Name: an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth at JoVE.com

Vi vil gerne takke Julia Farnan, Kayla Green og Tiziana DeAngelis for deres tekniske assistance. Dette arbejde blev delvist støttet af Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) og W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).

Denne protokol blev godkendt og følger retningslinjerne for dyrepleje af Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Nu/Nu athymiske hunmus (6-8 uger gamle) blev anvendt i denne undersøgelse.
1. Intrakraniel injektion af tumorceller
<ol><li>Steriliser alt udstyr (pincet, saks, sutureringssaks, håndbor) under en tør cyklus af en autoklave i op til 45 minutter i steriliseringsposer, inklusive en steriliseringsindikator. Hvis du udfører operat...

<ol>
	<li>Watase, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+brain+metastasis-overview+of+disease+state,+treatment+options+and+future+perspectives.">Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives.</a> Cancers. 13 (5), (2021).</li><li>Niikura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+outcomes+and+prognostic+factors+for+patients+with+brain+metastases+from+breast+cancer+of+each+subtype:+a+multicenter+retrospective+analysis.">Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).</li><li>Fong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Parker, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+glioblastoma+organotypic+slice+culture+model+for+study+of+tumor+cell+migration+and+patient-specific+effects+of+anti-invasive+drugs.">A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).</li><li>Chuang, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculture+system+with+an+organotypic+brain+slice+and+3D+spheroid+of+carcinoma+cells.">Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).</li><li>Hohensee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+mediates+the+cross+talk+between+breast+and+glial+cells+in+brain+metastases+leading+to+rapid+disease+progression.">PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression.</a> Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).</li><li>van de Merbel, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+Tissue+culture+model+for+the+assessment+of+individualized+drug+responses+in+prostate+and+bladder+cancer.">An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer.</a> Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).</li><li>Martin, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tissue+slice+culture+system+to+measure+drug-response+rates+of+hepatic+metastatic+colorectal+cancer.">Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer:+a+novel+tumor-promoting+cell+type.">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).</li><li>Lim, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+preserve+the+tumor+microenvironment+and+provide+a+platform+for+drug+response.">Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response.</a> Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain.">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).</li><li>Kyeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+breast+cancer+show+different+spatial+distributions+of+brain+metastases.">Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases.</a> PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).</li><li>Hengel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attributes+of+brain+metastases+from+breast+and+lung+cancer.">Attributes of brain metastases from breast and lung cancer.</a> International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).</li><li>Jackson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters.">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).</li><li>Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+mitochondrial+dynamics+and+trafficking+in+astrocytes.">Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).</li><li>Simone, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+oxidative+stress+alters+miRNA+expression.">Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression.</a> PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).</li><li>Couturier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+that+glioblastoma+recapitulates+a+normal+neurodevelopmental+hierarchy.">Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy.</a> Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).</li><li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).</li><li>Fitzgerald, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+glia+are+recruited+by+highly+proliferative+brain+metastases+of+breast+cancer+and+promote+tumor+cell+colonization.">Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).</li><li>Kondru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ex+Vivo+Brain+Slice+Culture+Model+of+Chronic+Wasting+Disease:+Implications+for+Disease+Pathogenesis+and+Therapeutic+Development.">An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development.</a> Scientific Reports. 10 (1), (2020).</li><li>Abu Samaan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel's+mechanistic+and+clinical+effects+on+breast+cancer.">Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer.</a> Biomolecules. 9 (12), (2019).</li><li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies.">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).</li><li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metastasis+cell+lines+panel:+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines.">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li></ol>

Denne undersøgelse etablerer en ny ex vivo hjernekulturmetode til udplantede xenograft hjernetumorer. Vi viser, at BCBM-celler MDA-MB-231BR-celler intrakranielt injiceret i hjernen hos mus kan overleve og vokse i ex vivo-hjerneskiver . Undersøgelsen testede også intrakranielt injicerede U87MG glioblastom (GBM) celler og fandt også, at disse kræftceller overlever og vokser i hjerneskiver (data ikke vist). Vi mener, at denne model kan udvides ud over BCBM og GBM til andre kræftformer, der let metast...

Brystkræft hjernemetastaser (BCBM) udvikler sig, når celler spredes fra den primære brysttumor til hjernen. Brystkræft er den næsthyppigste årsag til hjernemetastase efter lungekræft, hvor metastaser forekommer hos 10-16% af patienterne1. Desværre forbliver hjernemetastaser uhelbredelige, da >80% af patienterne dør inden for et år efter deres hjernemetastasediagnose, og deres livskvalitet er nedsat på grund af neurologiske dysfunktioner2. Der er et presserende behov for at identificere mere effektive behandlingsmuligheder. Monolags todimensionelle eller tredimensionelle kulturmodeller er de mest almindeligt anvendte metoder til test af terapeutiske midler i laboratoriet. De efterligner imidlertid ikke det komplekse BCBM-mikromiljø, en vigtig drivkraft for tumorfænotype og vækst. Selvom disse modeller er nyttige, fanger de ikke de komplekse tumor-stromale interaktioner, de unikke metaboliske krav og heterogeniteten af tumorerne3. For mere trofast at rekapitulere tumor-stromale interaktioner og mikromiljøheterogenitet er vores gruppe og andre begyndt at generere organotypiske hjernemetastaser "skive" kulturer med patientafledte tumorceller (primære eller metastatiske) eller kræftcellelinjer 4,5,6. Sammenlignet med klassiske in vitro-systemer kan denne kortsigtede ex vivo-model give mere relevante betingelser for screening af nye lægemidler forud for præklinisk vurdering i kohorter af store dyr.
Ex vivo-modeller er blevet konstrueret og med succes anvendt primært til identifikation af vellykkede behandlinger af forskellige kræftformer. De kræver få dages vurdering og kan desuden skræddersys til patientspecifik lægemiddelscreening. For eksempel har human blære- og prostatakræft ex vivo-væv vist et dosisafhængigt antitumorrespons af docetaxel og gemcitabin7. Lignende kolorektal carcinom ex vivo væv blev udviklet til at screene kemoterapeutiske lægemidler Oxaliplatin, Cetuximab og Pembrolizumab8. Denne applikation er blevet anvendt i vid udstrækning i kræft i bugspytkirtlen, i betragtning af den væsentlige interaktion mellem stromalmiljøet og de genotypiske og fænotypiske egenskaber ved bugspytkirtel duktal adenocarcinom 9,10. Desuden er sådanne organotypiske modeller blevet udviklet til lignende screeninger i hoved-, nakke-, mave- og brysttumorer11,12.
Her genereres en ex vivo hjerneskivemodel af xenograftede brystkræft hjernemetastatiske tumorceller i deres mikromiljø. Mus blev intrakranielt injiceret med brystkræft hjerne metastatisk hjerne trofisk MDA-MB-231BR celler13 i hjernebarken parietal lobe - et almindeligt sted for TNBC metastase14,15 og fik lov til at udvikle tumorer. Hjerneskiver blev genereret fra disse xenograftede dyr og opretholdt ex vivo som organotypiske kulturer som beskrevet16,17. Denne nye ex vivo-model gør det muligt at analysere BCBM-cellens vækst i hjernens parenkym og kan bruges til at teste terapeutiske midler og strålingseffekter på tumorceller i hjernens mikromiljø.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, slip tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G1/2 Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microscope and LUMAVIEW software</td>
			<td>Etaluma</td>
			<td>LS720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (GEM21)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-210-685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt sable paintbrush, Size #5/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Wax</td>
			<td>ModoMed</td>
			<td>DYNJBW25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain injection Syringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP510-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase 3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14220S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060(95-0043)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-805a (1001-042)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sable paintbrush #2/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-H2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Corning cellgrow</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E and KI-67</td>
			<td>Jefferson Core Facility Pathology staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>YCQ2851920086082DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Just for mice Stereotaxic Frame</td>
			<td>Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).</td>
			<td>72-6049, 72-6044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231BR cells</td>
			<td>Kindly provided by Dr. Patricia Steeg</td>
			<td>Ref 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging device</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>IVIS 200 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging software</td>
			<td>Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).</td>
			<td>Living Image Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Tecan Spark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS reagent</td>
			<td>Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution</td>
			<td>(Cat:G3582)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu/Nu athymic mice</td>
			<td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>145140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Suture</td>
			<td>Medex supply</td>
			<td>ETH-8556H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Swab sticks</td>
			<td>DME Supply USA</td>
			<td>Cat: 689286X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade #11 (pk of 100)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula/probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel</td>
			<td>Exelint International</td>
			<td>D29702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Brinkman</td>
			<td>(McIlwain type)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICMORG50 or PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray machine</td>
			<td>Precision 250 kVp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth

Hjernemetastase er en alvorlig konsekvens af brystkræft for kvinder, da disse tumorer er vanskelige at behandle og er forbundet med dårlige kliniske resultater. Prækliniske musemodeller af brystkræft hjernemetastatisk (BCBM) vækst er nyttige, men er dyre, og det er svært at spore levende celler og tumorcelleinvasion i hjernens parenkym. Præsenteret her er en protokol for ex vivo hjerneskivekulturer fra xenograftede mus, der indeholder intrakranielt injicerede brystkræft hjernesøgende klonale underlinjer. MDA-MB-231BR luciferase mærkede celler blev injiceret intrakranielt i hjernen hos Nu/Nu hunmus, og efter tumordannelse blev hjernerne isoleret, skåret og dyrket ex vivo. Tumorskiverne blev afbildet for at identificere tumorceller, der udtrykker luciferase og overvåge deres spredning og invasion i hjerneparenchymen i op til 10 dage. Endvidere beskriver protokollen brugen af time-lapse-mikroskopi til at afbilde tumorcellernes vækst og invasive opførsel efter behandling med ioniserende stråling eller kemoterapi. Tumorcellernes reaktion på behandlinger kan visualiseres ved live-imaging mikroskopi, måling af bioluminescensintensitet og udførelse af histologi på hjerneskiven indeholdende BCBM-celler. Således kan denne ex vivo slice model være en nyttig platform til hurtig test af nye terapeutiske midler alene eller i kombination med stråling for at identificere lægemidler, der er tilpasset til at målrette mod en enkelt patients brystkræft hjernemetastatisk vækst i hjernens mikromiljø.

MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase-celler blev intrakranielt injiceret i højre halvkugle af 4-6 uger gamle Nu/Nu-mus som forklaret ovenfor (figur 1A) og fik lov til at vokse i 12-14 dage, i hvilket tidsrum tumorvækst blev overvåget ved bioluminescensbilleddannelse (figur 1B). Vi injicerede 100.000 kræftceller intrakranielt som rapporteret af andre grupper19, men det er muligt at injicere så lavt som 20.000 celle20. E...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth at JoVE.com

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Vi introducerer en protokol til måling af realtids lægemiddel- og strålingsrespons af brystkræft hjernemetastatiske celler i en organotypisk hjerneskivemodel. Metoderne giver et kvantitativt assay til at undersøge de terapeutiske virkninger af forskellige behandlinger på hjernemetastaser fra brystkræft på en ex vivo-måde inden for hjernens mikromiljøgrænseflade.

En Ex Vivo Brain Slice Model til at studere og målrette brystkræft hjernemetastatisk tumorvækst

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Denne protokol giver mulighed for dannelse af hjernemetastatiske tumorceller og generering af ex vivo hjerneskiver, der muliggør hurtig test af lægemiddeleffektivitet og stråling på en præformeret tumor. Den største fordel ved denne teknik er evnen til hurtigt at teste flere lægemidler eller behandlinger i en fysiologisk relevant indstilling, der opretholder hjerne-tumor-værtsinteraktioner. Denne metode kan hjælpe med at forstå, hvordan hjernens metastatiske celler vokser, overlever og invaderer hjerneparenchymen og forstå hjernetumormikromiljøets rolle i kræftvækst og spredning.Lorela Ciraku og Emily Esquea, begge ph.d.-kandidater fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren. Til at begynde med skal du placere de anæstetiserede mus i en stereotaksisk ramme og immobilisere hovedet ved hjælp af standard ørestænger. Steriliser overfladen af hovedet tre gange ved gentagen skiftevis påføring af jodpinde og 70% ethanol inden snit.Brug en kirurgisk skalpel til at lave et midterlinjesnit på en centimeter i en diagonal vinkel på den imaginære akse, der deler musenes hjerne i to symmetriske halvdele for at udsætte kraniet. Efter at have tørret blod med en vatpind, afbøj huden sideværts for at udsætte injektionsstedet. Brug en 0,73 millimeter burr bit til at trænge ind i kraniet og bore et hul ved hjælp af let tryk og vridningsbevægelse.For at injicere fem mikroliter celler, der stabilt udtrykker GFP luciferase, skal du indsætte en højpræcisionssprøjte til 3,5 millimeter dybde i hjernen. Lad det sætte sig i to minutter, og træk derefter sprøjten op omkring en millimeter. Efter to minutter injiceres langsomt det første halve volumen og venter i yderligere to minutter, før du injicerer resten af volumenet.Efter tre minutter skal du langsomt trække sprøjten. Påfør knoglevoks på injektionsstedet på kraniet og sutur vævet med polypropylensuturer. Overvåg musens opførsel lige efter operationen med jævne mellemrum for at afgøre, om der er behov for særlig behandling, herunder saltvandsinjektion og blød mad, for at hjælpe med hurtig genopretning.For at overvåge tumorvæksten via bioluminescensbilleddannelse skal du først tænde ilt og isofluran på billeddannelsessystemet og tillade begge at blive fordelt til det separate kammer uden for billeddannelsesboksen. Derefter, efter at du har tændt softwaren og initialiseret instrumentet, skal du vælge den passende mulighed for at visualisere og fange hele musekroppen. Overfør derefter musene til kammeret uden for billeddannelsesboksen, der leveres med ilt og isofluran.Når musene er under bedøvelsesvirkningen, injiceres musene intraperitonealt med 200 mikroliter 30 milligram pr. Milliliter luciferin. Placer musene i billedbehandlingskammeret med maven vendt ned mod billedkamrenes næselæbe. Lås kammeret, vælg to minutters eksponering for at starte billeddannelsen, og afslut derefter billeddannelsen.Når du har placeret vævsskæreren i en steril laminær flowhætte, skal du rengøre alle værktøjer og instrumenter med 70% ethanol. Efter aflivning af musen skal du fjerne og placere hjernen hurtigt i iskold saccharose-ACSF-opløsning. Brug en spatel til at overføre hjernen på et ACSF-befugtet filterpapir på et 60 millimeter skållåg.Brug et skarpt, sterilt barberblad til at skære de overskydende dele af hjernen, der ikke indeholder nogen tumor, herunder den nederste del af hjernen, for at bringe hjernens form til en ikke-perfekt terning. Efter at have lagt flere ark ACSF-befugtet filterpapir på skæreplatformen, skal du placere det blokerede væv på filterpapiret. For at skære vævet i 200 til 250 mikrometer tykke sektioner skal du indstille skærestørrelsen til 2 eller 2,5 enheder på udbyderlinealen og begynde at skære.Brug en pensel til at overføre hjerneskiver til en skål, der indeholder saccharose-ACSF, og adskil skiverne under et lysmikroskop ved hjælp af 27-gauge nåle. Identificer de GFP-positive skiver under det fluorescerende mikroskop. Derefter overføres identificerede skiver til en ny 60 millimeter skål indeholdende to til tre milliliter voksne skivemedier ved hjælp af en steril en milliliter brudt pipette med en bred åbning.Overfør derefter tre til fem skiver til hver vævskulturindsats i hver brønd af en seks-brønds plade i sikker afstand. Når du har fjernet det overskydende medium fra insertets overflade, tilsættes en milliliter ligevægtet voksen museskivemedium under hver indsats. Inkuber vævene ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid og 95% fugtighed i 24 timer før billeddannelse.Pipette fem mikroliter på 30 mg pr. milliliter luciferinopløsning i mediet under indsatserne inde i en steril hætte. Placer pladen med seks brønde med låget inde i instrumentets billedkammer under det stationære kamera, og lås kammerdøren. Åbn softwaren, og initialiser instrumentet.Når du har valgt kameraindstillinger, der kun tillader visualisering og optagelse af én brønd pr. billede, skal du placere brønden, der skal afbildes, direkte under kameraet. Brug ROI-værktøjet, tilpas det omkring tumorformen og størrelsen, mål ROI og rapporter de samlede aflæsninger for at kvantificere det bioluminescerende signal for hver tumor på skiven. Når du har bragt pladen tilbage til den sterile laminære strømningshætte, skal du bruge tang til let at løfte indsatsen fra brønden.Efter opsugelse af mediet skal du udskifte mediet med en milliliter frisk medium og placere indsætningen tilbage i brønden. Til de forsøg, hvor skiverne behandles med forskellige forbindelser, såsom hæmmere og metabolitter, skal den passende reagenskoncentration i 1,2 ml hjerneskivemedier fremstilles i et 1,5 milliliter rør og derefter overføre en milliliter reagens til brønden, der indeholder skiven. MDA-MB-231 BR-GFP luciferaseceller blev injiceret i nøgne mus, tumorer fik lov til at vokse, hjerner med tumorer blev dissekeret ud, skåret, dyrket ex vivo, og tumorvækst blev overvåget ved bioluminescensbilleddannelse.H & E-farvning og GFP-positiv fluorescens bekræftede tilstedeværelsen af en tumor i hjerneskiven. Den øgede Ki-67 farvning bekræftede tilstedeværelsen af stærkt proliferative kræftceller. Tumorerne i hjerneskiver, der ikke blev udsat for bestråling, fortsatte med at vokse ex vivo, mens tumorer udsat for bestråling viste en standset vækst.Hjerneskiver indeholdende tumorer blev også overvåget via levende billeddannelse for at visualisere tumorvæksten efter bestrålingsbehandlingen. I overensstemmelse med den bioluminescerende billeddannelse voksede kontrolkræftceller hurtigt, da GFP-intensiteten steg, og cellerne begyndte at invadere hjernens parenkym. I modsætning hertil var kræftcellerne i hjerneskiver behandlet med bestråling cytostatiske, og GFP-intensiteten blev opretholdt.Store multinukleerede kræftceller og en stigning i farvning af DNA-skademarkør i IR-behandlede kræftceller blev påvist. Der blev også påvist en stigning i reaktive astrocytter. Den IR-behandlingsinducerede apoptose blev ikke påvist i de tumorfrie musehjerneskiver.Hjerneskiverne indeholdende tumorer blev behandlet med forskellige koncentrationer af paclitaxel, et kemoterapeutisk lægemiddel. Behandlingen reducerede tumorens størrelse betydeligt efter dag 10 af behandlingen. En stigning i apoptose blev påvist i paclitaxelbehandlede tumorceller.Inhibitorbehandlingen ændrede ikke hjernevævets levedygtighed. Ingen stigning i apoptose blev målt ved spaltet caspase-3-farvning i paclitaxel-behandlet tumorfri musehjerneskive. Når behandlingen med de lægemidler af interesse er afsluttet, kan skiver analyseres for proteinekspression gennem immunocytokemi, omiske undersøgelser eller opnå enkeltcellesuspension, der er egnet til flowcytometri.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

En Portal Vein Injection Model at studere levermetastaser af brystkræft

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellulær og cellulære Lung Model til at studere Tumor metastaser

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging Assays til undersøgelse glioblastom hjerne Tumor stamcelle Migration og Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirus for Tumor-målrettet Immunomodulation: Design og evaluering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Den kliniske anvendelse af Tumor behandling af felter terapi i glioblastom

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinel Intravital Imaging af hjerne tumor celle adfærd som reaktion på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo hæmning af MicroRNA at mindske tumor vækst i mus

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analyse for at studere tumor-makrofag interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation af Ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen og ex vivo karakterisering af tumor Infiltrerende T-celle cytotoksicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...