Name: longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging
Uploaded: 2021-06-14T13:30:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Investigación - Flandes (FWO Vlaanderen; G0A6113N), el Consejo de Investigación de KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. y W.E.) y el VIB (a T.V.). W.E. es investigador clínico senior de la Fundación de Investigación - Flandes (FWO Vlaanderen). La cepa UTI89-lux fue un generoso regalo del laboratorio del Prof. Seed13.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo de la Comunidad de la Unión Europea y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de KU Leuven (P158/2018).
1. Cultivo de bacterias (adaptado de7,13,14)
<ol><li>Preparación<ol>
<li>Elija una cepa UPEC luminiscente que mejor se adapte a las necesidades experimentales. NOTA: Aquí, el aislado cl...

<ol>
	<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+urinary+tract+infections:+incidence,+morbidity,+and+economic+costs.">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).</li><li>O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+vaccine+development+for+the+treatment+and+prevention+of+urinary+tract+infections.">Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections.</a> Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).</li><li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection.">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).</li><li>Carey, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+of+mice+to+model+human+disease:+Practicalities,+implications+and+limitations.">Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations.</a> Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).</li><li>Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+model+systems+for+the+study+of+urinary+tract+infections+and+related+pathologies.">Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).</li><li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+indicators+in+living+mammals.">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+monitoring+of+infectious+diseases+in+living+animals+using+bioluminescence+imaging.">In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging.</a> Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).</li><li>Balsara, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+susceptibility+to+urinary+tract+infection+in+the+spinal+cord-injured+host+with+neurogenic+bladder.">Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).</li><li>Huang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy+mediated+by+methylene+blue+and+potassium+iodide+to+treat+urinary+tract+infection+in+a+female+rat+model.">Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).</li><li>Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+persistent+Escherichia+coli+reservoir+during+the+acute+phase+of+a+bladder+infection.">Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection.</a> Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).</li><li>Hannan, T. J., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+E.+coli+urinary+tract+infection.">A murine model for E. coli urinary tract infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).</li><li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains.">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Nonsteroidal+Anti-inflammatory+Drugs+for+Treatment+of+Uncomplicated+Lower+Urinary+Tract+Infections+in+Women:+A+Meta-analysis.">Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis.</a> Infectious Microbes &amp; Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+bioluminescence+imaging+of+fungal+dissemination+to+the+brain+in+mouse+models+of+cryptococcosis.">Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).</li><li>Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+looking+beyond+the+light.">Bioluminescence imaging: looking beyond the light.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).</li><li>Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancy+between+viable+counts+and+light+output+as+viability+measurements,+following+ciprofloxacin+challenge+of+self-bioluminescent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).</li><li>Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+increases+in+vivo+screening+efficiency+for+antifungal+activity+against+device-associated+Candida+albicans+biofilms.">Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilm+development+on+medically-relevant+foreign+bodies+in+a+mouse+subcutaneous+model+followed+by+bioluminescence+imaging.">Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).</li><li>Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+non-invasive+monitoring+of+pathogen-host+interactions+during+Candida+albicans+biofilm+formation+using+in+vivo+bioluminescence.">Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence.</a> Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).</li></ol>

Ventajas de BLI en comparación con los recuentos de UFC Datos longitudinales Una desventaja importante del método tradicional de conteo de UFC para cuantificar la carga microbiana es el requisito de homogeneizados de órganos post mortem, que proporcionan solo un punto de datos transversal por animal. Por el contrario, el BLI permite un seguimiento longitudinal no invasivo de los animales infectados. Los animales pueden ser fotografiados de 2 a 3 veces al día, proporcionando una visión...

Las infecciones del tracto urinario (ITU) se encuentran entre las infecciones bacterianas más comunes en los seres humanos. Casi la mitad de todas las mujeres experimentarán una infección urinaria sintomática durante su vida1. Las infecciones limitadas a la vejiga pueden dar lugar a síntomas urinarios como aumento de la frecuencia urinaria, urgencia, hematuria, incontinencia y dolor. Cuando la infección asciende al tracto urinario superior, los pacientes desarrollan pielonefritis, con malestar general, fiebre, escalofríos y dolor de espalda. Además, hasta el 20% de los pacientes con ITU sufren infecciones recurrentes que resultan en una disminución dramática de la sensibilidad a los antibióticos2,3,4. En los últimos años, ha habido un creciente interés en nuevas terapias para el tratamiento y la prevención de la ITU recurrente. A pesar de una mejor comprensión de la inmunidad innata y adaptativa del tracto urinario inferior y de los factores de virulencia bacteriana necesarios para la invasión y colonización, no se han traducido cambios radicales en el régimen de tratamiento a la práctica urológica diaria2. Para estudiar la patogénesis y la susceptibilidad in vivo delas itunicas urinarias, es indispensable un ensayo reproducible y no invasivo.
Se han descrito múltiples modelos de ITU animales que van desde nematodos hasta primates, pero el modelo murino se utiliza predominantemente5,6. Este modelo consiste en el cateterismo transuretral de ratones (hembras) y la posterior instilación de una suspensión bacteriana, más comúnmente uropatógena Escherichia coli (UPEC), directamente en la luz de la vejiga7. Después de la inoculación, la carga bacteriana se ha cuantificado tradicionalmente mediante la determinación de unidades formadoras de colonias (UFC). Esta técnica requiere el sacrificio de animales para obtener homogeneizados de órganos post mortem y diluciones en serie, lo que limita la producción de datos y la reproducibilidad. Además, el seguimiento longitudinal de la carga bacteriana en animales individuales no es posible utilizando esta técnica.
En 1995, Contag etal. sugirieron el uso de patógenos marcados con bioluminiscencia para monitorear los procesos de enfermedad en animales vivos8,9. Desde entonces, la imagen de bioluminiscencia (BLI) se ha aplicado a numerosos modelos de infección como meningitis, endocarditis, osteomielitis, infecciones de la piel y tejidos blandos, etc.10,11,12. En el modelo murino UTI, se puede utilizar una cepa UPEC con el operón lux completo(luxCDABE)de Photorhabdus luminescens 13. Una reacción enzimática es catalizada por la luciferasa bacteriana que depende de la oxidación de aldehídos de cadena larga que reaccionan con el mononucleótido de flavina reducido en presencia de oxígeno, produciendo la flavina oxidada, un ácido graso de cadena larga y ligero12. El operón lux codifica para la luciferasa y otras enzimas necesarias para la síntesis de los sustratos. Por lo tanto, todas las bacterias metabólicamente activas emitirán continuamente luz verde azul (490 nm) sin necesidad de la inyección de un sustrato exógeno12. Los fotones emitidos por bacterias marcadas con luxse pueden capturar utilizando cámaras de dispositivos de carga acoplada (CCD) refrigeradas y altamente sensibles.
El uso de bacterias bioluminiscentes en un modelo para la ITU permite la cuantificación longitudinal y no invasiva de la carga bacteriana, omitiendo la necesidad de sacrificar animales en puntos de tiempo fijos durante el seguimiento para la determinación de ufc. A pesar de la amplia gama de posibilidades, la acumulación de evidencia de la robustez de esta técnica BLI en otros campos y sus ventajas sobre los modelos clásicos de ITU, no se ha implementado ampliamente en la investigación de UTI. El protocolo presentado aquí proporciona una guía detallada paso a paso y destaca las ventajas de BLI para toda la investigación futura de UTI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3925</td>
			<td>for in vitro imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap ISIS</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>hair trimmer, with GT608 cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer</td>
			<td>Harvard apparatus limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 100 mg/mL</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte Autoguard 24 GA</td>
			<td>BD</td>
			<td>382912</td>
			<td>Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6J mice</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropsense 16</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>Trinean</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Gibco</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>REF 14040-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% denaturated 5L</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>85825360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50ml cellstart</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 &#181;L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26203</td>
			<td>to ensure slow bacterial instillation of 50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6174.1</td>
			<td>holder: Art. No. 6189.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-Vet 1000mg/g</td>
			<td>Dechra Veterinary products</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>REF 124262</td>
			<td>imaging device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine solution 50 mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BLI acquisition software, version 4.7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L3022</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth with agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L2897</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish Sterilin 90mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>to fill with LB agar supplemented with Km</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Culture flask 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLW1141/08-20EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide 200 Trinean</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>701-2007</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTI89-lux</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generous gift from Prof. Seed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>444-1372</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging

Las infecciones del tracto urinario (ITU) se encuentran entre las infecciones bacterianas más comunes en humanos y se tratan rutinariamente con antibióticos empíricos. Sin embargo, debido al aumento de la resistencia microbiana, la eficacia de los antibióticos más utilizados ha disminuido. Para encontrar opciones de tratamiento alternativas, existe una gran necesidad de una mejor comprensión de la patogénesis de la ITU y los mecanismos que determinan la susceptibilidad a la ITU. Para investigar esto en un modelo animal, es indispensable un ensayo reproducible y no invasivo para estudiar el curso de la ITU.
Durante años, el estándar de oro para la enumeración de la carga bacteriana ha sido la determinación de unidades formadoras de colonias (UFC) para un volumen de muestra particular. Esta técnica requiere homogeneizados de órganos post mortem y diluciones en serie, lo que limita la producción de datos y la reproducibilidad. Como alternativa, las imágenes de bioluminiscencia (BLI) están ganando popularidad para determinar la carga bacteriana. El etiquetado de patógenos con un operón lux permite la detección y cuantificación sensible de una manera no invasiva, lo que permite un seguimiento longitudinal. Hasta ahora, la adopción de BLI en la investigación de itunicas urinarias sigue siendo limitada.
Este manuscrito describe la implementación práctica de BLI en un modelo de infección del tracto urinario de ratón. Aquí, se proporciona una guía paso a paso para el cultivo de bacterias, la instilación intravesical y la obtención de imágenes. Se examina la correlación in vivo con la UFCC y se proporciona una prueba de concepto comparando la carga bacteriana de los animales infectados no tratados con los animales tratados con antibióticos. Además, se discuten las ventajas, limitaciones y consideraciones específicas de la implementación de BLI en un modelo de ITU in vivo. La implementación de BLI en el campo de investigación de UTI facilitará en gran medida la investigación sobre la patogénesis de UTI y el descubrimiento de nuevas formas de prevenir y tratar UTI.

El BLI in vivo se correlaciona con la UFC del inóculo en el momento de la instilación. Para evaluar el límite de detección de BLI in vivo y la correlación con ufc del inóculo, los ratones fueron infectados con diferentes concentraciones de UTI89-lux y PBS como control negativo. Antes de la instilación, los animales no infectados fueron escaneados para determinar la luminiscencia de fondo. Las imágenes posteriores se obtuvieron inmediatamente después...

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Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

Este manuscrito describe la administración intravesical de bacterias uropatógenas con un lux operon para inducir una infección del tracto urinario en ratones y el posterior análisis longitudinal in vivo de la carga bacteriana mediante imágenes de bioluminiscencia.

Seguimiento longitudinal de las infecciones del tracto urinario y su tratamiento en ratones utilizando imágenes de bioluminiscencia

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

La enumeración de las unidades formadoras de colonias estaba limitando la reproducibilidad de la investigación en el campo de la ITU. Las imágenes de bioluminiscencia avanzarán en la investigación in vivo de la ITU sobre la fisiología de la vejiga, la patogénesis de la ITU y la susceptibilidad. Las imágenes de bioluminiscencia permiten un seguimiento longitudinal con información en tiempo real sobre la evolución de la infección.Además, reduce drásticamente el número de animales necesarios. Las imágenes de bioluminiscencia facilitan la investigación sobre infecciones recurrentes o crónicas, que son frecuentes en humanos. Además, los investigadores pueden identificar infecciones ascendentes o diseminación a la sangre utilizando imágenes de bioluminiscencia.Obtenga colonias individuales eliminando el stock de glicerol de bacterias con un bucle de inoculación en placas LB suplementadas con sulfato de kanamicina, y cultivando durante la noche a 37 grados centígrados. Llene un tubo inferior redondo estéril de poliestireno de 14 mililitros, con tapas de doble posición con cinco mililitros de caldo LB suplementado con sulfato de kanamicina. Elija una sola colonia bacteriana con un bucle de inoculación y agréguela al caldo LB.Vórtice durante 10 segundos para garantizar una mezcla adecuada. Cultive estáticamente con la tapa de ajuste en la posición abierta a 37 grados centígrados durante la noche. Después de la incubación, vórtice el tubo durante 10 segundos para garantizar la homogeneización adecuada del cultivo bacteriano.Hacer un subcultivo en el Erlenmeyer añadiendo 25 microlitros de la suspensión bacteriana a 25 mililitros de lb medio fresco sin antibióticos. Cierre el Erlenmeyer y el cultivo estáticamente durante la noche. El día de la instalación, vierta el cultivo del Erlennmeyer en un tubo de cultivo de 50 mililitros y centrífuga.Decantar el sobrenadante y resuspend el pellet bacteriano en 10 mililitros de PBS estéril. Vuelva a vórtice el tubo durante 10 segundos. Elija la concentración experimental del inóculo y determine el OD correspondiente a 600 nanómetros utilizando la curva estándar.Agregue un mililitro del cultivo bacteriano resuspendido en nueve mililitros de PBS estéril y ajuste hasta que se alcance el OD 600 nanómetro deseado. Monte una punta estéril de angiocatéter calibre 24 en una jeringa de 100 microlitros. Llene la jeringa con la solución bacteriana preparada.Coloque un animal en una superficie de trabajo en posición supina y mantenga una anestesia estable de isoflurano utilizando un cono nasal durante la instalación. Aplique el ungüento para los ojos. Expulse la orina residual aplicando una compresión suave y haciendo movimientos circulares en la región suprapúbica, luego limpie la parte inferior del abdomen con etanol al 70%.Lubrique la punta del catéter con solución salina normal. Coloque el dedo índice sobre la mano no dominante en el abdomen y empuje suavemente hacia arriba. Comience el cateterismo de la uretra verticalmente en un ángulo de 90 grados.Una vez que se encuentre resistencia, inclínelo horizontalmente antes de insertarlo más. Realice una instalación lenta de 50 microlitros del inóculo bacteriano. Después de la instalación, mantenga la jeringa y el catéter en su lugar durante unos segundos más y luego retraiga lentamente para evitar fugas.Utilice un catéter por grupo experimental. Coloque al animal en posición supina en el cono de la nariz para prepararlo para la obtención de imágenes y prepárelo para la obtención de imágenes utilizando un catéter por grupo experimental. Si es necesario, administrar antibióticos o medicamentos experimentales, como se menciona en el manuscrito de texto.Abra el software de adquisición BLI y haga clic en Inicializar en el dispositivo de imágenes para probar la cámara y el sistema de controlador de escenario y para enfriar la cámara del dispositivo de carga acoplada a menos 90 grados centígrados. Haga clic en Adquisición, Guardar automáticamente para.Seleccione luminiscencia y fotografía. Compruebe la configuración luminiscente predeterminada configurando el filtro de excitación en Bloquear y el filtro de emisión en Abrir.Establezca el tiempo de exposición en automático al tomar la primera imagen. Para mediciones in vivo y señales brillantes, establezca el tiempo de exposición en alrededor de 30 segundos. Reduzca el tiempo de exposición si aparece una advertencia debido a una imagen saturada.Seleccione el binning medio, F/stop one, y elija el FOV correcto. Establezca la altura del sujeto en un centímetro al obtener imágenes de ratones. Imagine hasta cinco millas simultáneamente y separe a los animales usando el deflector de luz para evitar la reflexión.Cierre la puerta y haga clic en Adquirir para iniciar la secuencia de imágenes, luego complete la información detallada sobre el experimento. Retire los ratones de la cámara de imágenes y devuélvalos a su jaula. Verifique la recuperación completa después de la anestesia, luego devuelva las jaulas a las rejillas ventiladas hasta el siguiente ciclo de imágenes.Inicie el software de imágenes y cargue el archivo experimental haciendo clic en Examinar. Utilice la paleta de herramientas para ajustar la escala de colores de la imagen. Utilice las herramientas de ROI para dibujar una región de interés en la imagen, asegurándose de que sea lo suficientemente grande como para cubrir el área completa y utilizando las mismas dimensiones para todas las imágenes.Luego haga clic en medición de ROI para cuantificar la intensidad de la luz. Las imágenes posteriores de ratones obtenidas inmediatamente después de la instalación mostraron que era robustamente detectable por encima de 20.000 unidades formadoras de colonias, y se estableció una correlación lineal entre las unidades formadoras de colonias del inóculo y la bioluminiscencia in vivo. La evolución natural de una infección urinaria se estudió en un grupo control que no recibió ningún tratamiento.El efecto del tratamiento antibiótico sobre la cinética de la infección se visualizó en detalle en un grupo de animales tratados con antibióticos. Se observó una disminución inmediata de la carga bacteriana, medida por el flujo total de fotones, después de la primera dosis de enrofloxacina. Ninguno de los animales tratados tuvo un aumento posterior de la carga bacteriana.La carga bacteriana global de cada animal se calculó utilizando el área bajo la curva del flujo total de fotones transformado en logaribo, mostrando una diferencia significativa entre los animales tratados con Enrofloxacina y los animales no tratados en el transcurso de 10 días. Estos resultados proporcionan una prueba de concepto de que BLI se puede utilizar para evaluar las diferencias en la cinética de la infección por ITU. La imagen de bioluminiscencia es una técnica no invasiva que se puede combinar con otros métodos, como la recolección regular de muestras urinarias para análisis bacterianos o bioquímicos o para los experimentos.Aquí hemos demostrado que las imágenes de bioluminiscencia son una herramienta poderosa para evaluar nuevas estrategias terapéuticas sobre el curso de la enfermedad de las infecciones del tracto urinario.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Inducción transuretral de infección del tracto urinario ratón

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Investigación

Inmunología e Infección

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Luciferasa utilizando a las infecciones bacterianas de la imagen en ratones

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Bioluminiscencia de imágenes de la actividad NADPH oxidasa en diferentes modelos animales

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D de imágenes multimodalidad<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Las infecciones en ratones

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Imágenes de bioluminiscencia para detectar la infección en fase tardía de la tripanosomiasis africana

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Infección del tracto urinario en un modelo Animal pequeño: cateterización transuretral de ratones machos y hembras

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

En Vivo Investigación de Terapia de luz azul antimicrobianos para multirresistente Acinetobacter baumannii infecciones de quemaduras El uso de bioluminiscencia Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Un Multimodal enfoque de imagen basados en tomografía Molecular Micro-CT y la fluorescencia para la evaluación Longitudinal de la Fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Aislamiento de las comunidades bacterianas intracelulares solo generados a partir de un modelo murino de infección del tracto urinario para posteriores análisis unicelular

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...