Name: an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth at JoVE.com

We willen Julia Farnan, Kayla Green en Tiziana DeAngelis bedanken voor hun technische assistentie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) en W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).

Dit protocol is goedgekeurd en volgt de richtlijnen voor dierverzorging door het Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Nu / Nu athymische vrouwelijke muizen (6-8 weken oud) werden gebruikt in deze studie.
1. Intracraniële injectie van tumorcellen
<ol><li>Steriliseer alle apparatuur (pincet, schaar, hechtschaar, handboor) onder een droge cyclus van een autoclaaf gedurende maximaal 45 minuten in sterilisatiezakjes, inclusief een sterilisati...

<ol>
	<li>Watase, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+brain+metastasis-overview+of+disease+state,+treatment+options+and+future+perspectives.">Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives.</a> Cancers. 13 (5), (2021).</li><li>Niikura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+outcomes+and+prognostic+factors+for+patients+with+brain+metastases+from+breast+cancer+of+each+subtype:+a+multicenter+retrospective+analysis.">Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).</li><li>Fong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Parker, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+glioblastoma+organotypic+slice+culture+model+for+study+of+tumor+cell+migration+and+patient-specific+effects+of+anti-invasive+drugs.">A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).</li><li>Chuang, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculture+system+with+an+organotypic+brain+slice+and+3D+spheroid+of+carcinoma+cells.">Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).</li><li>Hohensee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+mediates+the+cross+talk+between+breast+and+glial+cells+in+brain+metastases+leading+to+rapid+disease+progression.">PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression.</a> Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).</li><li>van de Merbel, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+Tissue+culture+model+for+the+assessment+of+individualized+drug+responses+in+prostate+and+bladder+cancer.">An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer.</a> Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).</li><li>Martin, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tissue+slice+culture+system+to+measure+drug-response+rates+of+hepatic+metastatic+colorectal+cancer.">Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer:+a+novel+tumor-promoting+cell+type.">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).</li><li>Lim, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+preserve+the+tumor+microenvironment+and+provide+a+platform+for+drug+response.">Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response.</a> Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain.">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).</li><li>Kyeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+breast+cancer+show+different+spatial+distributions+of+brain+metastases.">Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases.</a> PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).</li><li>Hengel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attributes+of+brain+metastases+from+breast+and+lung+cancer.">Attributes of brain metastases from breast and lung cancer.</a> International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).</li><li>Jackson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters.">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).</li><li>Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+mitochondrial+dynamics+and+trafficking+in+astrocytes.">Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).</li><li>Simone, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+oxidative+stress+alters+miRNA+expression.">Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression.</a> PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).</li><li>Couturier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+that+glioblastoma+recapitulates+a+normal+neurodevelopmental+hierarchy.">Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy.</a> Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).</li><li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).</li><li>Fitzgerald, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+glia+are+recruited+by+highly+proliferative+brain+metastases+of+breast+cancer+and+promote+tumor+cell+colonization.">Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).</li><li>Kondru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ex+Vivo+Brain+Slice+Culture+Model+of+Chronic+Wasting+Disease:+Implications+for+Disease+Pathogenesis+and+Therapeutic+Development.">An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development.</a> Scientific Reports. 10 (1), (2020).</li><li>Abu Samaan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel's+mechanistic+and+clinical+effects+on+breast+cancer.">Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer.</a> Biomolecules. 9 (12), (2019).</li><li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies.">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).</li><li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metastasis+cell+lines+panel:+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines.">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li></ol>

Deze studie stelt een nieuwe ex vivo hersenkweekmethode vast voor geëxplanteerde xenograft hersentumoren. We tonen aan dat BCBM-cellen MDA-MB-231BR-cellen die intracranieel in de hersenen van muizen worden geïnjecteerd, kunnen overleven en groeien in ex vivo hersenplakken. De studie testte ook intracraniaal geïnjecteerde U87MG glioblastoom (GBM) cellen en ontdekte ook dat deze kankercellen overleven en groeien in hersenplakken (gegevens niet getoond). Wij geloven dat dit model kan worden uitgebreid v...

Borstkanker hersenmetastasen (BCBM) ontwikkelen zich wanneer cellen zich verspreiden van de primaire borsttumor naar de hersenen. Borstkanker is de tweede meest voorkomende oorzaak van hersenmetastasen na longkanker, met metastasen die voorkomen bij 10-16% van de patiënten1. Helaas blijven hersenmetastasen ongeneeslijk omdat >80% van de patiënten binnen een jaar na hun diagnose van hersenmetastase sterft en hun kwaliteit van leven is aangetast als gevolg van neurologische disfuncties2. Er is een dringende behoefte om effectievere behandelingsopties te identificeren. Monolaagse tweedimensionale of driedimensionale kweekmodellen zijn de meest gebruikte methoden bij het testen van therapeutische middelen in het laboratorium. Ze bootsen echter niet de complexe BCBM-micro-omgeving na, een belangrijke aanjager van tumorfenotype en groei. Hoewel deze modellen nuttig zijn, vangen ze niet de complexe tumor-stromale interacties, de unieke metabole vereisten en de heterogeniteit van de tumoren3. Om tumor-stromale interacties en micro-omgeving heterogeniteit getrouwer te reconstrueren, zijn onze groep en anderen begonnen met het genereren van organotypische hersenmetastase "slice" -culturen met patiënt-afgeleide tumorcellen (primair of gemetastaseerd) of kankercellijnen 4,5,6. In vergelijking met klassieke in vitro systemen kan dit ex vivo model op korte termijn relevantere voorwaarden bieden voor het screenen van nieuwe therapieën voorafgaand aan preklinische beoordeling in grote diercohorten.
Ex vivo modellen zijn geconstrueerd en met succes gebruikt, voornamelijk voor de identificatie van succesvolle behandelingen van verschillende kankers. Ze vereisen enkele dagen beoordeling en kunnen bovendien worden afgestemd op patiëntspecifieke geneesmiddelenscreening. Bijvoorbeeld, menselijke blaas en prostaatkanker ex vivo weefsels hebben een dosisafhankelijke anti-tumorrespons van docetaxel en gemcitabine7 aangetoond. Vergelijkbare colorectale carcinoom ex vivo weefsels werden ontwikkeld om chemotherapeutische geneesmiddelen Oxaliplatine, Cetuximab en Pembrolizumab 8 tescreenen. Deze toepassing is op grote schaal gebruikt bij alvleesklierkanker, gezien de essentiële interactie tussen de stromale omgeving en de genotypische en fenotypische kenmerken van pancreas ductaal adenocarcinoom 9,10. Bovendien zijn dergelijke organotypische modellen ontwikkeld voor vergelijkbare screenings in hoofd-, nek-, maag- en borsttumoren 11,12.
Hier wordt een ex vivo brain slice model van xeno getransplanteerde borstkanker hersen gemetastaseerde tumorcellen in hun micro-omgeving gegenereerd. Muizen werden intracranieel geïnjecteerd met borstkanker hersen gemetastaseerde hersentrofische MDA-MB-231BR cellen13 in de hersenschors pariëtale kwab - een gemeenschappelijke plaats van TNBC-metastase14,15 en lieten tumoren ontwikkelen. Hersenplakken werden gegenereerd uit deze xenogetransplanteerde dieren en ex vivo onderhouden als organotypische culturen zoals beschreven16,17. Dit nieuwe ex vivo model maakt de analyse van de groei van BCBM-cellen in het hersenparenchym mogelijk en kan worden gebruikt om therapeutische middelen en stralingseffecten op tumorcellen in de micro-omgeving van de hersenen te testen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, slip tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G1/2 Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microscope and LUMAVIEW software</td>
			<td>Etaluma</td>
			<td>LS720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (GEM21)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-210-685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt sable paintbrush, Size #5/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Wax</td>
			<td>ModoMed</td>
			<td>DYNJBW25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain injection Syringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP510-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase 3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14220S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060(95-0043)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-805a (1001-042)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sable paintbrush #2/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-H2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Corning cellgrow</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E and KI-67</td>
			<td>Jefferson Core Facility Pathology staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>YCQ2851920086082DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Just for mice Stereotaxic Frame</td>
			<td>Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).</td>
			<td>72-6049, 72-6044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231BR cells</td>
			<td>Kindly provided by Dr. Patricia Steeg</td>
			<td>Ref 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging device</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>IVIS 200 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging software</td>
			<td>Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).</td>
			<td>Living Image Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Tecan Spark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS reagent</td>
			<td>Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution</td>
			<td>(Cat:G3582)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu/Nu athymic mice</td>
			<td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>145140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Suture</td>
			<td>Medex supply</td>
			<td>ETH-8556H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Swab sticks</td>
			<td>DME Supply USA</td>
			<td>Cat: 689286X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade #11 (pk of 100)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula/probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel</td>
			<td>Exelint International</td>
			<td>D29702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Brinkman</td>
			<td>(McIlwain type)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICMORG50 or PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray machine</td>
			<td>Precision 250 kVp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth

Hersenmetastase is een ernstig gevolg van borstkanker voor vrouwen, omdat deze tumoren moeilijk te behandelen zijn en geassocieerd zijn met slechte klinische resultaten. Preklinische muismodellen van borstkanker hersen gemetastaseerde (BCBM) groei zijn nuttig, maar zijn duur, en het is moeilijk om levende cellen en tumorcel invasie in de hersenen parenchym te volgen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor ex vivo hersenplakculturen van xenogegrafeerde muizen die intracranieel geïnjecteerde borstkanker hersenzoekende klonale sublijnen bevatten. MDA-MB-231BR luciferase gelabelde cellen werden intracranieel geïnjecteerd in de hersenen van Nu / Nu vrouwelijke muizen, en na tumorvorming werden de hersenen geïsoleerd, gesneden en ex vivo gekweekt. De tumorplakken werden in beeld gebracht om tumorcellen te identificeren die luciferase tot expressie brengen en hun proliferatie en invasie in het hersenparenchym gedurende maximaal 10 dagen te volgen. Verder beschrijft het protocol het gebruik van time-lapse microscopie om de groei en het invasieve gedrag van de tumorcellen in beeld te brengen na behandeling met ioniserende bestraling of chemotherapie. De reactie van tumorcellen op behandelingen kan worden gevisualiseerd door live-imaging microscopie, het meten van de intensiteit van bioluminescentie en het uitvoeren van histologie op de hersenschijf die BCBM-cellen bevat. Dit ex vivo slice-model kan dus een nuttig platform zijn voor het snel testen van nieuwe therapeutische middelen alleen of in combinatie met straling om geneesmiddelen te identificeren die zijn gepersonaliseerd om zich te richten op de met gemetastaseerde groei van de hersenen van een individuele patiënt in de micro-omgeving van de hersenen.

MDA-MB-231BR-GFP-Luciferasecellen werden intracranieel geïnjecteerd in de rechterhersenhelft van 4-6 weken oude Nu/Nu-muizen zoals hierboven uitgelegd (figuur 1A) en mochten gedurende 12-14 dagen groeien, gedurende welke tijd de tumorgroei werd gevolgd door bioluminescentiebeeldvorming (figuur 1B). We injecteerden 100.000 kankercellen intracranieel zoals gerapporteerd door andere groepen19, maar het is mogelijk om zo laag als 20.000 cel<...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth at JoVE.com

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

We introduceren een protocol voor het meten van real-time medicijn- en stralingsrespons van borstkanker hersenmetaster gemetastaseerde cellen in een organotypisch hersenplakmodel. De methoden bieden een kwantitatieve test om de therapeutische effecten van verschillende behandelingen op hersenmetastasen van borstkanker op een ex vivo manier binnen de micro-omgevingsinterface van de hersenen te onderzoeken.

Een ex vivo hersenschijfmodel om borstkanker te bestuderen en te targeten Hersen gemetastaseerde tumorgroei

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Dit protocol maakt de vorming van hersenmetastasische tumorcellen en de generatie van ex vivo hersenplakken mogelijk die het mogelijk maken om snel de werkzaamheid van geneesmiddelen en straling op een voorgevormde tumor te testen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om snel meerdere geneesmiddelen of behandelingen te testen in een fysiologisch relevante omgeving die de interacties tussen hersenen en tumor en gastheer handhaaft. Deze methode kan helpen begrijpen hoe hersenmetastasische cellen groeien, overleven en het hersenparenchym binnendringen en de rol van de micro-omgeving van de hersentumor in de groei en verspreiding van kanker begrijpen.De procedure wordt gedemonstreerd door Lorela Ciraku en Emily Esquea, beiden promovendi uit mijn laboratorium. Plaats om te beginnen de verdoofde muizen in een stereotaxisch frame en immobiliseer het hoofd met behulp van standaard oorstaven. Steriliseer het oppervlak van het hoofd driemaal door herhaalde afwisselende toepassing van jodiumswabs en 70% ethanol voorafgaand aan de incisie.Maak met behulp van een chirurgisch scalpel een middellijnincisie van één centimeter onder een diagonale hoek met de denkbeeldige as die de hersenen van de muizen in twee symmetrische helften verdeelt om de schedel bloot te leggen. Na het afvegen van het bloed met een wattenstaafje, buigt u de huid zijdelings af om de injectieplaats bloot te leggen. Gebruik een braambit van 0,73 millimeter om de schedel binnen te dringen en boor een gat met lichte druk en draaiende beweging.Om vijf microliter cellen te injecteren die stabiel GFP luciferase tot expressie brengen, plaatst u een uiterst nauwkeurige spuit tot 3,5 millimeter diepte in de hersenen. Laat het twee minuten bezinken en trek de spuit vervolgens ongeveer een millimeter omhoog. Injecteer na twee minuten langzaam het eerste halve volume en wacht nog twee minuten voordat u de rest van het volume injecteert.Trek na drie minuten langzaam aan de spuit. Breng botwas aan op de injectieplaats op de schedel en hecht het weefsel met polypropyleen hechtingen. Controleer het gedrag van de muis direct na de operatie periodiek om te bepalen of een speciale behandeling, waaronder zoutoplossinginjectie en zacht voedsel, nodig is om snel herstel te helpen.Om de tumorgroei te volgen via bioluminescentiebeeldvorming, schakelt u eerst de zuurstof en het isofluraan op het beeldvormingssysteem in en laat u beide worden gedistribueerd naar de afzonderlijke kamer buiten de beeldvormingsdoos. Kies vervolgens, na het inschakelen van de software en het initialiseren van het instrument, de juiste optie voor het visualiseren en vastleggen van het hele muislichaam. Breng vervolgens de muizen over naar de kamer buiten de beeldvormingsdoos die is voorzien van zuurstof en isofluraan.Zodra de muizen onder de narcose-werking zijn, injecteert u de muizen intraperitoneaal met 200 microliter van 30 milligram per milliliter luciferine. Plaats de muizen in de beeldvormingskamer met de maag naar beneden gericht naar de neuslip van de beeldvormingskamers. Vergrendel de kamer, kies twee minuten tijdsbelichting om de beeldvorming te starten en voltooi vervolgens de beeldvorming.Nadat u de weefselsnijmachine in een steriele laminaire flowkap hebt geplaatst, reinigt u alle gereedschappen en instrumenten met 70% ethanol. Na het euthanaseren van de muis, verwijder en plaats de hersenen snel in ijskoude sucrose-ACSF-oplossing. Breng met behulp van een spatel de hersenen over op een ACSF-bevochtigd filterpapier op een 60 millimeter schoteldeksel.Snijd met een scherp, steriel scheermesje de overtollige delen van de hersenen die geen tumor bevatten, inclusief het onderste deel van de hersenen, om de vorm van de hersenen naar een niet-perfecte kubus te brengen. Nadat u verschillende vellen ACSF-bevochtigd filtreerpapier op het snijplatform hebt geplaatst, plaatst u het geblokkeerde tissue op het filterpapier. Om het weefsel in 200 tot 250 micrometer dikke secties te snijden, stelt u de snijgrootte in op 2 of 2,5 eenheden op de liniaal van de provider en begint u met snijden.Gebruik een verfkwast om hersenplakken over te brengen in een schaal met sucrose-ACSF en scheid de plakjes onder een lichtmicroscoop met behulp van 27-gauge naalden. Identificeer de GFP-positieve plakjes onder de fluorescerende microscoop. Breng vervolgens met behulp van een steriele afgebroken pipet van één milliliter met een brede opening geïdentificeerde plakjes over naar een nieuwe schaal van 60 millimeter met twee tot drie milliliter volwassen plakmedia.Breng vervolgens drie tot vijf plakjes over op elke weefselkweekinzet in elke put van een plaat met zes putten op een veilige afstand. Nadat u het overtollige medium van het oppervlak van de insert hebt verwijderd, voegt u onder elke insert een milliliter gebalanceerd plakmedium voor volwassen muizen toe. Incubeer de weefsels bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 95% vochtigheid gedurende 24 uur vóór beeldvorming.Pipetteer vijf microliter van 30 milligram per milliliter luciferine-oplossing in het medium onder de inzetstukken in een steriele kap. Plaats de zes-putplaat met het deksel in de beeldvormingskamer van het instrument onder de stationaire camera en vergrendel de kamerdeur. Open de software en initialiseer het instrument.Nadat u de camera-instellingen hebt gekozen die visualisatie en opname van slechts één put per beeld mogelijk maken, plaatst u de te fotograferen put direct onder de camera. Gebruik de ROI-tool, pas deze aan rond de vorm en grootte van de tumor, meet de ROI en rapporteer de totale metingen om het bioluminescente signaal van elke tumor op de plak te kwantificeren. Nadat u de plaat terug naar de steriele laminaire flowkap hebt gebracht, gebruikt u een tang om het inzetstuk iets uit de put te tillen.Vervang na het aanzuigen van het medium het medium door één milliliter vers medium en plaats de inzet terug in de put. Voor de experimenten waarbij de plakjes worden behandeld met verschillende verbindingen, zoals remmers en metabolieten, bereidt u de juiste reagensconcentratie in 1,2 milliliter hersenschijfmedia in een buis van 1,5 milliliter en brengt u vervolgens één milliliter reagens over naar de put met de plak. De MDA-MB-231 BR-GFP luciferasecellen werden geïnjecteerd in naakte muizen, tumoren mochten groeien, hersenen met tumoren werden ontleed, gesneden, ex vivo gekweekt en tumorgroei werd gevolgd door bioluminescentie beeldvorming.De H&E-kleuring en GFP-positieve fluorescentie bevestigden de aanwezigheid van een tumor in de hersenschijf. De verhoogde Ki-67 kleuring bevestigde de aanwezigheid van zeer proliferatieve kankercellen. De tumoren in hersenplakken die niet aan bestraling werden blootgesteld, bleven ex vivo groeien, terwijl tumoren die aan bestraling werden blootgesteld een stagnerende groei vertoonden.Hersenplakken met tumoren werden ook gemonitord via live beeldvorming om de tumorgroei na de bestralingsbehandeling te visualiseren. In overeenstemming met de bioluminescente beeldvorming groeiden controlekankercellen snel naarmate de GFP-intensiteit toenam en de cellen het hersenparenchym begonnen binnen te dringen. Daarentegen waren de kankercellen in hersenplakken die met bestraling werden behandeld cytostatisch en bleef de GFP-intensiteit gehandhaafd.Grote multi-nucleated kankercellen en een toename van kleuring van DNA-schade marker in IR-behandelde kankercellen werden gedetecteerd. Ook werd een toename van reactieve astrocyten gedetecteerd. De door de IR-behandeling geïnduceerde apoptose werd niet gedetecteerd in de tumorvrije hersenplakken van muizen.De hersenplakken met tumoren werden behandeld met verschillende concentraties paclitaxel, een chemotherapeutisch geneesmiddel. De behandeling verminderde de grootte van de tumor aanzienlijk na dag 10 van de behandeling. Een toename van apoptose werd gedetecteerd in met paclitaxel behandelde tumorcellen.De remmerbehandeling veranderde de levensvatbaarheid van hersenweefsel niet. Er werd geen toename van apoptose gemeten door gekloofde caspase-3-kleuring in met paclitaxel behandelde tumorvrije hersenschijf van muizen. Wanneer de behandeling met de geneesmiddelen van belang is beëindigd, kunnen plakjes worden geanalyseerd op eiwitexpressie door middel van immunocytochemie, omische studies of eencellige suspensie bereiken die geschikt is voor flowcytometrie.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Een poortader Injection Model op de studie van de lever metastase van borstkanker

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellulair en cellulaire Lung Model studie Tumor uitzaaiingen

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

De klinische toepassing van Tumor velden therapie behandelen in Glioblastoma

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinale Intravital beeldvorming van hersen tumor Celgedrag in reactie op een invasieve chirurgische biopsie

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo remming van MicroRNA te verminderen tumor groei bij muizen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro assay om tumor-macrofaag interactie te bestuderen

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography

Kwantificeren van de Brain Gemetastatische Tumor Micro-Environment met behulp van een Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning en Confocal Tomography