Name: longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging
Uploaded: 2021-06-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från Forskningsstiftelsen - Flandern (FWO Vlaanderen; G0A6113N), KU Leuvens forskningråd (C1-TRPLe; T.V. och W.E.) och VIB (till T.V.). W.E. är en senior klinisk forskare vid Forskningsstiftelsen - Flandern (FWO Vlaanderen). Stammen UTI89-lux var en generös gåva från Prof. Seeds laboratorium13.

Alla djurförsök utfördes i enlighet med Europeiska unionens råds råds riktlinjer och godkändes av KU Leuvens djuriska kommitté (P158/2018).
1. Odlingsbakterier (anpassade från7,13,14)
<ol><li>Förberedelse<ol>
<li>Välj en självlysande UPEC-stam som bäst passar de experimentella behoven. OBS: Här valdes den kliniska cystitisolatet, UTI89 (E. coli), på grund av dess uropatogen...

<ol>
	<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+urinary+tract+infections:+incidence,+morbidity,+and+economic+costs.">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).</li><li>O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+vaccine+development+for+the+treatment+and+prevention+of+urinary+tract+infections.">Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections.</a> Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).</li><li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection.">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).</li><li>Carey, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+of+mice+to+model+human+disease:+Practicalities,+implications+and+limitations.">Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations.</a> Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).</li><li>Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+model+systems+for+the+study+of+urinary+tract+infections+and+related+pathologies.">Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).</li><li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+indicators+in+living+mammals.">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+monitoring+of+infectious+diseases+in+living+animals+using+bioluminescence+imaging.">In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging.</a> Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).</li><li>Balsara, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+susceptibility+to+urinary+tract+infection+in+the+spinal+cord-injured+host+with+neurogenic+bladder.">Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).</li><li>Huang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy+mediated+by+methylene+blue+and+potassium+iodide+to+treat+urinary+tract+infection+in+a+female+rat+model.">Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).</li><li>Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+persistent+Escherichia+coli+reservoir+during+the+acute+phase+of+a+bladder+infection.">Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection.</a> Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).</li><li>Hannan, T. J., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+E.+coli+urinary+tract+infection.">A murine model for E. coli urinary tract infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).</li><li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains.">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Nonsteroidal+Anti-inflammatory+Drugs+for+Treatment+of+Uncomplicated+Lower+Urinary+Tract+Infections+in+Women:+A+Meta-analysis.">Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis.</a> Infectious Microbes &amp; Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+bioluminescence+imaging+of+fungal+dissemination+to+the+brain+in+mouse+models+of+cryptococcosis.">Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).</li><li>Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+looking+beyond+the+light.">Bioluminescence imaging: looking beyond the light.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).</li><li>Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancy+between+viable+counts+and+light+output+as+viability+measurements,+following+ciprofloxacin+challenge+of+self-bioluminescent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).</li><li>Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+increases+in+vivo+screening+efficiency+for+antifungal+activity+against+device-associated+Candida+albicans+biofilms.">Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilm+development+on+medically-relevant+foreign+bodies+in+a+mouse+subcutaneous+model+followed+by+bioluminescence+imaging.">Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).</li><li>Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+non-invasive+monitoring+of+pathogen-host+interactions+during+Candida+albicans+biofilm+formation+using+in+vivo+bioluminescence.">Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence.</a> Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).</li></ol>

Fördelar med BLI jämfört med CFU-räkningar Longitudinella data En stor nackdel med den traditionella metoden att räkna CFU för att kvantifiera den mikrobiella bördan är kravet på homogenata organ efter slakt, vilket endast ger en tvärsnittsdatapunkt per djur. Omvänt möjliggör BLI icke-invasiv longitudinell uppföljning av infekterade djur. Djuren kan avbildas 2 till 3 gånger om dagen, vilket ger detaljerad inblick i infektionens kinetik. Dessutom minskar upprepade åtgärder ...

Urinvägsinfektioner (UTI) är bland de vanligaste bakteriella infektionerna hos människor. Nästan hälften av alla kvinnor kommer att uppleva en symptomatisk UTI under sin livstid1. Infektioner som är begränsade till urinblåsan kan ge upphov till urinvägssymtom såsom ökning av urinfrekvens, brådskande, hematuri, inkontinens och smärta. När infektionen stiger upp till övre urinvägarna utvecklar patienter pyelonefrit, med sjukdom, feber, frossa och ryggsmärta. Dessutom lider upp till 20% av patienterna med UTI av återkommande infektioner som resulterar i en dramatisk minskning avantibiotikakänsligheten 2,3,4. Under de senaste åren har det funnits ett växande intresse för nya terapier för behandling och förebyggande av återkommande UTI. Trots en bättre förståelse för den medfödda och adaptiva immuniteten hos nedre urinvägarna och av de bakteriella virulensfaktorer som är nödvändiga för invasion och kolonisering, har inga radikala förändringar i behandlingssystemet översatts till den dagliga urologiska praktiken2. För att studera UTI-patogenes och mottaglighet in vivoär en reproducerbar och icke-invasiv analys oumbärlig.
Flera djur UTI-modeller har beskrivits allt från nematoder till primater, men murinmodellen används främst5,6. Denna modell består av transuretral kateterisering av (kvinnliga) möss och efterföljande instillation av en bakteriell suspension, oftast uropathogen escherichia coli (UPEC), direkt i urinblåsan lumen7. Efter inokulering har bakteriebelastningen traditionellt kvantifierats genom att bestämma kolonibildande enheter (CFU). Denna teknik kräver att man offrar djur för att erhålla homogenater och seriella utspädningar efter döden, vilket begränsar datautmatningen och reproducerbarheten. Dessutom är longitudinell uppföljning av bakteriebelastningen hos enskilda djur inte möjlig med denna teknik.
År 1995 föreslog Contag et al. användningen av bioluminescerande taggade patogener för att övervaka sjukdomsprocesser hos levande djur8,9. Sedan dess har bioluminescensavbildning (BLI) tillämpats på många infektionsmodeller som hjärnhinneinflammation, endokardit, osteomyelit, hud- och mjukvävnadsinfektioner etc.10,11,12. I murine UTI-modellen kan en UPEC-stam med komplett lux operon (luxCDABE) från Photorhabdus luminescens användas13. En enzymatisk reaktion katalyseras av bakteriell luciferas som är beroende av oxidation av långkedjiga aldehyder som reagerar med reducerad flavinmonukleotid i närvaro av syre, vilket ger den oxiderade flavinen, en långkedjig fettsyra och ljus12. Lux operon kodar för luciferas och andra enzymer som krävs för syntesen av substraten. Därför kommer alla metaboliskt aktiva bakterier kontinuerligt att avge blått grönt (490 nm) ljus utan att behöva injicera ett exogent substrat12. Fotoner som avges av lux-märktabakterier kan fångas med hjälp av mycket känsliga, kylda laddningskopplade enhetskameror (CCD).
Användningen av bioluminescerande bakterier i en modell för UTI möjliggör longitudinell, icke-invasiv kvantifiering av bakteriebelastningen, vilket utelämnar behovet av att offra djur vid fasta tidpunkter under uppföljningen för CFU-bestämning. Trots det stora utbudet av möjligheter, som samlar bevis för robustheten hos denna BLI-teknik inom andra områden och dess fördelar jämfört med klassiska modeller av UTI, har den inte genomförts i stor utsträckning i UTI-forskningen. Protokollet som presenteras här ger en detaljerad steg-för-steg-guide och belyser fördelarna med BLI för all framtida UTI-forskning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3925</td>
			<td>for in vitro imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap ISIS</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>hair trimmer, with GT608 cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer</td>
			<td>Harvard apparatus limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 100 mg/mL</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte Autoguard 24 GA</td>
			<td>BD</td>
			<td>382912</td>
			<td>Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6J mice</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropsense 16</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>Trinean</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Gibco</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>REF 14040-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% denaturated 5L</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>85825360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50ml cellstart</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 &#181;L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26203</td>
			<td>to ensure slow bacterial instillation of 50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6174.1</td>
			<td>holder: Art. No. 6189.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-Vet 1000mg/g</td>
			<td>Dechra Veterinary products</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>REF 124262</td>
			<td>imaging device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine solution 50 mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BLI acquisition software, version 4.7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L3022</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth with agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L2897</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish Sterilin 90mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>to fill with LB agar supplemented with Km</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Culture flask 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLW1141/08-20EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide 200 Trinean</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>701-2007</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTI89-lux</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generous gift from Prof. Seed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>444-1372</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging

Urinvägsinfektioner (UTI) rankas bland de vanligaste bakteriella infektionerna hos människor och behandlas rutinmässigt med empiriska antibiotika. På grund av ökad mikrobiell resistens har dock effekten av de mest använda antibiotika minskat. För att hitta alternativa behandlingsalternativ finns det ett stort behov av en bättre förståelse för UTI-patogenesen och de mekanismer som bestämmer UTI-mottaglighet. För att undersöka detta i en djurmodell är en reproducerbar, icke-invasiv analys för att studera UTI:s förlopp oumbärlig.
I åratal har guldstandarden för uppräkning av bakteriebelastning varit bestämning av kolonibildande enheter (CFU) för en viss provvolym. Denna teknik kräver post-mortem organ homogenater och seriella utspädningar, begränsa datautmatning och reproducerbarhet. Som ett alternativ blir bioluminescensavbildning (BLI) populär för att bestämma bakteriebelastningen. Märkning av patogener med lux operon möjliggör känslig detektion och kvantifiering på ett icke-invasivt sätt, vilket möjliggör longitudinell uppföljning. Hittills är antagandet av BLI i UTI-forskning fortfarande begränsat.
Detta manuskript beskriver den praktiska implementeringen av BLI i en mus urinvägsinfektion modell. Här finns en steg-för-steg-guide för odling av bakterier, intravesisk instillation och avbildning. In vivo-korrelationen med CFU undersöks och ett proof-of-concept tillhandahålls genom att jämföra bakteriebelastningen hos obehandlade infekterade djur med antibiotikabehandlade djur. Dessutom diskuteras de fördelar, begränsningar och överväganden som är specifika för genomförandet av BLI i en in vivo UTI-modell. Genomförandet av BLI inom UTI-forskningsområdet kommer i hög grad att underlätta forskning om patogenesen vid UTI och upptäckten av nya sätt att förebygga och behandla UTI.

In vivo BLI korrelerar med CFU av inokulat vid instillation. För att utvärdera detektionsgränsen för BLI in vivo och korrelationen med CFU av inokulat, infekterades möss med olika koncentrationer av UTI89-lux och PBS som en negativ kontroll. Före instillation skannades oinfekterade djur för att bestämma bakgrunden luminiscens. Efterföljande bilder erhölls omedelbart efter instillationen (figur 1A). Efter instillatione...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging at JoVE.com

Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

Detta manuskript beskriver intravesical administration av uropathogenic bakterier med en lux operon att inducera en urinvägsinfektion hos möss och efterföljande longitudinella in vivo analys av bakteriell belastning med hjälp av bioluminescens imaging.

Longitudinell uppföljning av urinvägsinfektioner och deras behandling hos möss med bioluminescensavbildning

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

Uppräkningen av kolonibildande enheter begränsade reproducerbarheten av forskning inom UTI-området. Bioluminescensavbildning kommer att utvecklas in vivo UTI forskning om urinblåsan fysiologi, UTI patogenes och mottaglighet. Bioluminescensavbildning möjliggör longitudinell uppföljning med realtidsinsikt i infektionens utveckling.Dessutom minskar det drastiskt antalet djur som behövs. Bioluminescensavbildning underlättar forskning om återkommande eller kroniska infektioner, som är vanliga hos människor. Dessutom kan forskare identifiera stigande infektioner eller spridning till blodet med hjälp av bioluminescensavbildning.Få enstaka kolonier genom att strimla ut glycerolbeståndet av bakterier med en inokuleringsslinga på LB-plattor kompletterade med kanamycinsulfat och odling över natten vid 37 grader Celsius. Fyll ett sterilt 14 milliliter polystyren runt bottenrör, med dubbla snäpplock med fem milliliter LB-buljong kompletterad med kanamycinsulfat. Välj en enda bakteriekoloni med en inokuleringsslinga och lägg till detta i LB-buljongen.Virvel i 10 sekunder för att säkerställa korrekt blandning. Kultur statiskt med snap cap i öppet läge vid 37 grader Celsius över natten. Efter inkubationen virvlar du röret i 10 sekunder för att säkerställa korrekt homogenisering av bakteriekulturen.Gör en subkultur i Erlenmeyer genom att tillsätta 25 mikroliter av bakteriesuspensionen till 25 milliliter färsk LB-medium utan antibiotika. Stäng Erlenmeyer och kultur statiskt över natten. På installationsdagen häll kulturen från Erlennmeyer i ett 50 milliliter odlingsrör och centrifug.Dekantera supernatanten och återanvänd bakteriepelleten i 10 milliliter steril PBS. Virvla röret igen i 10 sekunder. Välj inokulatets experimentella koncentration och bestäm motsvarande OD vid 600 nanometer med hjälp av standardkurvan.Tillsätt en milliliter av den återsuspenderade bakteriekulturen i nio milliliter steril PBS och justera tills önskad OD 600 nanometer har uppnåtts. Montera en steril 24-gauge angiocatheter spets på en 100-mikroliter spruta. Fyll sprutan med den beredda bakterielösningen.Placera ett djur på en arbetsyta i supinläge och behåll en stabil isofluranbedövning med hjälp av en noskon under installationen. Applicera ögonsalvan. Utvisa resturin genom att applicera mild komprimering och göra cirkulära rörelser på den suprapubiska regionen och rengör sedan underlivet med 70%etanol.Smörj kateterspetsen med normal saltlösning. Sätt pekfingret på den icke-dominerande handen på buken och tryck den försiktigt uppåt. Starta kateteriseringen av urinröret vertikalt i 90 graders vinkel.När motstånd påträffas, luta det horisontellt innan du sätter in det ytterligare. Utför en långsam installation av 50 mikroliter av bakteriell inokulat. Efter installationen, håll sprutan och katetern på plats i några sekunder till och dra sedan långsamt tillbaka för att förhindra läckage.Använd en kateter per experimentell grupp. Placera djuret i en supin position i noskonen för att förbereda det för avbildning och förbered det för avbildning med en kateter per experimentell grupp. Administrera vid behov antibiotika eller experimentella läkemedel, som nämns i textmanuskriptet.Öppna BLI-anskaffningsprogrammet och klicka på Initialize i bildåtergivningsenheten för att testa kameran och scenstyrenhetssystemet och för att kyla den laddningskopplade enhetskameran till minus 90 grader Celsius. Klicka på Förvärv, AutoSave To.Select Luminescence och Fotografi. Kontrollera standardinställningarna för självlysande genom att ställa in excitationsfiltret på Blockera och avgasfilter till Öppna.Ställ in exponeringstiden för auto när du tar den första bilden. För in vivo-mätningar och starka signaler ställer du in exponeringstiden på cirka 30 sekunder. Minska exponeringstiden om en varning visas på grund av en mättad bild.Välj mellanlagerplats, F/stop en och välj rätt FOV. Ställ in ämneshöjden på en centimeter vid avbildning av möss. Avbilda upp till åtta miles samtidigt och separera djuren med hjälp av ljusbaffeln för att förhindra reflektion.Stäng dörren och klicka på Hämta för att starta bildsekvensen och fyll sedan i detaljerad information om experimentet. Ta bort möss från bildkammaren och returnera dem till deras bur. Kontrollera för fullständig återhämtning efter anestesi och sätt sedan tillbaka burarna till de ventilerade racken till nästa bildcykel.Starta bildprogrammet och ladda den experimentella filen genom att klicka på Bläddra. Använd verktygspaletten för att justera bildens färgskala. Använd ROI-verktygen för att rita en region av intresse för bilden, se till att den är tillräckligt stor för att täcka hela området och använda samma dimensioner för alla bilder.Klicka sedan på ROI-mätning för att kvantifiera ljusintensiteten. Efterföljande bilder av möss som erhållits omedelbart efter installationen visade att var robust detekterbara över 20,000 kolonibildande enheter, och en linjär korrelation mellan koloniformningsenheterna i inokulat och bioluminescens in vivo fastställdes. Den naturliga utvecklingen av en urinvägsinfektion studerades i en kontrollgrupp som inte fick någon behandling.Effekten av antibiotikabehandling på infektion kinetik visualiserades i detalj i en grupp antibiotikabehandlade djur. En omedelbar minskning av bakteriebelastningen, mätt med totalt fotonflöde, sågs efter den första dosen enrofloxacin. Inget av de behandlade djuren hade en efterföljande ökning av bakteriebelastningen.Den totala bakteriebelastningen hos varje djur beräknades med hjälp av området under logens kurva omvandlat totalt fotonflöde, vilket visar en betydande skillnad mellan djur som behandlats med Enrofloxacin och obehandlade djur under loppet av 10 dagar. Dessa resultat ger bevis på konceptet att BLI kan användas för att utvärdera skillnader i UTI infektion kinetik. Bioluminescensavbildning är en icke-invasiv teknik som kan kombineras med andra metoder såsom regelbunden insamling av urinprover för bakteriell eller biokemisk analys eller för experimenten.Här har vi visat att bioluminescensavbildning är ett kraftfullt verktyg för att utvärdera nya terapeutiska strategier om sjukdomsförloppet för urinvägsinfektioner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Transuretral Induktion av Mouse Urinvägsinfektion

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Använda luciferas till bild bakteriella infektioner hos möss

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Bioluminescens Avbildning av NADPH-oxidas aktivitet i olika djurmodeller

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodalitet Imaging av<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektioner hos möss

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Långsiktig Kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway infektion hos möss

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Bioluminescence Imaging för att upptäcka sent stadium Infektion av afrikansk sömnsjuka

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinvägsinfektion i en liten djurmodell: transuretral kateterisering av manliga och kvinnliga möss

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Undersökning av Antimicrobial Blue Ljusterapi för multiresistent Acinetobacter baumannii Burn Infektioner Använda Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

En Multimodal Imaging strategi baserad på Micro-CT och fluorescens molekylär tomografi för längsgående bedömning av Bleomycin-inducerad lungfibros hos möss

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolering av enda intracellulära bakteriella samhällen som genereras från en murin modell av urinvägsinfektion för nedströms Single-cell analys

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...