Name: longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging
Uploaded: 2021-06-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Исследовательского фонда Фландрии (FWO Vlaanderen; G0A6113N), Исследовательский совет KU Leuven (C1-TRPLe; Т.В. и В.Е.) и ВИБ (до Т.В.). В.Е. является старшим клиническим научным сотрудником Исследовательского фонда Фландрии (FWO Vlaanderen). Штамм UTI89-lux был щедрым подарком от лаборатории профессора Сида13.

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Совета Сообщества Европейского Союза и были одобрены Комитетом по этике животных KU Leuven (P158/2018).
1. Культивирование бактерий (адаптировано из7,13,<sup class="xref...

<ol>
	<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+urinary+tract+infections:+incidence,+morbidity,+and+economic+costs.">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).</li><li>O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+vaccine+development+for+the+treatment+and+prevention+of+urinary+tract+infections.">Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections.</a> Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).</li><li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection.">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).</li><li>Carey, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+of+mice+to+model+human+disease:+Practicalities,+implications+and+limitations.">Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations.</a> Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).</li><li>Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+model+systems+for+the+study+of+urinary+tract+infections+and+related+pathologies.">Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).</li><li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+indicators+in+living+mammals.">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+monitoring+of+infectious+diseases+in+living+animals+using+bioluminescence+imaging.">In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging.</a> Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).</li><li>Balsara, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+susceptibility+to+urinary+tract+infection+in+the+spinal+cord-injured+host+with+neurogenic+bladder.">Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).</li><li>Huang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy+mediated+by+methylene+blue+and+potassium+iodide+to+treat+urinary+tract+infection+in+a+female+rat+model.">Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).</li><li>Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+persistent+Escherichia+coli+reservoir+during+the+acute+phase+of+a+bladder+infection.">Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection.</a> Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).</li><li>Hannan, T. J., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+E.+coli+urinary+tract+infection.">A murine model for E. coli urinary tract infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).</li><li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains.">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Nonsteroidal+Anti-inflammatory+Drugs+for+Treatment+of+Uncomplicated+Lower+Urinary+Tract+Infections+in+Women:+A+Meta-analysis.">Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis.</a> Infectious Microbes &amp; Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+bioluminescence+imaging+of+fungal+dissemination+to+the+brain+in+mouse+models+of+cryptococcosis.">Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).</li><li>Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+looking+beyond+the+light.">Bioluminescence imaging: looking beyond the light.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).</li><li>Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancy+between+viable+counts+and+light+output+as+viability+measurements,+following+ciprofloxacin+challenge+of+self-bioluminescent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).</li><li>Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+increases+in+vivo+screening+efficiency+for+antifungal+activity+against+device-associated+Candida+albicans+biofilms.">Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilm+development+on+medically-relevant+foreign+bodies+in+a+mouse+subcutaneous+model+followed+by+bioluminescence+imaging.">Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).</li><li>Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+non-invasive+monitoring+of+pathogen-host+interactions+during+Candida+albicans+biofilm+formation+using+in+vivo+bioluminescence.">Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence.</a> Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).</li></ol>

Преимущества BLI по сравнению с количеством КОЕ Продольные данные Основным недостатком традиционного метода подсчета КОЕ для количественной оценки микробной нагрузки является требование гомогенатов посмертных органов, обеспечивающих только одну точку поперечного с...

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) являются одними из наиболее распространенных бактериальных инфекций у людей. Почти половина всех женщин будут испытывать симптоматическую ИМП в течение своей жизни1. Инфекции, ограниченные мочевым пузырем, могут привести к мочевым симптомам, таким как увеличение частоты мочеиспускания, срочность, гематурия, недержание мочи и боль. Когда инфекция поднимается в верхние мочевые пути, у пациентов развивается пиелонефрит, с недомоганием, лихорадкой, ознобом и болями в спине. Кроме того, до 20% пациентов с ИМП страдают от рецидивирующих инфекций, что приводит к резкому снижению чувствительности к антибиотикам2,3,4. В последние годы наблюдается растущий интерес к новым методам лечения и профилактики рецидивирующих ИМП. Несмотря на лучшее понимание врожденного и адаптивного иммунитета нижних мочевых путей и факторов бактериальной вирулентности, необходимых для инвазии и колонизации, никаких радикальных изменений в режиме лечения не было переведено в ежедневную урологическую практику2. Для изучения патогенеза ИМП и восприимчивости in vivoнеобходим воспроизводимый и неинвазивный анализ.
Было описано несколько моделей ИМП на животных, начиная от нематод и заканчивая приматами, но мышиная модель преимущественно используется5,6. Эта модель состоит из трансуретральной катетеризации (самок) мышей и последующей инстилляции бактериальной суспензии, чаще всего уропатогенной кишечной палочки (УПЭК), непосредственно в просвет мочевого пузыря7. После инокуляции бактериальная нагрузка традиционно количественно определяется путем определения колониеобразующих единиц (КОЕ). Этот метод требует жертвоприношения животных для получения посмертных гомогенатов органов и последовательных разведений, ограничивая вывод данных и воспроизводимость. Кроме того, продольное наблюдение за бактериальной нагрузкой у отдельных животных невозможно с использованием этой методики.
В 1995 году Contag etal. предложили использовать биолюминесцентно-меченые патогены для мониторинга процессов заболевания у живых животных8,9. С тех пор биолюминесцентная визуализация (BLI) была применена к многочисленным моделям инфекций, таким как менингит, эндокардит, остеомиелит, инфекции кожи и мягких тканей и т. Д.10,11,12. В мышиной модели ИМП может быть использован штамм УПЭК с полным люкс-опероном (luxCDABE)от Photorhabdus luminescens 13. Ферментативная реакция катализируется бактериальной люциферазой, которая зависит от окисления длинноцепочечных альдегидов, реагирующих с восстановленным мононуклеотидом флавина в присутствии кислорода, в результате чего образуется окисленный флавин, длинноцепочечная жирная кислота и свет12. Люкс оперон кодирует люциферазу и другие ферменты, необходимые для синтеза субстратов. Поэтому все метаболически активные бактерии будут непрерывно излучать сине-зеленый (490 нм) свет без необходимости введения экзогенного субстрата12. Фотоны, испускаемые бактериями сметками люкс, могут быть захвачены с помощью высокочувствительных камер с охлаждаемой связью с зарядом (CCD).
Использование биолюминесцентных бактерий в модели ИМП позволяет проводить продольную, неинвазивную количественную оценку бактериальной нагрузки, исключая необходимость жертвоприношения животных в фиксированные моменты времени во время последующего наблюдения за определением КОЕ. Несмотря на широкий спектр возможностей, аккумулирующих доказательств надежности данной методики МПЖ в других областях и ее преимущества перед классическими моделями ИМП, она не получила широкого применения в исследованиях ИМП. Протокол, представленный здесь, предоставляет подробное пошаговое руководство и подчеркивает преимущества BLI для всех будущих исследований ИМП.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3925</td>
			<td>for in vitro imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap ISIS</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>hair trimmer, with GT608 cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer</td>
			<td>Harvard apparatus limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 100 mg/mL</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte Autoguard 24 GA</td>
			<td>BD</td>
			<td>382912</td>
			<td>Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6J mice</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropsense 16</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>Trinean</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Gibco</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>REF 14040-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% denaturated 5L</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>85825360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50ml cellstart</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 &#181;L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26203</td>
			<td>to ensure slow bacterial instillation of 50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6174.1</td>
			<td>holder: Art. No. 6189.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-Vet 1000mg/g</td>
			<td>Dechra Veterinary products</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>REF 124262</td>
			<td>imaging device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine solution 50 mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BLI acquisition software, version 4.7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L3022</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth with agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L2897</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish Sterilin 90mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>to fill with LB agar supplemented with Km</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Culture flask 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLW1141/08-20EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide 200 Trinean</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>701-2007</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTI89-lux</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generous gift from Prof. Seed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>444-1372</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) относятся к числу наиболее распространенных бактериальных инфекций у людей и обычно лечатся эмпирическими антибиотиками. Однако из-за повышения микробной резистентности эффективность наиболее часто используемых антибиотиков снизилась. Чтобы найти альтернативные варианты лечения, существует большая потребность в лучшем понимании патогенеза ИМП и механизмов, определяющих восприимчивость к ИМП. Чтобы исследовать это на животной модели, необходим воспроизводимый, неинвазивный анализ для изучения течения ИМП.
В течение многих лет золотым стандартом для перечисления бактериальной нагрузки было определение колониеобразующих единиц (КОЕ) для конкретного объема образца. Этот метод требует посмертных гомогенатов органов и последовательных разбавлений, ограничивая вывод данных и воспроизводимость. В качестве альтернативы набирает популярность биолюминесцентная визуализация (BLI) для определения бактериальной нагрузки. Маркировка патогенов с помощью люкс-оперона позволяет осуществлять чувствительное обнаружение и количественную оценку неинвазивным способом, тем самым обеспечивая продольное наблюдение. До сих пор принятие BLI в исследованиях ИМП остается ограниченным.
Эта рукопись описывает практическую реализацию BLI в мышиной модели инфекции мочевыводящих путей. Здесь приведено пошаговое руководство по культивированию бактерий, внутрипузырной инстилляции и визуализации. Исследуется корреляция in vivo с КОЕ и обеспечивается доказательство концепции путем сравнения бактериальной нагрузки необработанных инфицированных животных с животными, обработанными антибиотиками. Кроме того, обсуждаются преимущества, ограничения и соображения, характерные для реализации BLI в модели in vivo UTI. Внедрение BLI в области исследований ИМП значительно облегчит исследования патогенеза ИМП и открытие новых способов профилактики и лечения ИМП.

In vivo BLI коррелирует с КОЕ инокулята в момент инстилляции. Чтобы оценить предел обнаружения BLI in vivo и корреляцию с КОЕ инокулята, мышей заражали различными концентрациями UTI89-lux и PBS в качестве отрицательного контроля. Перед инстилляцией неинфицированны?...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging at JoVE.com

Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

В данной рукописи описывается внутрипузырное введение уропатогенных бактерий с помощью люкс-оперона для индуцирования инфекции мочевыводящих путей у мышей и последующий продольный in vivo анализ бактериальной нагрузки с использованием биолюминесцентной визуализации.

Продольное наблюдение за инфекциями мочевыводящих путей и их лечение у мышей с использованием биолюминесцентной визуализации

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

Перечисление колониеобразующих единиц ограничивало воспроизводимость исследований в области ИМП. Биолюминесцентная визуализация будет продвигать исследования имп in vivo по физиологии мочевого пузыря, патогенезу ИМП и восприимчивости. Биолюминесцентная визуализация позволяет проводить продольное наблюдение с пониманием эволюции инфекции в режиме реального времени.Более того, это резко сокращает количество необходимых животных. Биолюминесцентная визуализация облегчает исследования рецидивирующих или хронических инфекций, которые часто встречаются у людей. Кроме того, исследователи могут идентифицировать восходящие инфекции или распространение в кровь с помощью биолюминесцентной визуализации.Получение одиночных колоний путем удаления глицеринового запаса бактерий с помощью прививочной петли на пластинах LB, дополненных сульфатом канамицина, и культивирования в течение ночи при 37 градусах Цельсия. Наполните стерильную 14-миллилитровую полистирольную трубку с круглым дном, с двухпозиционными защелками с пятью миллилитрами бульона LB, дополненного сульфатом канамицина. Выберите одну бактериальную колонию с петлей прививки и добавьте ее в бульон LB.Вихрь в течение 10 секунд для обеспечения правильного перемешивания. Культивируйте статически с защелкивающейся крышкой в открытом положении при 37 градусах Цельсия в течение ночи. После инкубации вихрьте трубку в течение 10 секунд, чтобы обеспечить надлежащую гомогенизацию бактериальной культуры.Создайте субкультуру в Эрленмейере, добавив 25 микролитров бактериальной суспензии к 25 миллилитрам свежей среды LB без антибиотиков. Закройте Эрленмейер и культуру статически на ночь. В день установки перелейте культуру из Эрленнмейера в 50-миллилитровую культуральную трубку и центрифугу.Декантировать супернатант и повторно суспендировать бактериальную гранулу в 10 миллилитрах стерильного PBS. Снова вращайте трубку в течение 10 секунд. Выберите экспериментальную концентрацию инокулята и определите соответствующий ОД при 600 нанометрах с помощью стандартной кривой.Добавляют один миллилитр повторно суспендированной бактериальной культуры в девять миллилитров стерильного PBS и регулируют до тех пор, пока не будет достигнут желаемый OD 600 нанометров. Установите стерильный наконечник ангиокатетера 24-го калибра на 100-микролитровый шприц. Наполните шприц приготовленным бактериальным раствором.Поместите одно животное на рабочую поверхность в положении лежа на спине и поддерживайте стабильную изофлурановую анестезию с помощью носового конуса во время установки. Нанесите глазную мазь. Изгоняют остаточную мочу, применяя мягкое сжатие и совершая круговые движения по надлобковой области, затем очищают нижнюю часть живота 70% этанолом.Смажьте кончик катетера обычным физиологическим раствором. Положите указательный палец на недоминирующую руку на животе и осторожно протолкните его вверх. Начинают катетеризацию уретры вертикально под углом 90 градусов.Как только сопротивление встретится, наклоните его горизонтально, прежде чем вставлять его дальше. Выполните медленную установку 50 микролитров бактериального инокулята. После установки держите шприц и катетер на месте еще несколько секунд, а затем медленно втягивайте, чтобы предотвратить утечку.Используйте один катетер на экспериментальную группу. Поместите животное в положение лежа на спине в носовом конусе, чтобы подготовить его к визуализации, и подготовьте его к визуализации с использованием одного катетера на экспериментальную группу. При необходимости назначают антибиотики или экспериментальные препараты, как указано в тексте рукописи.Откройте программное обеспечение для сбора BLI и нажмите «Инициализировать» в устройстве обработки изображений, чтобы протестировать систему контроллера камеры и сцены и охладить камеру устройства с зарядовой связью до минус 90 градусов по Цельсию. Нажмите «Получение», «Автосохранение».Выберите люминесценцию и фотографию. Проверьте настройки люминесцентности по умолчанию, установив для фильтра возбуждения значение Блокировать, а для фильтра излучения — значение Открыть.Установите время экспозиции на автоматическое при съемке первого изображения. Для измерений in vivo и ярких сигналов установите время экспозиции около 30 секунд. Сократите время экспозиции, если появляется предупреждение из-за насыщенного изображения.Выберите среднее биннинг, F/stop one и выберите правильный FOV. Установите высоту объекта в один сантиметр при визуализации мышей. Визуализируйте до пяти миль одновременно и разделяйте животных, используя световую перегородку, чтобы предотвратить отражение.Закройте дверь и нажмите «Получить», чтобы начать последовательность изображений, затем заполните подробную информацию об эксперименте. Извлеките мышей из камеры визуализации и верните их в клетку. Проверьте полное восстановление после анестезии, затем верните клетки в вентилируемые стойки до следующего цикла визуализации.Запустите программное обеспечение для создания образов и загрузите экспериментальный файл, нажав кнопку Обзор. Используйте инструментальную палитру для настройки цветовой шкалы изображения. Используйте инструменты ROI, чтобы нарисовать интересующую область на изображении, гарантируя, что она достаточно велика, чтобы покрыть всю область, и используя одинаковые размеры для всех изображений.Затем нажмите на измерение ROI, чтобы количественно оценить интенсивность света. Последующие изображения мышей, полученные сразу после установки, показали, что их надежно обнаруживается выше 20 000 колониеобразующих единиц, и была установлена линейная корреляция между колониеобразующими единицами инокулята и биолюминесценцией in vivo. Естественная эволюция инфекции мочевыводящих путей была изучена в контрольной группе, которая не получала никакого лечения.Влияние лечения антибиотиками на кинетику инфекции было детально визуализировано в группе животных, получавших антибиотики. Немедленное снижение бактериальной нагрузки, измеренное общим потоком фотонов, наблюдалось после первой дозы энрофлоксацина. Ни у одного из обработанных животных не было последующего повышения бактериальной нагрузки.Общая бактериальная нагрузка каждого животного была рассчитана с использованием площади под кривой логарифмического преобразованного общего потока фотонов, показав значительную разницу между животными, получавшими энрофлоксацин, и необработанными животными в течение 10 дней. Эти результаты являются доказательством того, что BLI может быть использован для оценки различий в кинетике инфекции ИМП. Биолюминесцентная визуализация является неинвазивным методом, который можно комбинировать с другими методами, такими как регулярный сбор образцов мочи для бактериального или биохимического анализа или для экспериментов.Здесь мы продемонстрировали, что биолюминесцентная визуализация является мощным инструментом для оценки новых терапевтических стратегий течения заболевания инфекций мочевыводящих путей.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Трансуретральная Индукция Мышь инфекции мочевыводящих путей

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Использование люциферазы в Изображение Бактериальные инфекции у мышей

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Биолюминесценция Визуализация активности NADPH оксидазы на различных животных моделях

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Комплексное 4D визуализация<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Инфекции у мышей

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Долгосрочная Хронический<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; Дыхательных инфекции у мышей

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Биолюминесценции визуализации для обнаружения поздней стадии инфекции африканского трипаносомоза

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Инфекции мочевыводящих путей в небольшой животной модели: трансуретральная катетеризация мужские и женские мышей

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

В Vivo Исследовании антимикробной Синяя Светотерапии для Полирезистентного Acinetobacter baumannii Ожог инфекции с помощью биолюминесценции визуализации

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Мультимодального Imaging подход на основе микро CT и флуоресценции молекулярные томографии для продольной оценки фиброза блеомицин индуцированного легких у мышей

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Изоляция одной внутриклеточных бактериальных сообществ, генерируется из мышиных модели инфекции мочевыводящих путей анализа течению одноклеточного

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...