Name: longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging
Uploaded: 2021-06-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Forskningsstiftelsen - Flandern (FWO Vlaanderen; G0A6113N), Forskningsrådet for KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. og W.E.) og VIB (til T.V.). W.E. er senior klinisk forsker ved Forskningsstiftelsen - Flandern (FWO Vlaanderen). Belastningen UTI89-lux var en sjenerøs gave fra Prof. Seeds laboratorium13.

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med EUs fellesskapsråds retningslinjer og ble godkjent av Animal Ethics Committee of KU Leuven (P158/2018).
1. Culturing bakterier (tilpasset fra7,13,14)
<ol><li>Forberedelse<ol>
<li>Velg en lysende UPEC-stamme som passer best til de eksperimentelle behovene. MERK: Her ble den kliniske blærebetennelsen isolert, UTI89 (E. coli), ble valgt på grunn...

<ol>
	<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+urinary+tract+infections:+incidence,+morbidity,+and+economic+costs.">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).</li><li>O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+vaccine+development+for+the+treatment+and+prevention+of+urinary+tract+infections.">Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections.</a> Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).</li><li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection.">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).</li><li>Carey, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+of+mice+to+model+human+disease:+Practicalities,+implications+and+limitations.">Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations.</a> Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).</li><li>Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+model+systems+for+the+study+of+urinary+tract+infections+and+related+pathologies.">Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).</li><li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+indicators+in+living+mammals.">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+monitoring+of+infectious+diseases+in+living+animals+using+bioluminescence+imaging.">In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging.</a> Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).</li><li>Balsara, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+susceptibility+to+urinary+tract+infection+in+the+spinal+cord-injured+host+with+neurogenic+bladder.">Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).</li><li>Huang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy+mediated+by+methylene+blue+and+potassium+iodide+to+treat+urinary+tract+infection+in+a+female+rat+model.">Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).</li><li>Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+persistent+Escherichia+coli+reservoir+during+the+acute+phase+of+a+bladder+infection.">Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection.</a> Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).</li><li>Hannan, T. J., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+E.+coli+urinary+tract+infection.">A murine model for E. coli urinary tract infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).</li><li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains.">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Nonsteroidal+Anti-inflammatory+Drugs+for+Treatment+of+Uncomplicated+Lower+Urinary+Tract+Infections+in+Women:+A+Meta-analysis.">Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis.</a> Infectious Microbes &amp; Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+bioluminescence+imaging+of+fungal+dissemination+to+the+brain+in+mouse+models+of+cryptococcosis.">Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).</li><li>Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+looking+beyond+the+light.">Bioluminescence imaging: looking beyond the light.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).</li><li>Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancy+between+viable+counts+and+light+output+as+viability+measurements,+following+ciprofloxacin+challenge+of+self-bioluminescent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).</li><li>Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+increases+in+vivo+screening+efficiency+for+antifungal+activity+against+device-associated+Candida+albicans+biofilms.">Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilm+development+on+medically-relevant+foreign+bodies+in+a+mouse+subcutaneous+model+followed+by+bioluminescence+imaging.">Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).</li><li>Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+non-invasive+monitoring+of+pathogen-host+interactions+during+Candida+albicans+biofilm+formation+using+in+vivo+bioluminescence.">Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence.</a> Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).</li></ol>

Fordeler med BLI sammenlignet med CFU teller Langsgående data En stor ulempe ved den tradisjonelle metoden for å telle CFU for å kvantifisere mikrobiell byrde er kravet om organhomogenater etter mortem, og gir bare ett tverrsnittsdatapunkt per dyr. På den annen side muliggjør BLI ikke-invasiv langsgående oppfølging av infiserte dyr. Dyrene kan avbildes 2 til 3 ganger om dagen, og gir detaljert innsikt i infeksjonens kinetikk. I tillegg reduserer gjentatte tiltak av samme dyr drastis...

Urinveisinfeksjoner (UVI) er blant de vanligste bakterielle infeksjonene hos mennesker. Nesten halvparten av alle kvinner vil oppleve en symptomatisk UVI i løpet av livet1. Infeksjoner begrenset til blæren kan gi opphav til urinsymptomer som økning i urinfrekvens, haster, hematuri, inkontinens og smerte. Når infeksjonen stiger opp til øvre urinveier, utvikler pasienter pyelonefritt, med ubehag, feber, frysninger og ryggsmerter. Videre lider opptil 20% av pasientene med UVI av tilbakevendende infeksjoner, noe som resulterer i en dramatisk reduksjon i antibiotikafølsomhet2,3,4. De siste årene har det vært en økende interesse for nye terapier for behandling og forebygging av tilbakevendende UVI. Til tross for en bedre forståelse av den medfødte og adaptive immuniteten i nedre urinveier og av bakterielle virulensfaktorer som er nødvendige for invasjon og kolonisering, har ingen radikale endringer i behandlingsregimet blitt oversatt til den daglige urologiske praksisen2. For å studere UVI patogenese og følsomhet i vivo, er en reproduserbar og ikke-invasiv analyse uunnværlig.
Flere dyr UTI-modeller har blitt beskrevet som spenner fra nematoder til primater, men murinmodellen brukes hovedsakelig5,6. Denne modellen består av transuretral kateterisering av (kvinnelige) mus og etterfølgende instillasjon av en bakteriell suspensjon, oftest uropathogenic Escherichia coli (UPEC), direkte inn i blærelummen7. Etter inokulering har bakteriebelastningen tradisjonelt blitt kvantifisert ved å bestemme kolonidannende enheter (CFU). Denne teknikken krever ofre dyr for å oppnå post-mortem organ homogenater og serielle fortynninger, begrense datautgang og reproduserbarhet. Videre er langsgående oppfølging av bakteriebelastningen hos enkelte dyr ikke mulig ved hjelp av denne teknikken.
I 1995 foreslo Contag et al. bruk av bioluminescent-taggede patogener for å overvåke sykdomsprosesser hos levende dyr8,9. Siden da har bioluminescensavbildning (BLI) blitt brukt på mange infeksjonsmodeller som meningitt, endokarditt, osteomyelitt, hud og bløtvevsinfeksjoner, etc.10,11,12. I murin UTI-modellen kan en UPEC-stamme med hele lux operon (luxCDABE) fra Photorhabdus luminescens brukes13. En enzymatisk reaksjon er katalysert av bakteriell luciferase som er avhengig av oksidasjon av langkjedede aldehyder som reagerer med redusert flavinmononukleotid i nærvær av oksygen, noe som gir den oksiderte flavin, en langkjedet fettsyre og lys12. Lux operonkoder for luciferase og andre enzymer som kreves for syntesen av substratene. Derfor vil alle metabolsk aktive bakterier kontinuerlig avgi blått grønt (490 nm) lys uten behov for injeksjon av et eksogent substrat12. Fotoner som slippes ut av lux-taggedebakterier kan fanges opp ved hjelp av svært følsomme, avkjølte ladekoblede enhetskameraer (CCD).
Bruk av bioluminescerende bakterier i en modell for UVI muliggjør langsgående, ikke-invasiv kvantifisering av bakteriebelastningen, og utelater behovet for å ofre dyr på faste tidspunkter under oppfølgingen av CFU-bestemmelse. Til tross for det brede spekteret av muligheter, akkumulere bevis for robustheten av denne BLI-teknikken på andre felt og dens fordeler i forhold til klassiske modeller av UVI, har den ikke blitt implementert i UTI-forskningen. Protokollen som presenteres her gir en detaljert trinnvis guide og fremhever fordelene med BLI for all fremtidig UVI-forskning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3925</td>
			<td>for in vitro imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap ISIS</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>hair trimmer, with GT608 cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer</td>
			<td>Harvard apparatus limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 100 mg/mL</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte Autoguard 24 GA</td>
			<td>BD</td>
			<td>382912</td>
			<td>Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6J mice</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropsense 16</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>Trinean</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Gibco</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>REF 14040-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% denaturated 5L</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>85825360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50ml cellstart</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 &#181;L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26203</td>
			<td>to ensure slow bacterial instillation of 50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6174.1</td>
			<td>holder: Art. No. 6189.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-Vet 1000mg/g</td>
			<td>Dechra Veterinary products</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>REF 124262</td>
			<td>imaging device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine solution 50 mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BLI acquisition software, version 4.7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L3022</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth with agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L2897</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish Sterilin 90mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>to fill with LB agar supplemented with Km</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Culture flask 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLW1141/08-20EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide 200 Trinean</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>701-2007</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTI89-lux</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generous gift from Prof. Seed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>444-1372</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging

Urinveisinfeksjoner (UVI) rangerer blant de vanligste bakterielle infeksjonene hos mennesker og behandles rutinemessig med empiriske antibiotika. På grunn av økende mikrobiell resistens har effekten av de mest brukte antibiotika imidlertid gått ned. For å finne alternative behandlingsalternativer er det et stort behov for en bedre forståelse av UVI-patogenesen og mekanismene som bestemmer UVI-følsomhet. For å undersøke dette i en dyremodell er en reproduserbar, ikke-invasiv analyse for å studere UTI-kurset uunnværlig.
I årevis har gullstandarden for opplisting av bakteriebelastning vært bestemmelse av Kolonidannende enheter (CFU) for et bestemt prøvevolum. Denne teknikken krever organhomogenater og serielle fortynninger etter mortem, noe som begrenser datautgang og reproduserbarhet. Som et alternativ blir bioluminescensavbildning (BLI) stadig mer populært for å bestemme bakteriebelastningen. Merking av patogener med lux operon tillater sensitiv deteksjon og kvantifisering på en ikke-invasiv måte, og muliggjør dermed langsgående oppfølging. Så langt er adopsjonen av BLI i UVI-forskning fortsatt begrenset.
Dette manuskriptet beskriver den praktiske implementeringen av BLI i en muse urinveisinfeksjonsmodell. Her gis en trinnvis guide for dyrking av bakterier, intravesisk instillasjon og avbildning. In vivo-korrelasjonen med CFU undersøkes og et konseptbevis er gitt ved å sammenligne bakteriebelastningen til ubehandlede infiserte dyr med antibiotikabehandlede dyr. Videre diskuteres fordelene, begrensningene og hensynene som er spesifikke for implementeringen av BLI i en in vivo UTI-modell. Implementeringen av BLI på UTI-forskningsfeltet vil i stor grad legge til rette for forskning på patogenesen av UVI og oppdagelsen av nye måter å forebygge og behandle UVI på.

In vivo BLI korrelerer med CFU av inokulumet ved instillasjonstidspunktet. For å evaluere deteksjonsgrensen for BLI in vivo og korrelasjonen med CFU i inokulumet, ble mus smittet med forskjellige konsentrasjoner av UTI89-lux og PBS som en negativ kontroll. Før instillasjon ble uinferte dyr skannet for å bestemme bakgrunnslystettheten. Etterfølgende bilder ble innhentet umiddelbart etter innånding (Figur 1A). Etter innåndi...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging at JoVE.com

Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

Dette manuskriptet beskriver den intravesiske administrasjonen av uropatogene bakterier med lux operon for å indusere en urinveisinfeksjon hos mus og påfølgende langsgående in vivoanalyse av bakteriebelastningen ved hjelp av bioluminescensavbildning.

Langsgående oppfølging av urinveisinfeksjoner og deres behandling hos mus ved bruk av bioluminescensavbildning

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

Opplistingen av kolonidannende enheter begrenset reproduserbarheten av forskning på UVI-feltet. Bioluminescensavbildning vil fremme in vivo UVI forskning på blærefysiologi, UVI patogenese og følsomhet. Bioluminescensavbildning muliggjør langsgående oppfølging med sanntidsinnsikt i utviklingen av infeksjonen.Videre reduserer det drastisk antall dyr som trengs. Bioluminescensavbildning letter forskning på tilbakevendende eller kroniske infeksjoner, som er hyppige hos mennesker. I tillegg kan forskere identifisere stigende infeksjoner eller spredning til blodet ved hjelp av bioluminescensavbildning.Oppnå enkeltkolonier ved å strekke ut glyserolbestanden av bakterier med en inokulasjonssløyfe på LB-plater supplert med kanamycinsulfat og dyrking over natten ved 37 grader Celsius. Fyll et sterilt 14 milliliter polystyren rundt bunnrør, med toposisjons snap caps med fem milliliter LB kjøttkraft supplert med kanamycinsulfat. Velg en enkelt bakteriell koloni med en inokulasjonssløyfe, og legg dette til LB-buljongen.Virvel i 10 sekunder for å sikre riktig blanding. Kultur statisk med snap cap i åpen posisjon på 37 grader Celsius over natten. Etter inkubasjonen, virvel røret i 10 sekunder for å sikre riktig homogenisering av bakteriekulturen.Lag en subkultur i Erlenmeyer ved å legge til 25 mikroliter av bakteriell suspensjon til 25 milliliter fersk LB-medium uten antibiotika. Lukk Erlenmeyer og kultur statisk over natten. På installasjonsdagen, hell kulturen fra Erlennmeyer inn i et 50 milliliter kulturrør og sentrifuge.Dekanter supernatanten og resuspend bakteriell pellet i 10 milliliter steril PBS. Virvel røret igjen i 10 sekunder. Velg den eksperimentelle konsentrasjonen av inokulumet og bestem tilsvarende OD ved 600 nanometer ved hjelp av standardkurven.Tilsett en milliliter av den gjenbrukte bakteriekulturen i ni milliliter steril PBS og juster til ønsket OD 600 nanometer er nådd. Monter en steril 24-gauge angiokateterspiss på en 100-mikrolitersprøyte. Fyll sprøyten med den tilberedte bakterielle løsningen.Plasser ett dyr på en arbeidsflate i liggende stilling og oppretthold en stabil isofluranbedøvelse ved hjelp av en nesekjegle under installasjonen. Påfør øyesalve. Utvis gjenværende urin ved å bruke skånsom kompresjon og gjøre sirkulære bevegelser på den suprapube regionen, og rengjør deretter underlivet med 70% etanol.Smør kateterspissen med vanlig saltvann. Sett pekefingeren på den ikke-dominerende hånden på magen og skyv den forsiktig oppover. Start kateteriseringen av urinrøret vertikalt i en 90-graders vinkel.Når motstanden er møtt, vipp den horisontalt før du setter den videre inn. Utfør en langsom installasjon av 50 mikroliter av bakteriell inoculum. Etter installasjonen, hold sprøyten og kateteret på plass i noen sekunder til, og trekk deretter sakte tilbake for å forhindre lekkasje.Bruk ett kateter per eksperimentell gruppe. Plasser dyret i en liggende stilling i nesekjeglen for å forberede det til avbildning, og forbered det til avbildning ved hjelp av ett kateter per eksperimentell gruppe. Administrer om nødvendig antibiotika eller eksperimentelle legemidler, som nevnt i tekstmanuskriptet.Åpne BLI-anskaffelsesprogramvaren og klikk på Initialiser i bildeenheten for å teste kameraet og scenekontrollersystemet og for å avkjøle det ladekoblede enhetskameraet til minus 90 grader Celsius. Klikk på Anskaffelse, Lagre automatisk to.Select Luminescence og Fotografi. Kontroller standardinnstillingene for lystetthet ved å sette eksitasjonsfilteret til Blokk- og utslippsfilter til Åpne.Still inn eksponeringstiden automatisk når du tar det første bildet. For in vivo-målinger og lyse signaler, still eksponeringstiden til rundt 30 sekunder. Reduser eksponeringstiden hvis det vises en advarsel på grunn av et mettet bilde.Velg middels binning, F/stopp én, og velg riktig FOV. Sett motivhøyden til en centimeter når du ser på mus. Bilde opptil 8 miles samtidig og skille dyrene ved hjelp av lys baffle for å forhindre refleksjon.Lukk døren og klikk på Hent for å starte bildesekvensen, og fyll deretter ut detaljert informasjon om eksperimentet. Fjern mus fra bildekammeret og returner dem til buret. Se etter full gjenoppretting etter anestesi, og returner deretter burene til de ventilerte stativene til neste bildesyklus.Start bildebehandlingsprogramvaren og last inn den eksperimentelle filen ved å klikke på Bla gjennom. Bruk verktøypaletten til å justere fargeskalaen i bildet. Bruk roi-verktøyene til å tegne en interesseregion på bildet, slik at det er stort nok til å dekke hele området og bruke de samme dimensjonene for alle bildene.Klikk deretter på ROI-måling for å kvantifisere lysintensiteten. Påfølgende bilder av mus oppnådd umiddelbart etter installasjon viste at det var robust påviselig over 20.000 kolonidannende enheter, og en lineær korrelasjon mellom kolonidanneringsenhetene til inokulumet og bioluminescensen i vivo ble etablert. Den naturlige utviklingen av en urinveisinfeksjon ble studert i en kontrollgruppe som ikke fikk noen behandling.Effekten av antibiotikabehandling på infeksjonskinetikken ble visualisert i detalj i en gruppe antibiotikabehandlede dyr. En umiddelbar reduksjon i bakteriebelastning, målt ved total fotonfluks, ble sett etter den første dosen av Enrofloxacin. Ingen av de behandlede dyrene hadde en påfølgende økning i bakteriebelastningen.Den totale bakteriebelastningen til hvert dyr ble beregnet ved hjelp av området under kurven av loggen forvandlet total fotonfluks, og viste en betydelig forskjell mellom dyr behandlet med Enrofloxacin og ubehandlede dyr i løpet av 10 dager. Disse resultatene gir konseptbevis som BLI kan brukes til å evaluere forskjeller i UVI-infeksjonskinetikk. Bioluminescensavbildning er en ikke-invasiv teknikk som kan kombineres med andre metoder som regelmessig innsamling av urinprøver for bakteriell eller biokjemisk analyse eller for forsøkene.Her har vi vist at bioluminescensavbildning er et kraftig verktøy for å evaluere nye terapeutiske strategier på sykdomsforløpet for urinveisinfeksjoner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Bioluminescens Imaging av NADPH oksidase aktivitet i ulike dyremodeller

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodalitet Imaging av<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infeksjoner i Mus

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luftveisinfeksjon i Mus

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Bioluminesens Imaging å oppdage sent stadium smitte av sovesyke

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinveisinfeksjon i en liten dyr modell: Transurethral Catheterization mannlige og kvinnelige mus

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In vivo undersøkelse av antimikrobiell blå lysterapi for multidrug-resistent Acinetobacter baumannii Brenninfeksjoner ved bruk av bioluminescens-bildebehandling

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

En intermodal Imaging tilnærming basert på mikro-CT og fluorescens molekylær tomografi langsgående vurdering av Bleomycin-indusert lunge Fibrosis mus

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolering av enkelt intracellulær bakteriell samfunn generert fra en Murine modell av urinveisinfeksjon for nedstrøms encellede analyse

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...