Name: longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging
Uploaded: 2021-06-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios da Research Foundation - Flanders (FWO Vlaanderen; G0A6113N), o Conselho de Pesquisa de KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. e W.E.) e o VIB (para T.V.). W.E. é um pesquisador clínico sênior da Research Foundation - Flanders (FWO Vlaanderen). A cepaUTI89-lux foi um presente generoso do laboratório13do Prof. Seed.

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Comunitário da União Europeia e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da KU Leuven (P158/2018).
1. Bactérias de cultivo (adaptadas a partir de7,13,14)
<ol><li>Preparação<ol>
<li>Escolha uma cepa UPEC luminescente que melhor se encaixe nas necessidades experimentais. NOTA: Aqui, o isolado da cist...

<ol>
	<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+urinary+tract+infections:+incidence,+morbidity,+and+economic+costs.">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).</li><li>O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+vaccine+development+for+the+treatment+and+prevention+of+urinary+tract+infections.">Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections.</a> Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).</li><li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection.">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).</li><li>Carey, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+of+mice+to+model+human+disease:+Practicalities,+implications+and+limitations.">Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations.</a> Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).</li><li>Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+model+systems+for+the+study+of+urinary+tract+infections+and+related+pathologies.">Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).</li><li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+indicators+in+living+mammals.">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+monitoring+of+infectious+diseases+in+living+animals+using+bioluminescence+imaging.">In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging.</a> Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).</li><li>Balsara, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+susceptibility+to+urinary+tract+infection+in+the+spinal+cord-injured+host+with+neurogenic+bladder.">Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).</li><li>Huang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy+mediated+by+methylene+blue+and+potassium+iodide+to+treat+urinary+tract+infection+in+a+female+rat+model.">Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).</li><li>Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+persistent+Escherichia+coli+reservoir+during+the+acute+phase+of+a+bladder+infection.">Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection.</a> Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).</li><li>Hannan, T. J., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+E.+coli+urinary+tract+infection.">A murine model for E. coli urinary tract infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).</li><li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains.">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Nonsteroidal+Anti-inflammatory+Drugs+for+Treatment+of+Uncomplicated+Lower+Urinary+Tract+Infections+in+Women:+A+Meta-analysis.">Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis.</a> Infectious Microbes &amp; Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+bioluminescence+imaging+of+fungal+dissemination+to+the+brain+in+mouse+models+of+cryptococcosis.">Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).</li><li>Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+looking+beyond+the+light.">Bioluminescence imaging: looking beyond the light.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).</li><li>Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancy+between+viable+counts+and+light+output+as+viability+measurements,+following+ciprofloxacin+challenge+of+self-bioluminescent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).</li><li>Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+increases+in+vivo+screening+efficiency+for+antifungal+activity+against+device-associated+Candida+albicans+biofilms.">Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilm+development+on+medically-relevant+foreign+bodies+in+a+mouse+subcutaneous+model+followed+by+bioluminescence+imaging.">Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).</li><li>Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+non-invasive+monitoring+of+pathogen-host+interactions+during+Candida+albicans+biofilm+formation+using+in+vivo+bioluminescence.">Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence.</a> Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).</li></ol>

Vantagens da BLI em relação às contagens de UFC Dados longitudinais Uma grande desvantagem do método tradicional de contagem da UFC para quantificar a carga microbiana é a exigência de homogeneizações de órgãos post-mortem, fornecendo apenas um ponto de dados transversais por animal. Por outro lado, a BLI permite o acompanhamento longitudinal não invasivo de animais infectados. Os animais podem ser imagens de 2 a 3 vezes por dia, fornecendo uma visão detalhada da cinética da i...

As infecções do trato urinário (ITU) estão entre as infecções bacterianas mais comuns em humanos. Quase metade de todas as mulheres experimentarão uma UTI sintomática durante sua vida1. Infecções limitadas à bexiga podem dar origem a sintomas urinários como aumento da frequência urinária, urgência, hematuria, incontinência e dor. Quando a infecção sobe para o trato urinário superior, os pacientes desenvolvem pyelonephritis, com mal-estar, febre, calafrios e dor nas costas. Além disso, até 20% dos pacientes com UTI sofrem de infecções recorrentes, resultando em uma redução drástica na sensibilidade a antibióticos2,3,4. Nos últimos anos, tem havido um crescente interesse por novas terapias para o tratamento e prevenção da UTI recorrente. Apesar de uma melhor compreensão da imunidade inata e adaptativa do trato urinário inferior e dos fatores de virulência bacteriana necessários para invasão e colonização, nenhuma mudança radical no regime de tratamento foi traduzida para a prática urológica diária2. Para estudar a patogênese e a suscetibilidade da UTI in vivo,é indispensável um ensaio reprodutível e não invasivo.
Vários modelos de UTI animal foram descritos variando de nematoides a primatas, mas o modelo murino é predominantemente usado5,6. Este modelo consiste em cateterismo transuretral de camundongos (femininos) e posterior instilação de suspensão bacteriana, mais comumente uropatogênica Escherichia coli (UPEC), diretamente no lúmen da bexiga7. Após a inoculação, a carga bacteriana tem sido tradicionalmente quantificada por determinação de unidades formadoras de colônias (UFC). Esta técnica requer sacrificar animais para obter homogeneizações de órgãos pós-morte e diluições seriais, limitando a produção de dados e a reprodutibilidade. Além disso, o acompanhamento longitudinal da carga bacteriana em animais individuais não é possível usando essa técnica.
Em 1995, Contag et al. sugeriram o uso de patógenos bioluminescentes marcados para monitorar processos de doenças em animais vivos8,9. Desde então, a bioluminescência (BLI) tem sido aplicada a inúmeros modelos de infecção, como meningite, endocardite, osteomielite, pele e infecções por tecidos moles, etc.10,11,12. No modelo murine UTI, pode ser utilizada uma cepa UPEC com o lux operon completo(luxCDABE)da Photorhabdus luminescens 13. Uma reação enzimática é catalisada pela luciferase bacteriana que depende da oxidação de aldeídos de cadeia longa reagindo com mononucleotídeo de flavin reduzido na presença de oxigênio, produzindo flavin oxidado, um ácido graxo de cadeia longa e luz12. Os códigos lux operon para a luciferase e outras enzimas necessárias para a síntese dos substratos. Portanto, todas as bactérias metabolicamente ativas emitirão luz verde azul (490 nm) sem a necessidade da injeção de um substrato exógeno12. Fótons emitidos por bactérias lux-taggedpodem ser capturados usando câmeras de dispositivo (CCD) altamente sensíveis e resfriadas.
O uso de bactérias bioluminescentes em um modelo para UTI permite a quantificação longitudinal e não invasiva da carga bacteriana, omitindo a necessidade de sacrificar animais em pontos de tempo fixos durante o acompanhamento para determinação da UFC. Apesar da ampla gama de possibilidades, acumulando evidências para a robustez desta técnica BLI em outros campos e suas vantagens sobre modelos clássicos de UTI, ela não foi amplamente implementada na pesquisa da UTI. O protocolo aqui apresentado fornece um guia passo a passo detalhado e destaca as vantagens da BLI para todas as futuras pesquisas da UTI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3925</td>
			<td>for in vitro imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap ISIS</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>hair trimmer, with GT608 cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer</td>
			<td>Harvard apparatus limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 100 mg/mL</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte Autoguard 24 GA</td>
			<td>BD</td>
			<td>382912</td>
			<td>Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6J mice</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropsense 16</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>Trinean</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Gibco</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>REF 14040-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% denaturated 5L</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>85825360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50ml cellstart</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 &#181;L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26203</td>
			<td>to ensure slow bacterial instillation of 50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6174.1</td>
			<td>holder: Art. No. 6189.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-Vet 1000mg/g</td>
			<td>Dechra Veterinary products</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>REF 124262</td>
			<td>imaging device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine solution 50 mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BLI acquisition software, version 4.7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L3022</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth with agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L2897</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish Sterilin 90mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>to fill with LB agar supplemented with Km</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Culture flask 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLW1141/08-20EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide 200 Trinean</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>701-2007</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTI89-lux</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generous gift from Prof. Seed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>444-1372</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging

As infecções do trato urinário (ITU) estão entre as infecções bacterianas mais comuns em humanos e são tratadas rotineiramente com antibióticos empíricos. No entanto, devido ao aumento da resistência microbiana, a eficácia dos antibióticos mais usados diminuiu. Para encontrar opções alternativas de tratamento, há uma grande necessidade de uma melhor compreensão da patogênese DA UTI e dos mecanismos que determinam a suscetibilidade da UTI. Para investigar isso em um modelo animal, é indispensável um ensaio reprodutível e não invasivo para estudar o curso da UTI.
Durante anos, o padrão-ouro para a enumeração da carga bacteriana tem sido a determinação de Unidades de Formação de Colônias (UFC) para um determinado volume amostral. Esta técnica requer homogeneizações de órgãos pós-morte e diluições seriais, limitando a produção de dados e a reprodutibilidade. Como alternativa, a bioluminescência (BLI) está ganhando popularidade para determinar a carga bacteriana. A rotulagem de patógenos com um operon lux permite a detecção e quantificação sensíveis de forma não invasiva, permitindo assim o acompanhamento longitudinal. Até agora, a adoção da BLI na pesquisa da UTI permanece limitada.
Este manuscrito descreve a implementação prática de BLI em um modelo de infecção do trato urinário do rato. Aqui, é fornecido um guia passo-a-passo para a cultura de bactérias, instilação intravesical e imagem. A correlação in vivo com a UFC é examinada e uma prova de conceito é fornecida comparando a carga bacteriana de animais infectados não tratados com animais tratados com antibióticos. Além disso, são discutidas as vantagens, limitações e considerações específicas para a implementação da BLI em um modelo in vivo UTI. A implantação da BLI no campo de pesquisa da UTI facilitará muito a pesquisa sobre a patogênese da UTI e a descoberta de novas formas de prevenir e tratar a ITU.

In vivo BLI correlaciona-se com a UFC do inóculo no momento da instilação. Para avaliar o limite de detecção do BLI in vivo e a correlação com a UFC do inóculo, os camundongos foram infectados com diferentes concentrações de UTI89-lux e PBS como controle negativo. Antes da instilação, animais não infectados eram escaneados para determinar a luminescência de fundo. As imagens subsequentes foram obtidas imediatamente após a instilação<strong ...

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Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

Este manuscrito descreve a administração intravesical de bactérias uropatômicas com um operon lux para induzir uma infecção do trato urinário em camundongos e posterior análise longitudinal in vivo da carga bacteriana usando imagens de bioluminescência.

Acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando bioluminescência imagem

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

A enumeração das unidades formadoras de colônias limitava a reprodutibilidade da pesquisa no campo da UTI. A imagem de bioluminescência avançará na pesquisa vivo UTI sobre fisiologia da bexiga, patogênese UTI e suscetibilidade. A imagem de bioluminescência permite o acompanhamento longitudinal com visão em tempo real da evolução da infecção.Além disso, reduz drasticamente o número de animais necessários. A bioluminescência de imagens facilita a pesquisa sobre infecções recorrentes ou crônicas, que são frequentes em humanos. Além disso, os pesquisadores podem identificar infecções ascendentes ou disseminação no sangue usando imagens de bioluminescência.Obtenha colônias únicas, espalhando o estoque de glicerol de bactérias com um laço de inoculação em placas LB suplementadas com sulfato de kanamicina, e culminando durante a noite a 37 graus Celsius. Encha um tubo traseiro redondo de poliestireno de 14 mililitros, com tampas de encaixe de dupla posição com cinco mililitros de caldo LB complementados com sulfato de kanamycin. Escolha uma única colônia bacteriana com um laço de inoculação, e adicione isso ao caldo LB.Vórtice por 10 segundos para garantir a mistura adequada. Cultura estaticamente com a tampa de estalo na posição aberta a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação, o vórtice do tubo por 10 segundos para garantir a homogeneização adequada da cultura bacteriana.Faça uma subcultura no Erlenmeyer adicionando 25 microliters da suspensão bacteriana a 25 mililitros de meio LB fresco sem antibióticos. Feche o Erlenmeyer e a cultura estaticamente da noite para o dia. No dia da instalação, despeje a cultura do Erlennmeyer em um tubo de cultura de 50 mililitros, e centrífuga.Decante o supernatante e resuspenque a pelota bacteriana em 10 mililitros de PBS estéreis. Vórtice o tubo novamente por 10 segundos. Escolha a concentração experimental do inóculo e determine o OD correspondente em 600 nanômetros usando a curva padrão.Adicione um mililitro da cultura bacteriana resuspended em nove mililitros de PBS estéreis e ajuste até que o od 600 nanômetro desejado seja atingido. Monte uma ponta de angiocateter de calibre 24 estéril em uma seringa de 100 microliter. Encha a seringa com a solução bacteriana preparada.Coloque um animal em uma superfície de trabalho na posição supina e mantenha uma anestesia isoflurane estável usando um cone de nariz durante a instalação. Aplique a pomada ocular. Expelir a urina residual aplicando compressão suave e fazendo movimentos circulares na região suprapúbica e, em seguida, limpe o abdômen inferior com 70% de etanol.Lubrifique a ponta do cateter com soro fisiológico normal. Coloque o dedo indicador na mão não dominante no abdômen e empurre-o suavemente para cima. Inicie o cateterismo da uretra verticalmente em um ângulo de 90 graus.Uma vez encontrada resistência, incline-a horizontalmente antes de inseri-la ainda mais. Realize uma instalação lenta de 50 microliters do inóculo bacteriano. Após a instalação, mantenha a seringa e o cateter no lugar por mais alguns segundos e, em seguida, retraia lentamente para evitar vazamentos.Use um cateter por grupo experimental. Posicione o animal em uma posição supina no cone do nariz para prepará-lo para a imagem, e prepare-o para a imagem usando um cateter por grupo experimental. Se necessário, administre antibióticos ou medicamentos experimentais, conforme mencionado no manuscrito do texto.Abra o software de aquisição da BLI e clique em Initialize no dispositivo de imagem para testar a câmera e o sistema do controlador de palco e resfriar a câmera do dispositivo acoplado a menos 90 graus Celsius. Clique em Aquisição, AutoSave To.Select Luminescence and Photograph. Verifique as configurações luminescentes padrão definindo o filtro de excitação para bloquear e filtro de emissão para abrir.Defina o tempo de exposição ao auto ao tirar a primeira imagem. Para medições in vivo e sinais brilhantes, ajuste o tempo de exposição para cerca de 30 segundos. Reduza o tempo de exposição se um aviso aparecer devido a uma imagem saturada.Selecione o binning médio, F/stop um e escolha o FOV correto. Ajuste a altura do sujeito para um centímetro ao fotografar ratos. Imagem de até cinco milhas simultaneamente e separar os animais usando o defletor de luz para evitar o reflexo.Feche a porta e clique em Adquirir para iniciar a sequência de imagens e, em seguida, preencha informações detalhadas sobre o experimento. Remova os ratos da câmara de imagem e devolva-os para a gaiola. Verifique se há recuperação completa após a anestesia e, em seguida, devolva as gaiolas aos racks ventilados até o próximo ciclo de imagem.Inicie o software de imagem e carregue o arquivo experimental clicando em Procurar. Use a paleta de ferramentas para ajustar a escala de cores da imagem. Use as ferramentas do ROI para desenhar uma região de interesse na imagem, garantindo que ela seja grande o suficiente para cobrir a área completa e usando as mesmas dimensões para todas as imagens.Em seguida, clique na medição do ROI para quantificar a intensidade da luz. Imagens subsequentes de camundongos obtidas imediatamente após a instalação mostraram que era robustamente detectável acima de 20.000 unidades formadoras de colônias, e uma correlação linear entre as unidades formadoras da colônia do inóculo e a bioluminescência in vivo foi estabelecida. A evolução natural de uma infecção do trato urinário foi estudada em um grupo controle que não recebeu nenhum tratamento.O efeito do tratamento antibiótico na cinética da infecção foi visualizado em detalhes em um grupo de animais tratados com antibióticos. Uma diminuição imediata da carga bacteriana, medida pelo fluxo total de fótons, foi observada após a primeira dose de Enrofloxacina. Nenhum dos animais tratados teve um aumento subsequente na carga bacteriana.A carga bacteriana geral de cada animal foi calculada utilizando-se a área sob a curva do fluxo de fótons transformado no tronco, mostrando uma diferença significativa entre animais tratados com Enrofloxacina e animais não tratados ao longo de 10 dias. Esses resultados comprovam o conceito de que o BLI pode ser usado para avaliar diferenças na cinética da infecção por UTI. A bioluminescência é uma técnica não invasiva que pode ser combinada com outros métodos, como a coleta regular de amostras urinárias para análise bacteriana ou bioquímica ou para os experimentos.Aqui demonstramos que a bioluminescência é uma ferramenta poderosa para avaliar novas estratégias terapêuticas sobre o curso da doença de infecções do trato urinário.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Indução transuretral de rato infecção urinária

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Imunologia e Infecção

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Imagem de bioluminescência de NADPH oxidase em diferentes modelos animais

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodalidade de imagens de<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecções em Ratos

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Infecção do trato urinário em um modelo Animal de pequeno porte: transuretral cateterismo de ratos machos e fêmeas

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Therapy luz azul para-multirresistente Acinetobacter baumannii queimadura Infecções Usando bioluminescência Imagiologia

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Um Multimodal abordagem de imagem baseado em Micro-CT e fluorescência Molecular tomografia para avaliação Longitudinal de fibrose pulmonar induzida por bleomicina em ratos

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolamento de comunidades de bacterianas intracelulares único gerado a partir de um modelo murino de infecção do trato urinário para análise de célula única a jusante

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...