Name: an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00
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Nous tenons à remercier Julia Farnan, Kayla Green et Tiziana DeAngelis pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu en partie par le Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) et W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).

Ce protocole a été approuvé et suit les directives de soins aux animaux par le Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Des souris femelles athymiques Nu/Nu (âgées de 6 à 8 semaines) ont été utilisées dans cette étude.
1. Injection intracrânienne de cellules tumorales
<ol><li>Stériliser tout l’équipement (pince à épiler, ciseaux, ciseaux de suture, perceuse à main) sous un cycle sec d’un autoclave jusqu’à 45 min dans de...

<ol>
	<li>Watase, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+brain+metastasis-overview+of+disease+state,+treatment+options+and+future+perspectives.">Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives.</a> Cancers. 13 (5), (2021).</li><li>Niikura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+outcomes+and+prognostic+factors+for+patients+with+brain+metastases+from+breast+cancer+of+each+subtype:+a+multicenter+retrospective+analysis.">Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).</li><li>Fong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Parker, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+glioblastoma+organotypic+slice+culture+model+for+study+of+tumor+cell+migration+and+patient-specific+effects+of+anti-invasive+drugs.">A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).</li><li>Chuang, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculture+system+with+an+organotypic+brain+slice+and+3D+spheroid+of+carcinoma+cells.">Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).</li><li>Hohensee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+mediates+the+cross+talk+between+breast+and+glial+cells+in+brain+metastases+leading+to+rapid+disease+progression.">PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression.</a> Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).</li><li>van de Merbel, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+Tissue+culture+model+for+the+assessment+of+individualized+drug+responses+in+prostate+and+bladder+cancer.">An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer.</a> Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).</li><li>Martin, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tissue+slice+culture+system+to+measure+drug-response+rates+of+hepatic+metastatic+colorectal+cancer.">Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer:+a+novel+tumor-promoting+cell+type.">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).</li><li>Lim, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+preserve+the+tumor+microenvironment+and+provide+a+platform+for+drug+response.">Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response.</a> Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain.">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).</li><li>Kyeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+breast+cancer+show+different+spatial+distributions+of+brain+metastases.">Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases.</a> PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).</li><li>Hengel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attributes+of+brain+metastases+from+breast+and+lung+cancer.">Attributes of brain metastases from breast and lung cancer.</a> International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).</li><li>Jackson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters.">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).</li><li>Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+mitochondrial+dynamics+and+trafficking+in+astrocytes.">Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).</li><li>Simone, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+oxidative+stress+alters+miRNA+expression.">Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression.</a> PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).</li><li>Couturier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+that+glioblastoma+recapitulates+a+normal+neurodevelopmental+hierarchy.">Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy.</a> Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).</li><li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).</li><li>Fitzgerald, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+glia+are+recruited+by+highly+proliferative+brain+metastases+of+breast+cancer+and+promote+tumor+cell+colonization.">Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).</li><li>Kondru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ex+Vivo+Brain+Slice+Culture+Model+of+Chronic+Wasting+Disease:+Implications+for+Disease+Pathogenesis+and+Therapeutic+Development.">An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development.</a> Scientific Reports. 10 (1), (2020).</li><li>Abu Samaan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel's+mechanistic+and+clinical+effects+on+breast+cancer.">Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer.</a> Biomolecules. 9 (12), (2019).</li><li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies.">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).</li><li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metastasis+cell+lines+panel:+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines.">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li></ol>

Cette étude établit une nouvelle méthode de culture cérébrale ex vivo pour les tumeurs cérébrales explantées de xénogreffes. Nous montrons que les cellules BCBM MDA-MB-231BR injectées par voie intracrânienne dans le cerveau de souris peuvent survivre et se développer dans des tranches de cerveau ex vivo . L’étude a également testé des cellules de glioblastome U87MG (GBM) injectées par voie intracrânienne et a également constaté que ces cellules cancéreuses survivent et se développ...

Les métastases cérébrales du cancer du sein (BCBM) se développent lorsque les cellules se propagent de la tumeur mammaire primaire au cerveau. Le cancer du sein est la deuxième cause la plus fréquente de métastases cérébrales après le cancer du poumon, avec des métastases survenant chez 10 à 16% des patientes1. Malheureusement, les métastases cérébrales restent incurables car >80% des patients meurent dans l’année suivant leur diagnostic de métastases cérébrales et leur qualité de vie est altérée en raison de dysfonctionnements neurologiques2. Il est urgent d’identifier des options de traitement plus efficaces. Les modèles de culture monocouches bidimensionnelles ou tridimensionnelles sont les méthodes les plus couramment utilisées pour tester les agents thérapeutiques en laboratoire. Cependant, ils n’imitent pas le microenvironnement complexe BCBM, un moteur majeur du phénotype et de la croissance de la tumeur. Bien que ces modèles soient utiles, ils ne capturent pas les interactions complexes tumeur-stromale, les besoins métaboliques uniques et l’hétérogénéité des tumeurs3. Pour récapituler plus fidèlement les interactions tumeur-stromale et l’hétérogénéité du microenvironnement, notre groupe et d’autres ont commencé à générer des cultures de métastases cérébrales organotypiques en « tranches » avec des cellules tumorales dérivées du patient (primaires ou métastatiques) ou des lignées cellulaires cancéreuses 4,5,6. Comparé aux systèmes in vitro classiques, ce modèle ex vivo à court terme peut fournir des conditions plus pertinentes pour le dépistage de nouveaux traitements avant l’évaluation préclinique dans les grandes cohortes d’animaux.
Des modèles ex vivo ont été construits et utilisés avec succès principalement pour l’identification de traitements efficaces de divers cancers. Ils nécessitent quelques jours d’évaluation et peuvent en outre être adaptés au dépistage de médicaments spécifiques au patient. Par exemple, les tissus ex vivo du cancer de la vessie et de la prostate humains ont montré une réponse antitumorale dose-dépendante du docétaxel et de la gemcitabine7. Des tissus ex vivo similaires au carcinome colorectal ont été développés pour dépister les médicaments chimiothérapeutiques Oxaliplatin, Cetuximab et Pembrolizumab8. Cette application a été largement utilisée dans le cancer du pancréas, compte tenu de l’interaction essentielle entre l’environnement stromal et les caractéristiques génotypiques et phénotypiques de l’adénocarcinome canalaire pancréatique 9,10. En outre, de tels modèles organotypiques ont été développés pour des dépistages similaires dans les tumeurs de la tête, du cou, de l’estomac et du sein11,12.
Ici, un modèle de tranche de cerveau ex vivo de cellules tumorales métastatiques du cancer du sein xénogreffées dans leur microenvironnement est généré. Des souris ont été injectées par voie intracrânienne avec des cellules MDA-MB-231BR trophiques métastatiques du cerveau du cancer du sein13 dans le lobe pariétal du cortex cérébral - un site commun de métastases du CSTN14,15 et ont permis de développer des tumeurs. Des tranches de cerveau ont été générées à partir de ces animaux xénogreffés et maintenues ex vivo sous forme de cultures organotypiques comme décrit16,17. Ce nouveau modèle ex vivo permet d’analyser la croissance des cellules BCBM dans le parenchyme cérébral et peut être utilisé pour tester les agents thérapeutiques et les effets des radiations sur les cellules tumorales dans le microenvironnement cérébral.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, slip tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G1/2 Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microscope and LUMAVIEW software</td>
			<td>Etaluma</td>
			<td>LS720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (GEM21)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-210-685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt sable paintbrush, Size #5/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Wax</td>
			<td>ModoMed</td>
			<td>DYNJBW25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain injection Syringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP510-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase 3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14220S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060(95-0043)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-805a (1001-042)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sable paintbrush #2/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-H2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Corning cellgrow</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E and KI-67</td>
			<td>Jefferson Core Facility Pathology staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>YCQ2851920086082DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Just for mice Stereotaxic Frame</td>
			<td>Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).</td>
			<td>72-6049, 72-6044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231BR cells</td>
			<td>Kindly provided by Dr. Patricia Steeg</td>
			<td>Ref 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging device</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>IVIS 200 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging software</td>
			<td>Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).</td>
			<td>Living Image Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Tecan Spark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS reagent</td>
			<td>Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution</td>
			<td>(Cat:G3582)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu/Nu athymic mice</td>
			<td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>145140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Suture</td>
			<td>Medex supply</td>
			<td>ETH-8556H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Swab sticks</td>
			<td>DME Supply USA</td>
			<td>Cat: 689286X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade #11 (pk of 100)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula/probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel</td>
			<td>Exelint International</td>
			<td>D29702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Brinkman</td>
			<td>(McIlwain type)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICMORG50 or PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray machine</td>
			<td>Precision 250 kVp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth

Les métastases cérébrales sont une conséquence grave du cancer du sein chez les femmes, car ces tumeurs sont difficiles à traiter et sont associées à de mauvais résultats cliniques. Les modèles murins précliniques de croissance métastatique du cerveau du cancer du sein (BCBM) sont utiles mais coûteux, et il est difficile de suivre les cellules vivantes et l’invasion des cellules tumorales dans le parenchyme cérébral. Présenté ici est un protocole pour les cultures de tranches de cerveau ex vivo de souris xénogreffées contenant des sous-lignées clonales de cancer du sein injectées par voie intracrânienne. Les cellules marquées par la luciférase MDA-MB-231BR ont été injectées par voie intracrânienne dans le cerveau de souris femelles Nu / Nu, et après la formation de tumeurs, les cerveaux ont été isolés, tranchés et cultivés ex vivo. Les tranches tumorales ont été imagées pour identifier les cellules tumorales exprimant la luciférase et surveiller leur prolifération et leur invasion dans le parenchyme cérébral pendant 10 jours. En outre, le protocole décrit l’utilisation de la microscopie time-lapse pour imager la croissance et le comportement invasif des cellules tumorales après un traitement par rayonnement ionisant ou chimiothérapie. La réponse des cellules tumorales aux traitements peut être visualisée par microscopie d’imagerie en direct, en mesurant l’intensité de la bioluminescence et en effectuant une histologie sur la tranche de cerveau contenant des cellules BCBM. Ainsi, ce modèle de tranche ex vivo peut être une plate-forme utile pour tester rapidement de nouveaux agents thérapeutiques seuls ou en combinaison avec des radiations afin d’identifier des médicaments personnalisés pour cibler la croissance métastatique du cerveau du cancer du sein d’une patiente individuelle dans le microenvironnement cérébral.

Les cellules MDA-MB-231BR-GFP-Luciférase ont été injectées par voie intracrânienne dans l’hémisphère droit de souris Nu/Nu âgées de 4 à 6 semaines, comme expliqué ci-dessus (Figure 1A) et ont été autorisées à se développer pendant 12 à 14 jours, période pendant laquelle la croissance tumorale a été surveillée par imagerie par bioluminescence (Figure 1B). Nous avons injecté 100 000 cellules cancéreuses par voie intracrânienne, comme l’...

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An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Nous introduisons un protocole pour mesurer en temps réel la réponse médicamenteuse et radiologique des cellules métastatiques du cerveau du cancer du sein dans un modèle organotypique de tranches cérébrales. Les méthodes fournissent un test quantitatif pour étudier les effets thérapeutiques de divers traitements sur les métastases cérébrales du cancer du sein de manière ex vivo dans l’interface du microenvironnement cérébral.

Un modèle de tranche cérébrale ex vivo pour étudier et cibler la croissance tumorale métastatique du cancer du sein

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Ce protocole permet la formation de cellules tumorales métastatiques cérébrales et la génération de tranches cérébrales ex vivo qui permettent de tester rapidement l’efficacité des médicaments et le rayonnement sur une tumeur préformée. Le principal avantage de cette technique est la possibilité de tester rapidement plusieurs médicaments ou traitements dans un cadre physiologiquement pertinent qui maintient les interactions cerveau-tumeur-hôte. Cette méthode peut aider à comprendre comment les cellules métastatiques du cerveau se développent, survivent et envahissent le parenchyme cérébral et à comprendre le rôle du microenvironnement de la tumeur cérébrale dans la croissance et la propagation du cancer.Lorela Ciraku et Emily Esquea, toutes deux doctorantes de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, placez les souris anesthésiées dans un cadre stéréotaxique et immobilisez la tête à l’aide de barres d’oreille standard. Stériliser la surface de la tête trois fois en appliquant à plusieurs reprises des écouvillons d’iode et de l’éthanol à 70% avant l’incision.À l’aide d’un scalpel chirurgical, faites une incision médiane d’un centimètre à un angle diagonal par rapport à l’axe imaginaire divisant le cerveau des souris en deux moitiés symétriques pour exposer le crâne. Après avoir essuyé tout sang avec un coton-tige, dévier la peau latéralement pour exposer le site d’injection. Utilisez un mèche de bavure de 0,73 millimètre pour pénétrer dans le crâne et percer un trou en utilisant une légère pression et un mouvement de torsion.Pour injecter cinq microlitres de cellules exprimant de manière stable la luciférase GFP, insérez une seringue de haute précision à 3,5 millimètres de profondeur dans le cerveau. Laissez-le se déposer pendant deux minutes, puis tirez la seringue vers le haut d’environ un millimètre. Après deux minutes, injectez lentement le premier demi-volume et attendez encore deux minutes avant d’injecter le reste du volume.Après trois minutes, tirez lentement la seringue. Appliquez de la cire osseuse sur le site d’injection sur le crâne et suturez le tissu avec des sutures en polypropylène. Surveillez périodiquement le comportement de la souris juste après la chirurgie pour déterminer si un traitement spécial, y compris l’injection de solution saline et les aliments mous, est nécessaire pour aider à une récupération rapide.Pour surveiller la croissance tumorale via l’imagerie par bioluminescence, allumez d’abord l’oxygène et l’isoflurane sur le système d’imagerie et laissez les deux être distribués dans la chambre séparée à l’extérieur de la boîte d’imagerie. Ensuite, après avoir allumé le logiciel et initialisé l’instrument, choisissez l’option appropriée pour visualiser et capturer tout le corps de la souris. Ensuite, transférez les souris dans la chambre à l’extérieur de la boîte d’imagerie alimentée en oxygène et en isoflurane.Une fois que les souris sont sous l’effet anesthésique, injectez aux souris par voie intrapéritonéale 200 microlitres de 30 milligrammes par millilitre de luciférine. Placez les souris dans la chambre d’imagerie avec l’estomac tourné vers le bas vers la lèvre nasale de la chambre d’imagerie. Verrouillez la chambre, choisissez une exposition de deux minutes pour démarrer l’imagerie, puis terminez l’imagerie.Après avoir placé la trancheuse de tissu dans une hotte à flux laminaire stérile, nettoyez tous les outils et instruments avec de l’éthanol à 70%. Après avoir euthanasié la souris, retirez et placez rapidement le cerveau dans une solution glacée de saccharose-ACSF. À l’aide d’une spatule, transférez le cerveau sur un papier filtre mouillé par ACSF sur un couvercle de plat de 60 millimètres.À l’aide d’une lame de rasoir tranchante et stérile, coupez les parties excédentaires du cerveau qui ne contiennent aucune tumeur, y compris la partie inférieure du cerveau, pour amener la forme du cerveau à un cube non parfait. Après avoir placé plusieurs feuilles de papier filtre mouillé par ACSF sur la plate-forme de coupe, placez le tissu bloqué sur le papier filtre. Pour découper le tissu en sections de 200 à 250 micromètres d’épaisseur, réglez la taille de coupe sur 2 ou 2,5 unités sur la règle du fournisseur et commencez à couper.Utilisez un pinceau pour transférer des tranches de cerveau dans un plat contenant du saccharose-ACSF et séparez les tranches sous un microscope optique à l’aide d’aiguilles de calibre 27. Identifiez les tranches GFP positives au microscope fluorescent. Ensuite, à l’aide d’une pipette stérile d’un millilitre cassée avec une large ouverture, transférez les tranches identifiées dans un nouveau plat de 60 millimètres contenant deux à trois millilitres de milieux de tranches adultes.Ensuite, transférez trois à cinq tranches sur chaque insert de culture tissulaire dans chaque puits d’une plaque de six puits à une distance de sécurité. Après avoir retiré l’excès de milieu de la surface de l’insert, ajoutez un millilitre de milieu de tranche de souris adulte équilibré sous chaque insert. Incuber les tissus à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité pendant 24 heures avant l’imagerie.Pipeter cinq microlitres de 30 milligrammes par millilitre de solution de luciférine dans le milieu sous les inserts à l’intérieur d’une hotte stérile. Placez la plaque à six puits avec le couvercle à l’intérieur de la chambre d’imagerie de l’instrument sous la caméra fixe et verrouillez la porte de la chambre. Ouvrez le logiciel et initialisez l’instrument.Après avoir choisi les paramètres de l’appareil photo permettant la visualisation et la capture d’un seul puits par image, placez le puits à imager directement sous l’appareil photo. Utilisez l’outil ROI, ajustez-le autour de la forme et de la taille de la tumeur, mesurez le retour sur investissement et rapportez les lectures totales pour quantifier le signal bioluminescent de chaque tumeur sur la tranche. Après avoir ramené la plaque à la hotte à écoulement laminaire stérile, utilisez une pince pour soulever légèrement l’insert du puits.Après avoir aspiré le milieu, remplacez-le par un millilitre de milieu frais et replacez l’encart dans le puits. Pour les expériences où les tranches sont traitées avec divers composés, tels que des inhibiteurs et des métabolites, préparer la concentration appropriée de réactif dans 1,2 millilitre de milieu de tranche cérébrale dans un tube de 1,5 millilitre, puis transférer un millilitre de réactif au puits contenant la tranche. Les cellules luciférases MDA-MB-231 BR-GFP ont été injectées à des souris nues, les tumeurs ont été autorisées à se développer, les cerveaux avec des tumeurs ont été disséqués, tranchés, cultivés ex vivo et la croissance tumorale a été surveillée par imagerie par bioluminescence.La coloration H&E et la fluorescence GFP-positive ont confirmé la présence d’une tumeur dans la tranche de cerveau. L’augmentation de la coloration Ki-67 a confirmé la présence de cellules cancéreuses hautement prolifératives. Les tumeurs dans les tranches de cerveau qui n’ont pas été exposées à l’irradiation ont continué à croître ex vivo, tandis que les tumeurs exposées à l’irradiation ont montré une croissance bloquée.Les tranches de cerveau contenant des tumeurs ont également été surveillées via l’imagerie en direct pour visualiser la croissance tumorale après le traitement d’irradiation. Conformément à l’imagerie bioluminescente, les cellules cancéreuses de contrôle se sont rapidement développées à mesure que l’intensité du GFP augmentait et que les cellules commençaient à envahir le parenchyme cérébral. En revanche, les cellules cancéreuses dans les tranches de cerveau traitées par irradiation étaient cytostatiques et l’intensité de la GFP était maintenue.De grandes cellules cancéreuses multinucléées et une augmentation de la coloration du marqueur de dommages à l’ADN dans les cellules cancéreuses traitées par IR ont été détectées. En outre, une augmentation des astrocytes réactifs a été détectée. L’apoptose induite par le traitement IR n’a pas été détectée dans les tranches de cerveau de souris sans tumeur.Les tranches de cerveau contenant des tumeurs ont été traitées avec différentes concentrations de paclitaxel, un médicament chimiothérapeutique. Le traitement a considérablement diminué la taille de la tumeur après le jour 10 du traitement. Une augmentation de l’apoptose a été détectée dans les cellules tumorales traitées au paclitaxel.Le traitement par inhibiteur n’a pas altéré la viabilité des tissus cérébraux. Aucune augmentation de l’apoptose n’a été mesurée par coloration à la caspase-3 clivée dans une tranche de cerveau de souris sans tumeur traitée au paclitaxel. Lorsque le traitement avec les médicaments d’intérêt est terminé, les tranches peuvent être analysées pour l’expression des protéines par immunocytochimie, études omiques, ou obtenir une suspension unicellulaire adaptée à la cytométrie en flux.

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