Name: longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging
Uploaded: 2021-06-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione per la ricerca - Fiandre (FWO Vlaanderen; G0A6113N), il Consiglio di ricerca di KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. e W.E.) e il VIB (a T.V.). W.E. è un ricercatore clinico senior della Fondazione di ricerca - Fiandre (FWO Vlaanderen). Il ceppo UTI89-lux è stato un generoso dono del laboratorio del Prof. Seed13.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida del Consiglio della Comunità europea dell'Unione europea e sono stati approvati dal Comitato etico animale di KU Leuven (P158/2018).
1. Batteri di coltura (adattati da7,13,14)
<ol><li>Preparazione<ol>
<li>Scegli un ceppo UPEC luminescente che meglio si adatta alle esigenze sperimentali. NOTA: Qui, l'isolato...

<ol>
	<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+urinary+tract+infections:+incidence,+morbidity,+and+economic+costs.">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).</li><li>O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+vaccine+development+for+the+treatment+and+prevention+of+urinary+tract+infections.">Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections.</a> Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).</li><li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection.">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).</li><li>Carey, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+of+mice+to+model+human+disease:+Practicalities,+implications+and+limitations.">Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations.</a> Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).</li><li>Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+model+systems+for+the+study+of+urinary+tract+infections+and+related+pathologies.">Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).</li><li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+indicators+in+living+mammals.">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+monitoring+of+infectious+diseases+in+living+animals+using+bioluminescence+imaging.">In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging.</a> Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).</li><li>Balsara, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+susceptibility+to+urinary+tract+infection+in+the+spinal+cord-injured+host+with+neurogenic+bladder.">Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).</li><li>Huang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy+mediated+by+methylene+blue+and+potassium+iodide+to+treat+urinary+tract+infection+in+a+female+rat+model.">Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).</li><li>Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+persistent+Escherichia+coli+reservoir+during+the+acute+phase+of+a+bladder+infection.">Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection.</a> Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).</li><li>Hannan, T. J., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+E.+coli+urinary+tract+infection.">A murine model for E. coli urinary tract infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).</li><li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains.">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Nonsteroidal+Anti-inflammatory+Drugs+for+Treatment+of+Uncomplicated+Lower+Urinary+Tract+Infections+in+Women:+A+Meta-analysis.">Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis.</a> Infectious Microbes &amp; Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+bioluminescence+imaging+of+fungal+dissemination+to+the+brain+in+mouse+models+of+cryptococcosis.">Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).</li><li>Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+looking+beyond+the+light.">Bioluminescence imaging: looking beyond the light.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).</li><li>Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancy+between+viable+counts+and+light+output+as+viability+measurements,+following+ciprofloxacin+challenge+of+self-bioluminescent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).</li><li>Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+increases+in+vivo+screening+efficiency+for+antifungal+activity+against+device-associated+Candida+albicans+biofilms.">Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilm+development+on+medically-relevant+foreign+bodies+in+a+mouse+subcutaneous+model+followed+by+bioluminescence+imaging.">Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).</li><li>Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+non-invasive+monitoring+of+pathogen-host+interactions+during+Candida+albicans+biofilm+formation+using+in+vivo+bioluminescence.">Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence.</a> Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).</li></ol>

Vantaggi di BLI rispetto ai conteggi CFU Dati longitudinali Uno dei principali svantaggi del metodo tradizionale di conteggio dei CFU per quantificare il carico microbico è il requisito degli omogeneizzati d'organo post-mortem, fornendo un solo punto di dati trasversale per animale. Al contrario, BLI consente un follow-up longitudinale non invasivo degli animali infetti. Gli animali possono essere ripresi 2 o 3 volte al giorno, fornendo informazioni dettagliate sulla cinetica dell'infezio...

Le infezioni del tratto urinario (UTI) sono tra le infezioni batteriche più comuni negli esseri umani. Quasi la metà di tutte le donne sperimenterà una UTI sintomatica durante la loro vita1. Le infezioni limitate alla vescica possono dare origine a sintomi urinari come aumento della frequenza urinaria, urgenza, ematuria, incontinenza e dolore. Quando l'infezione sale al tratto urinario superiore, i pazienti sviluppano pielonefrite, con malessere, febbre, brividi e mal di schiena. Inoltre, fino al 20% dei pazienti con UTI soffre di infezioni ricorrenti con conseguente drastica diminuzione della sensibilità agli antibiotici2,3,4. Negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse per le nuove terapie per il trattamento e la prevenzione delle infezioni cardiache regressive. Nonostante una migliore comprensione dell'immunità innata e adattativa del tratto urinario inferiore e dei fattori di virulenza batterica necessari per l'invasione e la colonizzazione, nessun cambiamento radicale nel regime di trattamento è stato tradotto nella pratica urologica quotidiana2. Per studiare la patogenesi e la suscettibilità delle UTI in vivo,è indispensabile un test riproducibile e non invasivo.
Sono stati descritti più modelli di UTI animali che vanno dai nematodi ai primati, ma il modello murino è prevalentemente utilizzato5,6. Questo modello consiste nella cateterizzazione transuretrale di topi (femmina) e nella successiva instillazione di una sospensione batterica, più comunemente Escherichia coli uropatogena (UPEC), direttamente nel lume della vescica7. Dopo l'inoculazione, la carica batterica è stata tradizionalmente quantificata determinando le unità formanti colonie (CFU). Questa tecnica richiede il sacrificio di animali per ottenere omogeneizzati di organi post-mortem e diluizioni seriali, limitando l'output e la riproducibilità dei dati. Inoltre, il follow-up longitudinale della carica batterica nei singoli animali non è possibile utilizzando questa tecnica.
Nel 1995, Contag etal. hanno suggerito l'uso di agenti patogeni bioluminescenti per monitorare i processi patologici negli animali viventi8,9. Da allora, l'imaging a bioluminescenza (BLI) è stato applicato a numerosi modelli di infezione come meningite, endocardite, osteomielite, infezioni della pelle e dei tessuti molli, ecc.10,11,12. Nel modello murino UTI, un ceppo UPEC con l'operone lux completo (luxCDABE) di Photorhabdus luminescens può essere utilizzato13. Una reazione enzimatica è catalizzata dalla luciferasi batterica che dipende dall'ossidazione delle aldeidi a catena lunga che reagiscono con un ridotto mononucleotide flavina in presenza di ossigeno, producendo la flavina ossidata, un acido grasso a catena lunga e leggero12. L'operone lux codifica per la luciferasi e altri enzimi necessari per la sintesi dei substrati. Pertanto, tutti i batteri metabolicamente attivi emetteranno continuamente luce verde blu (490 nm) senza la necessità di iniezione di un substrato esogeno12. I fotoni emessi da batteri con tag luxpossono essere catturati utilizzando telecamere CCD (Charge-Coupled Device) altamente sensibili e raffreddate.
L'uso di batteri bioluminescenti in un modello per UTI consente la quantificazione longitudinale e non invasiva della carica batterica, omettendo la necessità di sacrificare animali in punti temporali fissi durante il follow-up per la determinazione del CFU. Nonostante l'ampia gamma di possibilità, accumulando prove per la robustezza di questa tecnica BLI in altri campi e i suoi vantaggi rispetto ai modelli classici di UTI, non è stata ampiamente implementata nella ricerca UTI. Il protocollo qui presentato fornisce una guida dettagliata passo-passo ed evidenzia i vantaggi di BLI per tutte le future UTI ricerche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3925</td>
			<td>for in vitro imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap ISIS</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>hair trimmer, with GT608 cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer</td>
			<td>Harvard apparatus limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 100 mg/mL</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte Autoguard 24 GA</td>
			<td>BD</td>
			<td>382912</td>
			<td>Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6J mice</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropsense 16</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>Trinean</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Gibco</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>REF 14040-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% denaturated 5L</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>85825360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50ml cellstart</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 &#181;L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26203</td>
			<td>to ensure slow bacterial instillation of 50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6174.1</td>
			<td>holder: Art. No. 6189.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-Vet 1000mg/g</td>
			<td>Dechra Veterinary products</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>REF 124262</td>
			<td>imaging device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine solution 50 mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BLI acquisition software, version 4.7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L3022</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth with agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L2897</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish Sterilin 90mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>to fill with LB agar supplemented with Km</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Culture flask 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLW1141/08-20EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide 200 Trinean</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>701-2007</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTI89-lux</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generous gift from Prof. Seed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>444-1372</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging

Le infezioni del tratto urinario (UTI) sono tra le infezioni batteriche più comuni negli esseri umani e sono trattate di routine con antibiotici empirici. Tuttavia, a causa dell'aumento della resistenza microbica, l'efficacia degli antibiotici più utilizzati è diminuita. Per trovare opzioni di trattamento alternative, c'è un grande bisogno di una migliore comprensione della patogenesi UTI e dei meccanismi che determinano la suscettibilità UTI. Per indagare su questo in un modello animale, è indispensabile un test riproducibile e non invasivo per studiare il corso dell'UTI.
Per anni, il gold standard per l'enumerazione della carica batterica è stata la determinazione delle unità formanti colonie (CFU) per un particolare volume di campione. Questa tecnica richiede omogeneizzati d'organo post-mortem e diluizioni seriali, limitando l'output e la riproducibilità dei dati. In alternativa, l'imaging a bioluminescenza (BLI) sta guadagnando popolarità per determinare la carica batterica. L'etichettatura dei patogeni con un operone lux consente il rilevamento e la quantificazione sensibili in modo non invasivo, consentendo così un follow-up longitudinale. Finora, l'adozione di BLI nella ricerca UTI rimane limitata.
Questo manoscritto descrive l'implementazione pratica di BLI in un modello di infezione del tratto urinario di topo. Qui viene fornita una guida passo-passo per la coltura di batteri, l'instillazione intravescicale e l'imaging. Viene esaminata la correlazione in vivo con i CFU e viene fornita una prova di concetto confrontando la carica batterica degli animali infetti non trattati con gli animali trattati con antibiotici. Inoltre, vengono discussi i vantaggi, i limiti e le considerazioni specifiche per l'implementazione di BLI in un modello UTI in vivo. L'implementazione di BLI nel campo della ricerca UTI faciliterà notevolmente la ricerca sulla patogenesi delle UTI e la scoperta di nuovi modi per prevenire e curare le UTI.

In vivo BLI correla con CFU dell'inoculo al momento dell'instillazione. Per valutare il limite di rilevazione di BLI in vivo e la correlazione con CFU dell'inoculo, i topi sono stati infettati con diverse concentrazioni di UTI89-lux e PBS come controllo negativo. Prima dell'instillazione, gli animali non infetti sono stati scansionati per determinare la luminescenza di fondo. Le immagini successive sono state ottenute immediatamente dopo l'instillazione (<s...

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Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

Questo manoscritto descrive la somministrazione intravescicale di batteri uropatogeni con un operone lux per indurre un'infezione del tratto urinario nei topi e la successiva analisi longitudinale in vivo della carica batterica utilizzando l'imaging a bioluminescenza.

Follow-up longitudinale delle infezioni del tratto urinario e loro trattamento nei topi utilizzando l'imaging a bioluminescenza

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

L'enumerazione delle unità formanti colonie limitava la riproducibilità della ricerca nel campo delle UTI. L'imaging a bioluminescenza farà progredire la ricerca UTI in vivo sulla fisiologia della vescica, la patogenesi e la suscettibilità dell'UTI. L'imaging a bioluminescenza consente il follow-up longitudinale con informazioni in tempo reale sull'evoluzione dell'infezione.Inoltre, riduce drasticamente il numero di animali necessari. L'imaging a bioluminescenza facilita la ricerca sulle infezioni ricorrenti o croniche, che sono frequenti negli esseri umani. Inoltre, i ricercatori possono identificare infezioni ascendenti o diffusione al sangue utilizzando l'imaging a bioluminescenza.Ottieni singole colonie strisciando lo stock di glicerolo di batteri con un ciclo di inoculazione su piastre LB integrate con kanamicina solfato e coltivando durante la notte a 37 gradi Celsius. Riempire un tubo di fondo rotondo sterile in polistirene da 14 millilitri, con tappi a scatto a doppia posizione con cinque millilitri di brodo LB integrati con kanamicina solfato. Scegli una singola colonia batterica con un ciclo di inoculazione e aggiungilo al brodo LB.Vortice per 10 secondi per garantire una corretta miscelazione. Coltura statica con il tappo a scatto in posizione aperta a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione, ruotare il tubo per 10 secondi per garantire una corretta omogeneizzazione della coltura batterica.Fai una sottocoltura nell'Erlenmeyer aggiungendo 25 microlitri della sospensione batterica a 25 millilitri di terreno LB fresco senza antibiotici. Chiudere l'Erlenmeyer e la cultura staticamente durante la notte. Il giorno dell'installazione, versare la coltura dell'Erlennmeyer in un tubo di coltura da 50 millilitri e centrifugare.Decantare il surnatante e risospese il pellet batterico in 10 millilitri di PBS sterile. Vortice di nuovo il tubo per 10 secondi. Scegli la concentrazione sperimentale dell'inoculo e determina l'OD corrispondente a 600 nanometri usando la curva standard.Aggiungere un millilitro della coltura batterica risospesa in nove millilitri di PBS sterile e regolare fino a raggiungere l'OD 600 nanometro desiderato. Montare una punta angiocatetere sterile calibro 24 su una siringa da 100 microlitri. Riempire la siringa con la soluzione batterica preparata.Posizionare un animale su una superficie di lavoro in posizione supina e mantenere un'anestesia isoflurano stabile utilizzando un cono nasale durante l'installazione. Applicare l'unguento per gli occhi. Espellere l'urina residua applicando una leggera compressione e facendo movimenti circolari sulla regione sovrapubica, quindi pulire l'addome inferiore con il 70% di etanolo.Lubrificare la punta del catetere con soluzione salina normale. Metti l'indice sulla mano non dominante sull'addome e spingilo delicatamente verso l'alto. Avviare il cateterismo dell'uretra verticalmente in un angolo di 90 gradi.Una volta incontrata la resistenza, inclinarla orizzontalmente prima di inserirla ulteriormente. Eseguire un'installazione lenta di 50 microlitri dell'inoculo batterico. Dopo l'installazione, tenere la siringa e il catetere in posizione per qualche altro secondo e poi ritrarsi lentamente per evitare perdite.Utilizzare un catetere per gruppo sperimentale. Posizionare l'animale in posizione supina nel cono del naso per prepararlo per l'imaging e prepararlo per l'imaging utilizzando un catetere per gruppo sperimentale. Se necessario, somministrare antibiotici o farmaci sperimentali, come menzionato nel manoscritto del testo.Aprire il software di acquisizione BLI e fare clic su Inizializza nel dispositivo di imaging per testare la fotocamera e il sistema di controllo dello stage e per raffreddare la fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica a meno 90 gradi Celsius. Fare clic su Acquisizione, Salvataggio automatico a.Seleziona Luminescenza e Fotografia. Controllare le impostazioni luminescenti predefinite impostando il filtro di eccitazione su Blocca e il filtro di emissione su Apri.Imposta il tempo di esposizione su auto quando scatti la prima immagine. Per le misurazioni in vivo e i segnali luminosi, impostare il tempo di esposizione a circa 30 secondi. Ridurre il tempo di esposizione se viene visualizzato un avviso a causa di un'immagine satura.Selezionare il binning medio, F/stop one, e scegliere il FOV corretto. Impostare l'altezza del soggetto su un centimetro durante l'imaging dei topi. Immagina fino a cinque miglia contemporaneamente e separa gli animali usando il deflettore di luce per impedire la riflessione.Chiudi la porta e fai clic su Acquisisci per avviare la sequenza di imaging, quindi inserisci informazioni dettagliate sull'esperimento. Rimuovere i topi dalla camera di imaging e riportarli nella loro gabbia. Verificare il recupero completo dopo l'anestesia, quindi restituire le gabbie ai rack ventilati fino al successivo ciclo di imaging.Avviare il software di imaging e caricare il file sperimentale facendo clic su Sfoglia. Utilizzare la tavolozza degli strumenti per regolare la scala dei colori dell'immagine. Utilizza gli strumenti ROI per disegnare una regione di interesse sull'immagine, assicurandoti che sia abbastanza grande da coprire l'area completa e utilizzando le stesse dimensioni per tutte le immagini.Quindi fare clic su Misurazione del ROI per quantificare l'intensità della luce. Le successive immagini di topi ottenute immediatamente dopo l'installazione hanno mostrato che era robustamente rilevabile sopra le 20.000 unità formanti colonie, ed è stata stabilita una correlazione lineare tra le unità formanti colonie dell'inoculo e la bioluminescenza in vivo. La naturale evoluzione di un'infezione del tratto urinario è stata studiata in un gruppo di controllo che non ha ricevuto alcun trattamento.L'effetto del trattamento antibiotico sulla cinetica dell'infezione è stato visualizzato in dettaglio in un gruppo di animali trattati con antibiotici. Una diminuzione immediata della carica batterica, misurata dal flusso totale di fotoni, è stata osservata dopo la prima dose di enrofloxacina. Nessuno degli animali trattati ha avuto un successivo aumento della carica batterica.La carica batterica complessiva di ciascun animale è stata calcolata utilizzando l'area sotto la curva del flusso totale di fotoni trasformato nel log, mostrando una differenza significativa tra gli animali trattati con enrofloxacina e gli animali non trattati nel corso di 10 giorni. Questi risultati forniscono la prova del concetto che BLI può essere utilizzato per valutare le differenze nella cinetica dell'infezione UTI. L'imaging a bioluminescenza è una tecnica non invasiva che può essere combinata con altri metodi come la raccolta regolare di campioni urinari per l'analisi batterica o biochimica o per gli esperimenti.Qui abbiamo dimostrato che l'imaging a bioluminescenza è un potente strumento per valutare nuove strategie terapeutiche sul decorso della malattia delle infezioni del tratto urinario.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Ricerca

Immunologia e infezioni

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