompression und kreisförmige Bewegungen auf der suprapubischen Region, reinigen Sie dann den Unterbauch mit 70% Ethanol.Schmieren Sie die Katheterspitze mit normaler Kochsalzlösung. Legen Sie den Zeigefinger auf die nicht dominante Hand auf den Bauch und drücken Sie ihn sanft nach oben. Beginnen Sie die Katheterisierung der Harnröhre vertikal in einem 90-Grad-Winkel.Sobald ein Widerstand auftritt, neigen Sie ihn horizontal, bevor Sie ihn weiter einsetzen. Führen Sie eine langsame Installation von 50 Mikrolitern des bakteriellen Inokulums durch. Halten Sie nach der Installation die Spritze und den Katheter noch einige Sekunden an Ort und Stelle und ziehen Sie sie dann langsam zurück, um ein Auslaufen zu vermeiden.Verwenden Sie einen Katheter pro Versuchsgruppe. Positionieren Sie das Tier in Rückenlage im Nasenkegel, um es für die Bildgebung vorzubereiten, und bereiten Sie es mit einem Katheter pro Versuchsgruppe für die Bildgebung vor. Falls erforderlich, verabreichen Sie Antibiotika oder experimentelle Medikamente, wie im Textmanuskript erwähnt.Öffnen Sie die BLI-Erfassungssoftware und klicken Sie im Bildgerät auf Initialisieren, um das Kamera- und Stage-Controller-System zu testen und die ladungsgekoppelte Gerätekamera auf minus 90 Grad Celsius abzukühlen. Klicken Sie auf Aufnahme, AutoSpeichern an.Wählen Sie Lumineszenz und Foto. Überprüfen Sie die Standard-Lumineszenzeinstellungen, indem Sie den Anregungsfilter auf Block und den Emissionsfilter auf Offen einstellen.Stellen Sie die Belichtungszeit bei der Aufnahme des ersten Bildes auf auto. Für In-vivo-Messungen und helle Signale stellen Sie die Belichtungszeit auf etwa 30 Sekunden ein. Reduzieren Sie die Belichtungszeit, wenn aufgrund eines gesättigten Bildes eine Warnung angezeigt wird.Wählen Sie das Medium Binning, F / Stop one, und wählen Sie das richtige FOV. Stellen Sie die Motivhöhe bei der Bildgebung von Mäusen auf einen Zentimeter ein. Stellen Sie sich bis zu fünf Meilen gleichzeitig vor und trennen Sie die Tiere mithilfe der Lichtleitwand, um Reflexionen zu verhindern.Schließen Sie die Tür und klicken Sie auf Erfassen, um die Bildgebungssequenz zu starten, und geben Sie dann detaillierte Informationen über das Experiment ein. Entfernen Sie Mäuse aus der Bildgebungskammer und bringen Sie sie in ihren Käfig zurück. Überprüfen Sie die vollständige Genesung nach der Anästhesie und bringen Sie die Käfige bis zum nächsten Bildgebungszyklus in die belüfteten Racks zurück.Starten Sie die Imaging-Software und laden Sie die experimentelle Datei, indem Sie auf Durchsuchen klicken. Verwenden Sie die Werkzeugpalette, um die Farbskala des Bildes anzupassen. Verwenden Sie die ROI-Tools, um eine Region von Interesse auf das Bild zu zeichnen, um sicherzustellen, dass es groß genug ist, um den gesamten Bereich abzudecken und die gleichen Abmessungen für alle Bilder zu verwenden.Klicken Sie dann auf ROI-Messung, um die Lichtintensität zu quantifizieren. Nachfolgende Bilder von Mäusen, die unmittelbar nach der Installation aufgenommen wurden, zeigten, dass sie über 20.000 koloniebildende Einheiten robust nachweisbar waren, und es wurde eine lineare Korrelation zwischen den koloniebildenden Einheiten des Inokulums und der Biolumineszenz in vivo festgestellt. Die natürliche Entwicklung einer Harnwegsinfektion wurde in einer Kontrollgruppe untersucht, die keine Behandlung erhielt.Die Wirkung einer Antibiotikabehandlung auf die Infektionskinetik wurde in einer Gruppe von mit Antibiotika behandelten Tieren detailliert visualisiert. Eine sofortige Abnahme der Bakterienlast, gemessen am Gesamtphotonenfluss, wurde nach der ersten Dosis von Enrofloxacin beobachtet. Keines der behandelten Tiere wies einen nachfolgenden Anstieg der Keimbelastung auf.Die Gesamtbakterienbelastung jedes Tieres wurde anhand der Fläche unter der Kurve des logarithmisch transformierten Gesamtphotonenflusses berechnet, was einen signifikanten Unterschied zwischen tieren, die mit Enrofloxacin behandelt wurden, und unbehandelten Tieren im Laufe von 10 Tagen zeigte. Diese Ergebnisse liefern den Beweis für das Konzept, dass BLI verwendet werden kann, um Unterschiede in der Kinetik von Harnwegsinfektionen zu bewerten. Die Biolumineszenzbildgebung ist eine nichtinvasive Technik, die mit anderen Methoden wie der regelmäßigen Entnahme von Harnproben für die bakterielle oder biochemische Analyse oder für die Experimente kombiniert werden kann.Hier haben wir gezeigt, dass die Biolumineszenz-Bildgebung ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um neuartige therapeutische Strategien zum Krankheitsverlauf von Harnwegsinfektionen zu bewerten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Transurethrale Induktion von Maus Harnwegsinfekt

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Biolumineszenz Imaging von NADPH-Oxidase-Aktivität in verschiedenen Tiermodellen

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Imaging von Multimodalität<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektionen bei Mäusen

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinausscheidende Fläche Infektion in eine kleine Tiermodell: transurethrale Katheterisierung von männlichen und weiblichen Mäusen

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In - vivo - Untersuchung von Antimicrobial Blau Lichttherapie für Multiresistente Acinetobacter baumannii Brennen Infektionen Biolumineszenz - Bildgebung

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Eine multimodale Bildgebung Ansatz basierend auf Mikro-CT und Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für längs-Bewertung der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose bei Mäusen

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolierung der einzelnen intrazelluläre bakterielle Gemeinschaften erzeugt aus einem Mausmodell der urinausscheidende Fläche Infektion nachgelagerten Einzeller Analysezwecken

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...