Name: an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00
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Wir danken Julia Farnan, Kayla Green und Tiziana DeAngelis für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch das Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) und W.W. Smith Charitable Trusts (EjH) unterstützt.

Dieses Protokoll wurde vom Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und folgt den Tierpflegerichtlinien. Nu/Nu athymische weibliche Mäuse (6-8 Wochen alt) wurden in dieser Studie verwendet.
1. Intrakranielle Injektion von Tumorzellen
<ol><li>Sterilisieren Sie alle Geräte (Pinzette, Schere, Nähschere, Handbohrmaschine) während eines trockenen Zyklus eines Autoklaven für bis zu 45 Minuten in Sterilisationsbeuteln, einschließlich ...

<ol>
	<li>Watase, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+brain+metastasis-overview+of+disease+state,+treatment+options+and+future+perspectives.">Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives.</a> Cancers. 13 (5), (2021).</li><li>Niikura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+outcomes+and+prognostic+factors+for+patients+with+brain+metastases+from+breast+cancer+of+each+subtype:+a+multicenter+retrospective+analysis.">Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).</li><li>Fong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Parker, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+glioblastoma+organotypic+slice+culture+model+for+study+of+tumor+cell+migration+and+patient-specific+effects+of+anti-invasive+drugs.">A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).</li><li>Chuang, H. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain.">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).</li><li>Kyeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+breast+cancer+show+different+spatial+distributions+of+brain+metastases.">Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases.</a> PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).</li><li>Hengel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attributes+of+brain+metastases+from+breast+and+lung+cancer.">Attributes of brain metastases from breast and lung cancer.</a> International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).</li><li>Jackson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters.">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).</li><li>Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+mitochondrial+dynamics+and+trafficking+in+astrocytes.">Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).</li><li>Simone, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+oxidative+stress+alters+miRNA+expression.">Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression.</a> PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).</li><li>Couturier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+that+glioblastoma+recapitulates+a+normal+neurodevelopmental+hierarchy.">Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy.</a> Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).</li><li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).</li><li>Fitzgerald, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+glia+are+recruited+by+highly+proliferative+brain+metastases+of+breast+cancer+and+promote+tumor+cell+colonization.">Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).</li><li>Kondru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ex+Vivo+Brain+Slice+Culture+Model+of+Chronic+Wasting+Disease:+Implications+for+Disease+Pathogenesis+and+Therapeutic+Development.">An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development.</a> Scientific Reports. 10 (1), (2020).</li><li>Abu Samaan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel's+mechanistic+and+clinical+effects+on+breast+cancer.">Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer.</a> Biomolecules. 9 (12), (2019).</li><li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies.">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).</li><li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metastasis+cell+lines+panel:+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines.">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li></ol>

Diese Studie etabliert eine neuartige Ex-vivo-Hirnkulturmethode für explantierte Xenotransplantat-Hirntumoren. Wir zeigen, dass BCBM-Zellen MDA-MB-231BR-Zellen, die intrakraniell in das Gehirn von Mäusen injiziert werden, überleben und in Ex-vivo-Hirnschnitten wachsen können. Die Studie testete auch intrakraniell injizierte U87MG Glioblastom (GBM) -Zellen und fand auch heraus, dass diese Krebszellen überleben und in Gehirnschnitten wachsen (Daten nicht gezeigt). Wir glauben, dass dieses Modell übe...

Brustkrebs-Hirnmetastasen (BCBM) entstehen, wenn sich Zellen vom primären Brusttumor auf das Gehirn ausbreiten. Brustkrebs ist nach Lungenkrebs die zweithäufigste Ursache für Hirnmetastasen, wobei bei 10-16% der Patienten Metastasen auftreten1. Leider bleiben Hirnmetastasen unheilbar, da >80% der Patienten innerhalb eines Jahres nach ihrer Gehirnmetastasendiagnose sterben und ihre Lebensqualität aufgrund neurologischer Funktionsstörungen beeinträchtigtist 2. Es ist dringend notwendig, wirksamere Behandlungsmöglichkeiten zu finden. Einschichtige zweidimensionale oder dreidimensionale Kulturmodelle sind die am häufigsten verwendeten Methoden zur Prüfung von Therapeutika im Labor. Sie ahmen jedoch nicht die komplexe BCBM-Mikroumgebung nach, die ein Haupttreiber für den Tumorphänotyp und das Tumorwachstum ist. Obwohl diese Modelle nützlich sind, erfassen sie nicht die komplexen Tumor-Stroma-Interaktionen, die einzigartigen metabolischen Anforderungen und die Heterogenität der Tumore3. Um Tumor-Stroma-Interaktionen und Mikroumgebungsheterogenität genauer zu rekapitulieren, haben unsere Gruppe und andere begonnen, organotypische Hirnmetastasen-"Slice"-Kulturen mit patientenabgeleiteten Tumorzellen (primär oder metastasierend) oder Krebszelllinien 4,5,6 zu erzeugen. Im Vergleich zu klassischen In-vitro-Systemen kann dieses kurzfristige Ex-vivo-Modell relevantere Bedingungen für das Screening neuer Therapeutika vor der präklinischen Bewertung in großen Tierkohorten bieten.
Ex-vivo-Modelle wurden konstruiert und erfolgreich eingesetzt, vor allem zur Identifizierung erfolgreicher Behandlungen verschiedener Krebsarten. Sie benötigen wenige Tage der Beurteilung und können zusätzlich auf ein patientenspezifisches Arzneimittelscreening zugeschnitten werden. Zum Beispiel haben menschliche Blasen- und Prostatakrebs-Ex-vivo-Gewebe eine dosisabhängige Anti-Tumor-Reaktion von Docetaxel und Gemcitabin7 gezeigt. Ähnliche kolorektale Karzinome ex vivo Gewebe wurden entwickelt, um Chemotherapeutika Oxaliplatin, Cetuximab und Pembrolizumab8 zu screenen. Diese Anwendung wurde bei Bauchspeicheldrüsenkrebs unter Berücksichtigung der wesentlichen Wechselwirkung zwischen der stromalen Umgebung und den genotypischen und phänotypischen Merkmalen des duktalen Pankreas-Adenokarzinoms 9,10 weit verbreitet. Darüber hinaus wurden solche organotypischen Modelle für ähnliche Screenings bei Kopf-, Hals-, Magen- und Brusttumorenentwickelt 11,12.
Hier wird ein Ex-vivo-Gehirnschnittmodell von xenotransplantierten metastasierenden Tumorzellen des Brustkrebses in ihrer Mikroumgebung erzeugt. Mäuse wurden intrakraniell mit Brustkrebs Gehirn metastasieren Gehirn trophische MDA-MB-231BR Zellen13 in der Großhirnrinde Parietallappen - eine häufige Stelle der TNBC-Metastasierung14,15 und erlaubt, Tumore zu entwickeln. Aus diesen xenotransplantierten Tieren wurden Hirnschnitte erzeugt und ex vivo als organotypische Kulturen beibehalten,wie beschrieben 16,17. Dieses neuartige Ex-vivo-Modell ermöglicht die Analyse des Wachstums der BCBM-Zelle innerhalb des Gehirnparenchyms und kann verwendet werden, um therapeutische Wirkstoffe und Strahlungseffekte auf Tumorzellen in der Mikroumgebung des Gehirns zu testen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, slip tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G1/2 Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microscope and LUMAVIEW software</td>
			<td>Etaluma</td>
			<td>LS720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (GEM21)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-210-685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt sable paintbrush, Size #5/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Wax</td>
			<td>ModoMed</td>
			<td>DYNJBW25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain injection Syringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP510-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase 3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14220S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060(95-0043)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-805a (1001-042)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sable paintbrush #2/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-H2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Corning cellgrow</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E and KI-67</td>
			<td>Jefferson Core Facility Pathology staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>YCQ2851920086082DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Just for mice Stereotaxic Frame</td>
			<td>Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).</td>
			<td>72-6049, 72-6044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231BR cells</td>
			<td>Kindly provided by Dr. Patricia Steeg</td>
			<td>Ref 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging device</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>IVIS 200 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging software</td>
			<td>Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).</td>
			<td>Living Image Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Tecan Spark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS reagent</td>
			<td>Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution</td>
			<td>(Cat:G3582)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu/Nu athymic mice</td>
			<td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>145140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Suture</td>
			<td>Medex supply</td>
			<td>ETH-8556H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Swab sticks</td>
			<td>DME Supply USA</td>
			<td>Cat: 689286X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade #11 (pk of 100)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula/probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel</td>
			<td>Exelint International</td>
			<td>D29702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Brinkman</td>
			<td>(McIlwain type)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICMORG50 or PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray machine</td>
			<td>Precision 250 kVp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth

Hirnmetastasen sind eine schwerwiegende Folge von Brustkrebs bei Frauen, da diese Tumoren schwer zu behandeln sind und mit schlechten klinischen Ergebnissen verbunden sind. Präklinische Mausmodelle des mikrostatischen Wachstums des Brustkrebsgehirns (BCBM) sind nützlich, aber teuer, und es ist schwierig, lebende Zellen und die Invasion von Tumorzellen innerhalb des Gehirnparenchyms zu verfolgen. Hier wird ein Protokoll für Ex-vivo-Hirnschnittkulturen von xenotransplantierten Mäusen vorgestellt, das intrakraniell injizierte Hirntumor-Gehirn-suchende klonale Unterlinien enthält. MDA-MB-231BR Luciferase-markierte Zellen wurden intrakraniell in das Gehirn von Nu / Nu-weiblichen Mäusen injiziert, und nach der Tumorbildung wurden die Gehirne isoliert, geschnitten und ex vivo kultiviert. Die Tumorschnitte wurden aufgenommen, um Tumorzellen zu identifizieren, die Luciferase exprimieren und ihre Proliferation und Invasion im Gehirnparenchym für bis zu 10 Tage zu überwachen. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll die Verwendung der Zeitraffermikroskopie, um das Wachstum und das invasive Verhalten der Tumorzellen nach der Behandlung mit ionisierender Strahlung oder Chemotherapie abzubilden. Die Reaktion von Tumorzellen auf Behandlungen kann durch Live-Imaging-Mikroskopie, Messung der Biolumineszenzintensität und Durchführung von Histologie an der Gehirnscheibe, die BCBM-Zellen enthält, visualisiert werden. Daher kann dieses Ex-vivo-Slice-Modell eine nützliche Plattform für die schnelle Prüfung neuartiger therapeutischer Wirkstoffe allein oder in Kombination mit Bestrahlung sein, um Medikamente zu identifizieren, die auf das metastatische Wachstum des Gehirns eines einzelnen Patienten in der Mikroumgebung des Gehirns abzielen.

MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase-Zellen wurden intrakraniell in die rechte Hemisphäre von 4-6 Wochen alten Nu/Nu-Mäusen injiziert, wie oben erklärt (Abbildung 1A) und durften 12-14 Tage lang wachsen, während dieser Zeit wurde das Tumorwachstum durch Biolumineszenz-Bildgebung überwacht (Abbildung 1B). Wir injizierten 100.000 Krebszellen intrakraniell, wie von anderen Gruppen19 berichtet, aber es ist möglich, so wenig wie 20.000 Zellen<sup...

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An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Wir führen ein Protokoll zur Messung der Echtzeit-Arzneimittel- und Strahlungsreaktion von metastasierenden Zellen des Brustkrebsgehirns in einem organotypischen Gehirnschnittmodell ein. Die Methoden bieten einen quantitativen Assay, um die therapeutischen Wirkungen verschiedener Behandlungen auf Hirnmetastasen von Brustkrebs in einer Ex-vivo-Weise innerhalb der Mikroumgebungsschnittstelle des Gehirns zu untersuchen.

Ein Ex-vivo-Gehirnschnittmodell zur Untersuchung und Bekämpfung des metastasierenden Tumorwachstums von Brustkrebs im Gehirn

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Bildung von metastasierenden Tumorzellen des Gehirns und die Erzeugung von Ex-vivo-Gehirnschnitten, die ein schnelles Testen der Arzneimittelwirksamkeit und Bestrahlung auf einen vorgeformten Tumor ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, mehrere Medikamente oder Behandlungen in einer physiologisch relevanten Umgebung, die die Gehirn-Tumor-Wirt-Interaktionen aufrechterhält, schnell zu testen. Diese Methode kann helfen zu verstehen, wie metastasierende Gehirnzellen wachsen, überleben und in das Gehirnparenchym eindringen, und die Rolle der Mikroumgebung des Hirntumors beim Wachstum und der Ausbreitung von Krebs zu verstehen.Das Verfahren wird von Lorela Ciraku und Emily Esquea, beide Doktorandinnen aus meinem Labor, demonstriert. Legen Sie zunächst die betäubten Mäuse in einen stereotaktischen Rahmen und immobilisieren Sie den Kopf mit Standard-Ohrstangen. Sterilisieren Sie die Oberfläche des Kopfes dreimal durch wiederholtes abwechselndes Auftragen von Jodabstrichen und 70% Ethanol vor dem Einschnitt.Machen Sie mit einem chirurgischen Skalpell einen Einschnitt von einem Zentimeter in der Mittellinie in einem diagonalen Winkel zur imaginären Achse, der das Gehirn der Mäuse in zwei symmetrische Hälften teilt, um den Schädel freizulegen. Nachdem Sie das Blut mit einem Wattestäbchen abgewischt haben, lenken Sie die Haut seitlich ab, um die Injektionsstelle freizulegen. Verwenden Sie einen 0,73 Millimeter Gratbohrer, um den Schädel zu durchdringen, und bohren Sie ein Loch mit leichtem Druck und Drehbewegung.Um fünf Mikroliter Zellen zu injizieren, die GFP-Luciferase stabil exprimieren, führen Sie eine hochpräzise Spritze bis zu einer Tiefe von 3,5 Millimetern in das Gehirn ein. Lassen Sie es für zwei Minuten absetzen und ziehen Sie dann die Spritze etwa einen Millimeter nach oben. Injizieren Sie nach zwei Minuten langsam das erste halbe Volumen und warten Sie weitere zwei Minuten, bevor Sie den Rest des Volumens injizieren.Ziehen Sie nach drei Minuten langsam an der Spritze. Tragen Sie Knochenwachs auf die Injektionsstelle am Schädel auf und nähen Sie das Gewebe mit Polypropylennähten. Überwachen Sie das Verhalten der Maus direkt nach der Operation regelmäßig, um festzustellen, ob eine spezielle Behandlung, einschließlich Kochsalzinjektion und weicher Nahrung, erforderlich ist, um eine schnelle Genesung zu unterstützen.Um das Tumorwachstum mittels Biolumineszenz-Imaging zu überwachen, schalten Sie zuerst den Sauerstoff und das Isofluran auf dem Bildgebungssystem ein und lassen Sie beide auf die separate Kammer außerhalb der Bildgebungsbox verteilen. Wählen Sie dann, nachdem Sie die Software eingeschaltet und das Instrument initialisiert haben, die entsprechende Option zum Visualisieren und Erfassen des gesamten Mauskörpers. Als nächstes bringen Sie die Mäuse in die Kammer außerhalb der Bildgebungsbox, die mit Sauerstoff und Isofluran versorgt wird.Sobald die Mäuse unter der narkosetischen Wirkung sind, injizieren Sie den Mäusen intraperitoneal 200 Mikroliter von 30 Milligramm pro Milliliter Luciferin. Legen Sie die Mäuse in die Bildgebungskammer mit dem Magen nach unten zur Nasenlippe der Bildgebungskammer. Verriegeln Sie die Kammer, wählen Sie zwei Minuten Zeitbelichtung, um die Bildgebung zu starten, und schließen Sie dann die Bildgebung ab.Nachdem Sie den Tissue-Slicer in eine sterile Laminar-Flow-Haube gelegt haben, reinigen Sie alle Werkzeuge und Instrumente mit 70% Ethanol. Nach dem Einschläfern der Maus entfernen und legen Sie das Gehirn schnell in eiskalte Saccharose-ACSF-Lösung. Übertragen Sie das Gehirn mit einem Spatel auf ein ACSF-benetztes Filterpapier auf einem 60-Millimeter-Tellerdeckel.Schneiden Sie mit einer scharfen, sterilen Rasierklinge die überschüssigen Teile des Gehirns, die keinen Tumor enthalten, einschließlich des unteren Teils des Gehirns, ab, um die Form des Gehirns in einen nicht perfekten Würfel zu bringen. Nachdem Sie mehrere Blätter ACSF-benetztes Filterpapier auf die Schneideplattform gelegt haben, legen Sie das verstopfte Gewebe auf das Filterpapier. Um das Gewebe in 200 bis 250 Mikrometer dicke Abschnitte zu schneiden, stellen Sie die Schnittgröße auf 2 oder 2,5 Einheiten auf dem Anbieterlineal ein und beginnen Sie mit dem Schneiden.Verwenden Sie einen Pinsel, um Gehirnscheiben in eine Schale mit Saccharose-ACSF zu übertragen und die Scheiben unter einem Lichtmikroskop mit 27-Gauge-Nadeln zu trennen. Identifizieren Sie die GFP-positiven Schnitte unter dem fluoreszierenden Mikroskop. Übertragen Sie dann mit einer sterilen Ein-Milliliter-abgebrochenen Pipette mit einer breiten Öffnung die identifizierten Scheiben in eine neue 60-Millimeter-Schale, die zwei bis drei Milliliter erwachsene Scheibenmedien enthält.Übertragen Sie dann drei bis fünf Scheiben auf jede Gewebekultureinlage in jeder Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen in sicherer Entfernung. Nachdem Sie das überschüssige Medium von der Oberfläche des Einsatzes entfernt haben, fügen Sie einen Milliliter ausgleichendes erwachsenes Mausschnittmedium unter jede Einlage hinzu. Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 95% Feuchtigkeit für 24 Stunden vor der Bildgebung.Pipettieren Sie fünf Mikroliter von 30 Milligramm pro Milliliter Luciferinlösung in das Medium unter den Einsätzen in einer sterilen Haube. Platzieren Sie die Sechs-Well-Platte mit dem Deckel in der Abbildungskammer des Instruments unter der stationären Kamera und verriegeln Sie die Kammertür. Öffnen Sie die Software und initialisieren Sie das Instrument.Nachdem Sie die Kameraeinstellungen ausgewählt haben, die die Visualisierung und Aufnahme von nur einem Well pro Bild ermöglichen, platzieren Sie den zu bebildernden Well direkt unter der Kamera. Verwenden Sie das ROI-Tool, passen Sie es an die Tumorform und -größe an, messen Sie den ROI und melden Sie die Gesamtmesswerte, um das biolumineszierende Signal jedes Tumors auf der Scheibe zu quantifizieren. Nachdem Sie die Platte wieder auf die sterile Laminar-Flow-Haube gebracht haben, verwenden Sie eine Pinzette, um den Einsatz leicht aus dem Brunnen zu heben.Nachdem Sie das Medium abgesaugt haben, ersetzen Sie das Medium durch einen Milliliter frisches Medium und legen Sie den Einschub wieder in die Vertiefung. Für die Experimente, bei denen die Scheiben mit verschiedenen Verbindungen wie Inhibitoren und Metaboliten behandelt werden, bereiten Sie die entsprechende Reagenzienkonzentration in 1,2 Millilitern Gehirnschnittmedien in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen vor und übertragen dann einen Milliliter Reagenz in die Vertiefung, die die Scheibe enthält. Die MDA-MB-231 BR-GFP-Luciferase-Zellen wurden in nackte Mäuse injiziert, Tumore durften wachsen, Gehirne mit Tumoren wurden seziert, geschnitten, ex vivo gezüchtet und das Tumorwachstum wurde durch Biolumineszenzbildgebung überwacht.Die H & E-Färbung und die GFP-positive Fluoreszenz bestätigten das Vorhandensein eines Tumors in der Gehirnscheibe. Die erhöhte Ki-67-Färbung bestätigte das Vorhandensein von stark proliferativen Krebszellen. Die Tumoren in Hirnschnitten, die keiner Bestrahlung ausgesetzt waren, wuchsen ex vivo weiter, während Tumore, die einer Bestrahlung ausgesetzt waren, ein stockendes Wachstum aufwiesen.Gehirnschnitte, die Tumore enthielten, wurden auch mittels Live-Bildgebung überwacht, um das Tumorwachstum nach der Bestrahlung zu visualisieren. In Übereinstimmung mit der biolumineszenten Bildgebung wuchsen die Kontrollkrebszellen schnell, als die GFP-Intensität zunahm und die Zellen begannen, in das Gehirnparenchym einzudringen. Im Gegensatz dazu waren die Krebszellen in Gehirnschnitten, die mit Bestrahlung behandelt wurden, zytostatisch und die GFP-Intensität wurde beibehalten.Große mehrkernige Krebszellen und eine Zunahme der Färbung von DNA-Schadensmarkern in IR-behandelten Krebszellen wurden nachgewiesen. Auch eine Zunahme reaktiver Astrozyten wurde nachgewiesen. Die IR-behandlungsinduzierte Apoptose wurde in den tumorfreien Hirnschnitten der Maus nicht nachgewiesen.Die Gehirnschnitte, die Tumore enthielten, wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Paclitaxel, einem Chemotherapeutikum, behandelt. Die Behandlung verringerte die Größe des Tumors signifikant nach Tag 10 der Behandlung. Ein Anstieg der Apoptose wurde in mit Paclitaxel behandelten Tumorzellen festgestellt.Die Behandlung mit dem Inhibitor veränderte die Lebensfähigkeit des Gehirngewebes nicht. Kein Anstieg der Apoptose wurde durch gespaltene Caspase-3-Färbung in Paclitaxel-behandeltem tumorfreien Maus-Gehirnschnitt gemessen. Wenn die Behandlung mit den interessierenden Medikamenten beendet ist, können Scheiben durch Immunzytochemie, omische Studien oder Einzelzellsuspension, die für die Durchflusszytometrie geeignet ist, auf Proteinexpression analysiert werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Ein Portal Veneninjektion Modell zur Untersuchung der Leber Metastasierung von Brustkrebs

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Forschung

Krebsforschung

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Azelluläre und zellulären Lunge Modell Tumor Metastasen zu studieren

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Die klinische Anwendung des Tumors, die Behandlung von Feldern Therapie bei Glioblastom

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Längsschnitt-Intravital-Bildgebung des Hirntumorzellverhaltens als Reaktion auf eine invasive chirurgische Biopsie

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In Vivo Hemmung von MicroRNA zur Verringerung des Tumorwachstums bei Mäusen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography

Quantifizierung der metastasierenden Tumor-Mikroumgebung des Gehirns mit einem Organ-On-A-Chip-3D-Modell, maschinellem Lernen und konfokaler Tomographie