Name: longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging
Uploaded: 2021-06-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging at JoVE.com

Bu çalışma Araştırma Vakfı tarafından desteklendi - Flanders (FWO Vlaanderen; G0A6113N), KU Leuven Araştırma Konseyi (C1-TRPLe; T.V. ve W.E.) ve VIB (T.V.'ye). W.E., Flanders (FWO Vlaanderen) Araştırma Vakfı'nın kıdemli klinik araştırmacısıdır. UTI89-lux türü, Prof. Seed'in laboratuvarından cömert bir hediyeydi13.

Tüm hayvan deneyleri Avrupa Birliği Toplum Konseyi yönergelerine uygun olarak yapılmış ve KU Leuven Hayvan Etik Komitesi (P158/2018) tarafından onaylanmıştır.
1. Kült bakteriler(7,13,14'tenuyarlanmıştır)
<ol><li>Hazırlık<ol>
<li>Deneysel ihtiyaçlara en uygun parlak upec suşu seçin. NOT: Burada, klinik sistit izole, UTI89 (E. coli), hem insanlarda hem de kemirgenlerde ?...

<ol>
	<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+urinary+tract+infections:+incidence,+morbidity,+and+economic+costs.">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).</li><li>O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+vaccine+development+for+the+treatment+and+prevention+of+urinary+tract+infections.">Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections.</a> Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).</li><li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection.">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).</li><li>Carey, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infection+of+mice+to+model+human+disease:+Practicalities,+implications+and+limitations.">Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations.</a> Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).</li><li>Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+model+systems+for+the+study+of+urinary+tract+infections+and+related+pathologies.">Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).</li><li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+indicators+in+living+mammals.">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+monitoring+of+infectious+diseases+in+living+animals+using+bioluminescence+imaging.">In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging.</a> Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).</li><li>Balsara, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+susceptibility+to+urinary+tract+infection+in+the+spinal+cord-injured+host+with+neurogenic+bladder.">Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).</li><li>Huang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy+mediated+by+methylene+blue+and+potassium+iodide+to+treat+urinary+tract+infection+in+a+female+rat+model.">Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).</li><li>Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+persistent+Escherichia+coli+reservoir+during+the+acute+phase+of+a+bladder+infection.">Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection.</a> Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).</li><li>Hannan, T. J., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+for+E.+coli+urinary+tract+infection.">A murine model for E. coli urinary tract infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).</li><li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains.">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Nonsteroidal+Anti-inflammatory+Drugs+for+Treatment+of+Uncomplicated+Lower+Urinary+Tract+Infections+in+Women:+A+Meta-analysis.">Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis.</a> Infectious Microbes &amp; Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+bioluminescence+imaging+of+fungal+dissemination+to+the+brain+in+mouse+models+of+cryptococcosis.">Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).</li><li>Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+looking+beyond+the+light.">Bioluminescence imaging: looking beyond the light.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).</li><li>Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancy+between+viable+counts+and+light+output+as+viability+measurements,+following+ciprofloxacin+challenge+of+self-bioluminescent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).</li><li>Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+increases+in+vivo+screening+efficiency+for+antifungal+activity+against+device-associated+Candida+albicans+biofilms.">Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li><li>Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilm+development+on+medically-relevant+foreign+bodies+in+a+mouse+subcutaneous+model+followed+by+bioluminescence+imaging.">Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).</li><li>Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+non-invasive+monitoring+of+pathogen-host+interactions+during+Candida+albicans+biofilm+formation+using+in+vivo+bioluminescence.">Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence.</a> Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).</li></ol>

BLI'nin CFU sayılarına göre avantajları Boyuna veriler Mikrobiyal yükü ölçmek için geleneksel CFU sayma yönteminin en büyük dezavantajı, hayvan başına sadece bir kesitsel veri noktası sağlayan ölüm sonrası organ homojenatlarının gereksinimidir. Tersine, BLI enfekte hayvanların invaziv olmayan boyuna takibini sağlar. Hayvanlar günde 2 ila 3 kez görüntülenebilir ve enfeksiyonun kinetiği hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Ek olarak, aynı hayvanın tekrarlanan ...

İdrar yolu enfeksiyonları (UTI) insanlarda en sık görülen bakteriyel enfeksiyonlar arasındadır. Tüm kadınların neredeyse yarısı yaşamları boyunca semptomatik bir UTI yaşayacaktır1. Mesane ile sınırlı enfeksiyonlar idrar sıklığında artış, aciliyet, hematüri, idrar kaçırma ve ağrı gibi idrar semptomlarına yol açabilir. Enfeksiyon üst idrar yoluna yükseldiğinde, hastalar halsizlik, ateş, titreme ve sırt ağrısı ile pyelonenfrit geliştirir. Ayrıca, UTI'li hastaların% 20'sine kadarı tekrarlayan enfeksiyonlardan muzdariptir ve antibiyotik duyarlılığında dramatik bir azalmaya neden olan2,3,4. Son yıllarda, tekrarlayan UTI'nin tedavisi ve önlenmesi için yeni tedavilere ilgi artmaktadır. Alt idrar yollarının doğuştan gelen ve uyarlanabilir bağışıklığının ve istila ve kolonileşme için gerekli bakteriyel virülans faktörlerinin daha iyi anlaşılmasına rağmen, tedavi rejiminde radikal bir değişiklik günlük ürolojik uygulamaya çevrilmemiştir2. UTI patogenezini ve duyarlılığını vivoincelemek için tekrarlanabilir ve invaziv olmayan bir test vazgeçilmezdir.
Nematodlardan primatlara kadar birçok hayvan UTI modeli tanımlanmıştır, ancak murine modeli ağırlıklı olarak5,6. Bu model, (dişi) farelerin transüretral kateterizasyonu ve daha sonra bakteriyel süspansiyonun, en yaygın olarak üropatojenik Escherichia coli'nin (UPEC), doğrudan mesane lümenine7. Aşılamadan sonra, bakteri yükü geleneksel olarak koloni şekillendirme üniteleri (CFU) belirlenerek ölçülmüştir. Bu teknik, hayvanların ölüm sonrası organ homojenatları ve seri seyreltmeler elde etmesini, veri çıkışını ve tekrarlanabilirliğini sınırlamasını gerektirir. Ayrıca, bireysel hayvanlarda bakteri yükünün boyuna takibi bu teknik kullanılarak mümkün değildir.
1995 yılında Contag ve arkadaşları, canlı hayvanlarda hastalık süreçlerini izlemek için biyolüminesan etiketli patojenlerin kullanılmasınıönerdi 8,9. O zamandan beri, biyolüminesans görüntüleme (BLI) menenjit, endokardit, osteomiyelit, cilt ve yumuşak doku enfeksiyonları gibi çok sayıda enfeksiyon modeline uygulanmıştır10,11,12. Murine UTI modelinde, Photorhabdus lüminesanslarından tam lüks operon (luxCDABE) ile bir UPEC suşukullanılabilir 13. Enzymatic reaksiyon, oksijen varlığında azaltılmış flavin mononükleotid ile reaksiyona giren uzun zincirli aldehitlerin oksidasyonuna bağlı olan bakteriyel luciferaz tarafından katalize edilir, oksitlenmiş flavin, uzun zincirli bir yağ asidi ve ışık12verir. Lüks operon, luciferaz ve substratların sentezi için gerekli diğer enzimler için kodlar. Bu nedenle, metabolik olarak aktif olan tüm bakteriler, eksojen bir substratın enjeksiyonuna gerek kalmadan sürekli olarak mavi yeşil (490 nm) ışık yayar12. Lüksetiketli bakterilerin yaydığı fotonlar, son derece hassas, soğutulmuş şarj bağlantılı cihaz (CCD) kameralar kullanılarak yakalanabilir.
Biyolüminesan bakterilerin UTI için bir modelde kullanılması, bakteri yükünün boyuna, invaziv olmayan niceliğine izin verir ve CFU tayini için takip sırasında sabit zaman noktalarında hayvanları kurban etme ihtiyacını atlar. Bu BLI tekniğinin diğer alanlardaki sağlamlığı ve klasik UTI modellerine göre avantajları için kanıt biriktiren çok çeşitli olanaklara rağmen, UTI araştırmasında yaygın olarak uygulanmamıştır. Burada sunulan protokol, ayrıntılı bir adım adım kılavuz sağlar ve BLI'nin gelecekteki tüm UTI araştırmaları için avantajlarını vurgular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3925</td>
			<td>for in vitro imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aesculap ISIS</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>hair trimmer, with GT608 cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer</td>
			<td>Harvard apparatus limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 100 mg/mL</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Enrofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte Autoguard 24 GA</td>
			<td>BD</td>
			<td>382912</td>
			<td>Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6J mice</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropsense 16</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>Trinean</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Gibco</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>REF 14040-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% denaturated 5L</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>85825360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50ml cellstart</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 &#181;L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26203</td>
			<td>to ensure slow bacterial instillation of 50 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6174.1</td>
			<td>holder: Art. No. 6189.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-Vet 1000mg/g</td>
			<td>Dechra Veterinary products</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>REF 124262</td>
			<td>imaging device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycine solution 50 mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>BLI acquisition software, version 4.7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L3022</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth with agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>REF L2897</td>
			<td>alternatively can be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish Sterilin 90mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>to fill with LB agar supplemented with Km</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Culture flask 250 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLW1141/08-20EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide 200 Trinean</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>701-2007</td>
			<td>to measure OD 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTI89-lux</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generous gift from Prof. Seed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>444-1372</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal follow-up of urinary tract infections and their treatment in mice using bioluminescence imaging

İdrar yolu enfeksiyonları (UTI) insanlarda en sık görülen bakteriyel enfeksiyonlar arasında yer almaktadır ve rutin olarak ampirik antibiyotiklerle tedavi edilmektedir. Bununla birlikte, artan mikrobiyal direnç nedeniyle, en çok kullanılan antibiyotiklerin etkinliği azaldı. Alternatif tedavi seçenekleri bulmak için, UTI patogenezinin ve UTI duyarlılığını belirleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına büyük ihtiyaç vardır. Bunu bir hayvan modelinde araştırmak için, UTI'nin seyrini incelemek için tekrarlanabilir, invaziv olmayan bir test vazgeçilmezdir.
Yıllardır, bakteri yükünün numaralandırması için altın standart, belirli bir numune hacmi için Koloni Şekillendirme Birimlerinin (CFU) belirlenmesi olmuştur. Bu teknik, ölüm sonrası organ homojenasyonları ve seri seyreltmeler gerektirir, veri çıkışını ve tekrarlanabilirliği sınırlar. Alternatif olarak, biyolüminesans görüntüleme (BLI) bakteri yükünü belirlemek için popülerlik kazanıyor. Patojenlerin lüks bir operon ile etiketlenmesi, hassas algılama ve nicelemenin invaziv olmayan bir şekilde sağlanmasına izin verir, böylece boyuna takip sağlar. Şimdiye kadar, UTI araştırmalarında BLI'nin benimsenmesi sınırlı olmaya devam ediyor.
Bu makalede fare idrar yolu enfeksiyon modelinde BLI'nin pratik uygulaması açıklanmaktadır. Burada bakterileri kültleme, intravesik aşılama ve görüntüleme için adım adım bir rehber sağlanmaktadır. CFU ile in vivo korelasyon incelenir ve tedavi edilmemiş enfekte hayvanların bakteri yükünün antibiyotikle tedavi edilen hayvanlarla karşılaştırılmasıyla bir kavram kanıtı sağlanır. Ayrıca, bir in vivo UTI modelinde BLI uygulamasına özgü avantajlar, sınırlamalar ve hususlar tartışılmıştır. BLI'nin UTI araştırma alanında uygulanması, UTI patogenezinin araştırılmasını ve UTI'yi önlemenin ve tedavi etmenin yeni yollarının keşfedilmesini büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.

In vivo BLI, aşılama anında inoculumun CFU'su ile ilişkilidir. Vivo BLI'nin algılama sınırını ve inoculumun CFU ile korelasyonunu değerlendirmek için, farelere negatif kontrol olarak farklı UTI89-lux ve PBS konsantrasyonları bulaştı. Aşılamadan önce, enfekte olmayan hayvanlar arka plan lüminesansını belirlemek için tarandı. Sonraki görüntüler aşılamadan hemen sonra elde edildi (Şekil 1A). UTI89-...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging at JoVE.com

Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

Bu makalede, farelerde idrar yolu enfeksiyonuna neden olacak lüks bir operon ile üropatojenik bakterilerin intravesik yönetimi ve daha sonra biyolüminesans görüntüleme kullanılarak bakteri yükünün uzunlamasına in vivo analizi açıklanmaktadır.

Biyolüminesans Görüntüleme Kullanan Farelerde İdrar Yolu Enfeksiyonlarının Boyuna Takibi ve Tedavileri

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

Koloni oluşturan birimlerin numaralandırılması, UTI alanındaki araştırmaların tekrarlanabilirliğini sınırlıyordu. Biyolüminesans görüntüleme mesane fizyolojisi, UTI patogenez ve duyarlılık üzerine vivo UTI araştırmalarında ilerleyecektir. Biyolüminesans görüntüleme, enfeksiyonun evrimi hakkında gerçek zamanlı içgörü ile boyuna takip sağlar.Ayrıca, ihtiyaç duyulan hayvan sayısını büyük ölçüde azaltır. Biyolüminesans görüntüleme, insanlarda sık görülen tekrarlayan veya kronik enfeksiyonlar üzerine araştırmaları kolaylaştırır. Ek olarak, araştırmacılar biyolüminesans görüntüleme kullanarak artan enfeksiyonları veya kana yayılmayı tanımlayabilirler.Kanamycin sülfat ile desteklenmiş LB plakalarında bir aşılama döngüsü ile bakteri gliserol stokunu çizgileyarak ve bir gecede 37 santigrat derecede kültleme yaparak tek koloniler elde edin. Steril 14 mililitrelik polistiren yuvarlak alt tüpü, kanamycin sülfat ile desteklenmiş beş mililitre LB suyu ile çift konumlu snap kapaklarla doldurun. Aşı döngüsü olan tek bir bakteri kolonisi seçin ve bunu LB suyuna ekleyin.Uygun karıştırmayı sağlamak için 10 saniye boyunca girdap. Bir gecede 37 santigrat derecede açık konumda yapıştırı kapağı ile statik olarak kültür. Kuluçkadan sonra, bakteri kültürünün uygun homojenizasyonunu sağlamak için tüpü 10 saniye boyunca girdaplayın.Antibiyotiksiz 25 mililitre taze LB ortamına 25 mikrolitre bakteri süspansiyonu ekleyerek Erlenmeyer'de bir alt kültür yapın. Erlenmeyer'i ve kültürü statik olarak bir gecede kapatın. Kurulum gününde, Erlennmeyer'deki kültürü 50 mililitrelik bir kültür tüpüne ve santrifüje dökün.Süpernatantı deklare edin ve bakteri peletini 10 mililitre steril PBS'de yeniden dirsindirin. Tüpü 10 saniye boyunca tekrar vorteks edin. Inoculumun deneysel konsantrasyonu seçin ve standart eğriyi kullanarak 600 nanometrede karşılık gelen OD'yi belirleyin.Yeniden dürtülen bakteri kültürünün bir mililitresini dokuz mililitre steril PBS'ye ekleyin ve istenen OD 600 nanometreye ulaşılana kadar ayarlayın. 100 mikroliter şırıngaya steril 24 kalibrelik bir anjiyokater ucu takın. Şırınd'ı hazırlanan bakteri çözeltisi ile doldurun.Bir hayvanı destek pozisyonunda çalışan bir yüzeye yerleştirin ve kurulum sırasında bir burun konisi kullanarak kararlı bir izofluran anestezisi sağlayın. Göz merhemini uygulayın. Hafif sıkıştırma uygulayarak ve suprapubik bölgeye dairesel hareketler yaparak artık idrarı dışarı atın, ardından alt karnı% 70 etanol ile temizleyin.Kateter ucunu normal salin ile yağlayın. İşaret parmağını karın üzerindeki baskın olmayan ele koyun ve hafifçe yukarı doğru itin. Üretranın kateterizasyonunu dikey olarak 90 derecelik bir açıyla başlatın.Dirençle karşılaşıldıktan sonra, daha fazla yerleştirmeden önce yatay olarak eğin. Bakteriyel inoculumun 50 mikrolitresinin yavaş bir kurulumunu gerçekleştirin. Kurulumdan sonra, şırınna ve kateteri birkaç saniye daha yerinde tutun ve ardından sızıntıyı önlemek için yavaşça geri çek.Deney grubu başına bir kateter kullanın. Hayvanı görüntülemeye hazırlamak için burun konisinde bir geri zeka pozisyonunda konumlandırın ve deney grubu başına bir kateter kullanarak görüntülemeye hazırlayın. Gerekirse, metin el yazmasında belirtildiği gibi antibiyotik veya deneysel ilaçlar sanın.BLI alma yazılımını açın ve kamera ve sahne kontrol sistemini test etmek ve şarj bağlantılı cihaz kamerasını eksi 90 santigrat dereceye soğutmak için görüntüleme cihazında Başlat'a tıklayın. Edinme, Otomatik Kaydetme To.Select Luminescence ve Fotoğraf'a tıklayın. Heyecan filtresini Blok ve emisyon filtresini Aç olarak ayarlayarak varsayılan parlaklık ayarlarını denetleyin.İlk görüntüyü çekerken pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın. In vivo ölçümler ve parlak sinyaller için pozlama süresini yaklaşık 30 saniye olarak ayarlayın. Doymuş bir görüntü nedeniyle bir uyarı görüntülenirse pozlama süresini azaltın.Orta binning, F/stop one'ı seçin ve doğru FOV'u seçin. Fareleri görüntülerken konu yüksekliğini bir santimetreye ayarlayın. Görüntü aynı anda beş mile kadar ve yansımayı önlemek için ışık şaşkınlık kullanarak hayvanları ayırın.Kapıyı kapatın ve görüntüleme sırasını başlatmak için Edin'e tıklayın, ardından deney hakkında ayrıntılı bilgi doldurun. Fareleri görüntüleme odasından çıkarın ve kafeslerine geri verin. Anesteziden sonra tam iyileşme olup olmadığını kontrol edin, ardından kafesleri bir sonraki görüntüleme döngüsüne kadar havalandırılan raflara geri verin.Görüntüleme yazılımını başlatın ve Gözat'a tıklayarak deneysel dosyayı yükleyin. Görüntünün renk ölçeğini ayarlamak için araç paletini kullanın. Görüntüye ilgi çekici bir bölge çizmek için yatırım getirisi araçlarını kullanın, alanın tamamını kaplayacak kadar büyük olmasını sağlayın ve tüm görüntüler için aynı boyutları kullanın.Ardından ışık yoğunluğunu ölçmek için yatırım getirisi ölçümüne tıklayın. Kurulumdan hemen sonra elde edilen farelerin sonraki görüntüleri, 20.000 koloni oluşturan ünitenin üzerinde sağlam bir şekilde tespit edilebilen ve inoculumun koloni oluşturan birimleri ile in vivo biyolüminesans arasında doğrusal bir korelasyon kurulduğunu gösterdi. İdrar yolu enfeksiyonunun doğal evrimi, herhangi bir tedavi almayan bir kontrol grubunda çalışılmıştır.Antibiyotik tedavisinin enfeksiyon kinetiği üzerindeki etkisi, antibiyotik tedavisi gören bir grup hayvanda ayrıntılı olarak görselleştirildi. Enrofloksasin'in ilk dozunda bakteriyel yükte, toplam foton akısı ile ölçüldüğünde hemen bir azalma görüldü. Tedavi edilen hayvanların hiçbirinde bakteri yükünde daha sonra bir artış olmadı.Her hayvanın genel bakteri yükü, kütüğün eğrisi altındaki alan kullanılarak hesaplandı ve toplam foton akısını dönüştürdü ve 10 gün boyunca Enrofloksasin ile tedavi edilmeyen hayvanlar arasında önemli bir fark gösterdi. Bu sonuçlar, BLI'nin UTI enfeksiyon kinetiğindeki farklılıkları değerlendirmek için kullanılabileceğinin kavram kanıtını sağlar. Biyolüminesans görüntüleme, bakteriyel veya biyokimyasal analizler veya deneyler için idrar örneklerinin düzenli olarak toplanması gibi diğer yöntemlerle birleştirilebilen noninvaziv bir tekniktir.Burada biyolüminesans görüntülemenin idrar yolu enfeksiyonlarının hastalık seyri üzerine yeni terapötik stratejileri değerlendirmek için güçlü bir araç olduğunu gösterdik.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Transüretral İndüksiyon Fare İdrar Yolu Enfeksiyonu

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Farklı Hayvan Modelleri NADPH Oksidaz Aktivitesinin Biyoparlaklık Görüntüleme

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D modelli Görüntüleme<em&gt; Citrobacter rodentium</emFarelerde&gt; Enfeksiyonlar

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

İdrar yolu enfeksiyonu küçük bir hayvan modeli: erkek ve dişi farelerin transüretral Kateterizasyon

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Çok ilaca dirençli için Antimikrobiyal Mavi Işık Tedavisinin Vivo İncelenmesinin Acinetobacter baumannii Biyoparlaklık ımaging&#39;i kullanarak Enfeksiyonlar Yanık

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Yaklaşım Imaging Multimodal Bleomycin kaynaklı akciğer fibrozis farelerde boyuna değerlendirmesi için mikro-CT ve floresan moleküler tomografi dayalı

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

İdrar yolu enfeksiyonu aşağı akım tek hücreli analiz için bir fare modelinden oluşturulan tek hücre içi bakteriyel toplulukların yalıtım

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...