Name: an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth at JoVE.com

אנו רוצים להודות לג'וליה פרנאן, קיילה גרין וטיזיאנה דה-אנג'ליס על הסיוע הטכני שלהן. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תוכנית המענקים לשיפור המחקר האוניברסלי של חבר העמים של פנסילבניה (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) ו- W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).

פרוטוקול זה אושר ועוקב אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת דרקסל (IACUC). במחקר זה נעשה שימוש בעכברים נקבות נו/נו אתימיות (בנות 6-8 שבועות).
1. הזרקה תוך גולגולתית של תאי הגידול
<ol><li>לעקר את כל הציוד (פינצטה, מספריים...

<ol>
	<li>Watase, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+brain+metastasis-overview+of+disease+state,+treatment+options+and+future+perspectives.">Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives.</a> Cancers. 13 (5), (2021).</li><li>Niikura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+outcomes+and+prognostic+factors+for+patients+with+brain+metastases+from+breast+cancer+of+each+subtype:+a+multicenter+retrospective+analysis.">Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).</li><li>Fong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Parker, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+glioblastoma+organotypic+slice+culture+model+for+study+of+tumor+cell+migration+and+patient-specific+effects+of+anti-invasive+drugs.">A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).</li><li>Chuang, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculture+system+with+an+organotypic+brain+slice+and+3D+spheroid+of+carcinoma+cells.">Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).</li><li>Hohensee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+mediates+the+cross+talk+between+breast+and+glial+cells+in+brain+metastases+leading+to+rapid+disease+progression.">PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression.</a> Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).</li><li>van de Merbel, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+Tissue+culture+model+for+the+assessment+of+individualized+drug+responses+in+prostate+and+bladder+cancer.">An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer.</a> Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).</li><li>Martin, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tissue+slice+culture+system+to+measure+drug-response+rates+of+hepatic+metastatic+colorectal+cancer.">Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer:+a+novel+tumor-promoting+cell+type.">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).</li><li>Lim, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+preserve+the+tumor+microenvironment+and+provide+a+platform+for+drug+response.">Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response.</a> Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain.">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).</li><li>Kyeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+breast+cancer+show+different+spatial+distributions+of+brain+metastases.">Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases.</a> PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).</li><li>Hengel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attributes+of+brain+metastases+from+breast+and+lung+cancer.">Attributes of brain metastases from breast and lung cancer.</a> International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).</li><li>Jackson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters.">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).</li><li>Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+mitochondrial+dynamics+and+trafficking+in+astrocytes.">Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).</li><li>Simone, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+oxidative+stress+alters+miRNA+expression.">Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression.</a> PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).</li><li>Couturier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+that+glioblastoma+recapitulates+a+normal+neurodevelopmental+hierarchy.">Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy.</a> Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).</li><li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).</li><li>Fitzgerald, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+glia+are+recruited+by+highly+proliferative+brain+metastases+of+breast+cancer+and+promote+tumor+cell+colonization.">Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).</li><li>Kondru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ex+Vivo+Brain+Slice+Culture+Model+of+Chronic+Wasting+Disease:+Implications+for+Disease+Pathogenesis+and+Therapeutic+Development.">An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development.</a> Scientific Reports. 10 (1), (2020).</li><li>Abu Samaan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel's+mechanistic+and+clinical+effects+on+breast+cancer.">Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer.</a> Biomolecules. 9 (12), (2019).</li><li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies.">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).</li><li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metastasis+cell+lines+panel:+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines.">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li></ol>

מחקר זה מבסס שיטה חדשנית של תרבית מוח ex vivo עבור גידולי מוח של קסנוגרפט מוסברים. אנו מראים שתאי BCBM MDA-MB-231BR המוזרקים באופן תוך גולגולתי במוחם של עכברים יכולים לשרוד ולגדול בפרוסות מוח ex vivo . המחקר בחן גם תאי גליובלסטומה תוך גולגולתית מסוג U87MG (GBM) שהוזרקו להם, וגם מצא שתאים סרטניים אלה ...

גרורות במוח של סרטן השד (BCBM) מתפתחות כאשר תאים מתפשטים מגידול השד הראשוני למוח. סרטן השד הוא הגורם השני בשכיחותו לגרורות במוח לאחר סרטן הריאות, כאשר גרורות מתרחשות אצל 10-16% מהחולות1. למרבה הצער, גרורות במוח עדיין חשוכות מרפא מכיוון >80% מהחולים מתים תוך שנה לאחר אבחון גרורות במוח, ואיכות חייהם נפגעת עקב תפקוד נוירולוגי2. יש צורך דחוף לזהות אפשרויות טיפול יעילות יותר. מודלים דו-ממדיים או תלת-ממדיים של תרביות חד-ממדיות הם השיטות הנפוצות ביותר בבדיקת חומרים טיפוליים במעבדה. עם זאת, הם אינם מחקים את המיקרו-סביבה המורכבת של BCBM, גורם עיקרי לפנוטיפ הגידול ולצמיחה. למרות שמודלים אלה שימושיים, הם אינם לוכדים את האינטראקציות המורכבות בין הגידול לסטרומל, את הדרישות המטבוליות הייחודיות ואת ההטרוגניות של הגידולים3. כדי לשחזר באופן נאמן יותר את האינטראקציות בין הגידול לסטרומל ואת ההטרוגניות של המיקרו-סביבה, הקבוצה שלנו ואחרים החלו ליצור תרביות "פרוסות" של גרורות מוחיות אורגנוטיפיות עם תאי גידול שמקורם בחולה (ראשוניים או גרורתיים) או קווי תאים סרטניים 4,5,6. בהשוואה למערכות מבחנה קלאסיות, מודל ex vivo קצר טווח זה עשוי לספק תנאים רלוונטיים יותר לבדיקת טיפולים חדשים לפני הערכה פרה-קלינית בקבוצות גדולות של בעלי חיים.
מודלים של Ex vivo נבנו ושימשו בהצלחה בעיקר לזיהוי טיפולים מוצלחים בסוגי סרטן שונים. הם דורשים כמה ימים של הערכה ובנוסף ניתן להתאים אותם לבדיקת תרופות ספציפיות למטופל. לדוגמה, רקמות ex vivo של שלפוחית השתן והערמונית האנושיות הראו תגובה אנטי-סרטנית תלוית מינון של דוקטקסל וגמציטאבין7. רקמות קרצינומה מעי גס דומות ex vivo פותחו כדי לסנן תרופות כימותרפיות Oxaliplatin, Cetuximab, ו Pembrolizumab8. יישום זה נמצא בשימוש נרחב בסרטן הלבלב, בהתחשב באינטראקציה החיונית בין הסביבה הסטרומלית לבין המאפיינים הגנוטיפיים והפנוטיפיים של אדנוקרצינומה של צינור הלבלב 9,10. יתר על כן, מודלים אורגנוטיפיים כאלה פותחו עבור בדיקות דומות בגידולי ראש, צוואר, קיבה ושד11,12.
כאן נוצר מודל פרוסת מוח ex vivo של תאי גידול גרורתיים של סרטן שד קסנוגרטיבי במוח במיקרו-סביבה שלהם. עכברים הוזרקו להם באופן תוך גולגולתי תאי MDA-MB-231BR טרופיים של סרטן השד במוח, 13 באונה הקודקודית של קליפת המוח - אתר נפוץ של גרורות TNBC14,15 והותר להם לפתח גידולים. פרוסות מוח נוצרו מחיות קסנוגרות אלה ושמרו על ex vivo כתרביות אורגנוטיפיות כמתואר16,17. מודל ex vivo חדשני זה מאפשר ניתוח של גדילת תאי BCBM בתוך הפרנכימה המוחית וניתן להשתמש בו כדי לבחון חומרים טיפוליים והשפעות קרינה על תאי הגידול בתוך המיקרו-סביבה של המוח.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, slip tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G1/2 Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microscope and LUMAVIEW software</td>
			<td>Etaluma</td>
			<td>LS720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (GEM21)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-210-685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt sable paintbrush, Size #5/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Wax</td>
			<td>ModoMed</td>
			<td>DYNJBW25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain injection Syringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP510-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase 3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14220S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060(95-0043)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-805a (1001-042)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sable paintbrush #2/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-H2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Corning cellgrow</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E and KI-67</td>
			<td>Jefferson Core Facility Pathology staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>YCQ2851920086082DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Just for mice Stereotaxic Frame</td>
			<td>Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).</td>
			<td>72-6049, 72-6044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231BR cells</td>
			<td>Kindly provided by Dr. Patricia Steeg</td>
			<td>Ref 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging device</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>IVIS 200 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging software</td>
			<td>Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).</td>
			<td>Living Image Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Tecan Spark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS reagent</td>
			<td>Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution</td>
			<td>(Cat:G3582)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu/Nu athymic mice</td>
			<td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>145140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Suture</td>
			<td>Medex supply</td>
			<td>ETH-8556H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Swab sticks</td>
			<td>DME Supply USA</td>
			<td>Cat: 689286X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade #11 (pk of 100)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula/probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel</td>
			<td>Exelint International</td>
			<td>D29702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Brinkman</td>
			<td>(McIlwain type)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICMORG50 or PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray machine</td>
			<td>Precision 250 kVp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth

גרורות במוח הן תוצאה חמורה של סרטן השד עבור נשים מכיוון שגידולים אלה קשים לטיפול וקשורים לתוצאות קליניות גרועות. מודלים פרה-קליניים של עכברים של גדילה גרורתית של סרטן השד במוח (BCBM) הם שימושיים אך הם יקרים, וקשה לעקוב אחר תאים חיים ופלישה של תאי גידול בתוך הפרנכימה המוחית. מוצג כאן פרוטוקול לתרביות פרוסות מוח ex vivo מעכברים עם קסנוגרפט המכילים תתי-שורות קלונליות תוך גולגולתיות של סרטן שד מוזרקות באופן תוך גולגולתי. תאים מתויגים של MDA-MB-231BR luciferase הוזרקו באופן תוך גולגולתי לתוך מוחם של עכברי נקבות Nu/Nu, ובעקבות היווצרות הגידול, המוחות בודדו, נחתכו ותרביתו ex vivo. פרוסות הגידול צולמו כדי לזהות תאים סרטניים המבטאים לוציפראז ולנטר את התפשטותם ופלישתם בפרנכימה המוחית במשך עד 10 ימים. יתר על כן, הפרוטוקול מתאר את השימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן כדי לדמות את הצמיחה וההתנהגות הפולשנית של תאי הגידול לאחר הטיפול בקרינה מייננת או בכימותרפיה. ניתן לדמיין את התגובה של תאי הגידול לטיפולים על ידי מיקרוסקופיה של הדמיה חיה, מדידת עוצמת הביולומינסנציה וביצוע היסטולוגיה על פרוסת המוח המכילה תאי BCBM. לפיכך, מודל פרוסת ex vivo זה עשוי להיות פלטפורמה שימושית לבדיקה מהירה של חומרים טיפוליים חדשניים בלבד או בשילוב עם קרינה כדי לזהות תרופות המותאמות אישית כדי להתמקד בצמיחה גרורתית של סרטן השד של מטופלת בודדת בתוך המיקרו-סביבה במוח.

תאי MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase הוזרקו באופן תוך גולגולתי לתוך ההמיספרה הימנית של עכברי Nu/Nu בני 4-6 שבועות כפי שהוסבר לעיל (איור 1A) והורשו לגדול במשך 12-14 ימים, שבמהלכם ניתן היה לנטר את צמיחת הגידול על ידי הדמיית ביולומינסנציה (איור 1B). הזרקנו 100,000 תאים סרטניים באופן תוך גול?...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth at JoVE.com

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

אנו מציגים פרוטוקול למדידת תגובת תרופות וקרינה בזמן אמת של תאים גרורתיים במוח של סרטן השד במודל פרוסת מוח אורגנוטיפית. השיטות מספקות בדיקה כמותית כדי לחקור את ההשפעות הטיפוליות של טיפולים שונים על גרורות במוח מסרטן השד באופן ex vivo בתוך ממשק המיקרו-סביבה של המוח.

מודל פרוסת מוח Ex Vivo כדי לחקור ולמקד את צמיחת הגידול הגרורתי של סרטן השד במוח

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

פרוטוקול זה מאפשר היווצרות של תאי גידול גרורתיים במוח ויצירת פרוסות מוח ex vivo המאפשרות בדיקה מהירה של יעילות התרופה וקרינה על גידול מוכן מראש. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לבחון במהירות תרופות או טיפולים מרובים בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית השומרת על אינטראקציות מוח-גידול-מארח. שיטה זו עשויה לסייע בהבנת האופן שבו תאים גרורתיים במוח גדלים, שורדים ופולשים לפרנכימה במוח ולהבין את תפקידה של המיקרו-סביבה של גידולי המוח בצמיחה ובהתפשטות של סרטן.מי שידגימו את ההליך יהיו לורלה צ'יראקו ואמילי אסקה, שתיהן דוקטורנטיות מהמעבדה שלי. בתור התחלה, עם למקם את העכברים המורדמים לתוך מסגרת סטריאוטקסית ולשתק את הראש באמצעות מוטות אוזניים סטנדרטיים. לעקר את פני השטח של הראש שלוש פעמים על ידי יישום לסירוגין חוזר ונשנה של ספוגיות יוד ו 70% אתנול לפני החתך.באמצעות אזמל כירורגי, בצע חתך קו אמצע של סנטימטר אחד בזווית אלכסונית לציר הדמיוני המחלק את מוחם של העכברים לשני חצאים סימטריים כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר ניגוב כל דם עם צמר גפן, להסיט את העור לרוחב כדי לחשוף את מקום ההזרקה. השתמש בקטע בור של 0.73 מילימטר כדי לחדור לגולגולת ולטדוח חור באמצעות לחץ קל ותנועת פיתול.כדי להזריק חמישה מיקרוליטרים של תאים המבטאים ביציבות GFP לוציפראז, החדירו במוח מזרק ברמת דיוק גבוהה לעומק של 3.5 מילימטרים. אפשרו לו להתיישב במשך שתי דקות ואז משכו את המזרק למעלה בערך מילימטר אחד. לאחר שתי דקות, להזריק באיטיות את המחצית הראשונה של הווליום ולהמתין עוד שתי דקות לפני הזרקת שארית הווליום.לאחר שלוש דקות, משכו באיטיות את המזרק. החל שעוות עצם על אתר ההזרקה על הגולגולת ותפר את הרקמה עם תפרים פוליפרופילן. עקוב אחר התנהגות העכבר מיד לאחר הניתוח מעת לעת כדי לקבוע אם יש צורך בטיפול מיוחד, כולל הזרקת מלח ומזון רך, כדי לסייע בהתאוששות מהירה.כדי לנטר את צמיחת הגידול באמצעות הדמיה ביולומינסנציה, הפעילו תחילה את החמצן והאיזופלורן במערכת ההדמיה ואפשרו לשניהם להתפזר לחדר הנפרד שמחוץ לתיבת ההדמיה. לאחר מכן, לאחר הפעלת התוכנה ואתחול המכשיר, בחר באפשרות המתאימה להדמיה וללכידה של כל גוף העכבר. לאחר מכן, העבר את העכברים לתא מחוץ לתיבת ההדמיה המסופקת עם חמצן ואיזופלורן.ברגע שהעכברים נמצאים תחת אפקט ההרדמה, הזריקו לעכברים באופן תוך-צפקי 200 מיקרוליטרים של 30 מיליגרם למיליליטר של לוציפרין. הניחו את העכברים בתא ההדמיה כשהבטן פונה כלפי מטה אל שפת האף של תאי ההדמיה. נעל את התא, בחר חשיפה של שתי דקות כדי להתחיל בהדמיה ולאחר מכן השלים את ההדמיה.לאחר הנחת חותך הרקמות במכסה זרימה למינרי סטרילי, נקו את כל הכלים והמכשירים עם 70% אתנול. לאחר המתת החסד של העכבר, הסר והנח את המוח במהירות לתמיסת סוכרוז-ACSF קרה כקרח. באמצעות מרית, העבירו את המוח על נייר מסנן רטוב ACSF על מכסה צלחת בקוטר 60 מ"מ.באמצעות סכין גילוח חד וסטרילי, חתכו את החלקים העודפים במוח שאינם מכילים שום גידול, כולל החלק התחתון של המוח, כדי להביא את צורת המוח לקובייה לא מושלמת. לאחר הנחת מספר גיליונות של נייר מסנן רטוב ACSF על פלטפורמת החיתוך, הניחו את הרקמה החסומה על נייר הסינון. כדי לפרוס את הרקמה למקטעים בעובי של 200 עד 250 מיקרומטר, הגדר את גודל החיתוך ל-2 או 2.5 יחידות בסרגל הספק והתחל לחתוך.השתמשו במברשת צבע כדי להעביר פרוסות מוח לתוך צלחת המכילה סוכרוז-ACSF ולהפריד את הפרוסות תחת מיקרוסקופ אור באמצעות מחטים בעלות 27 מדים. זהה את הפרוסות החיוביות ל-GFP תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי. לאחר מכן, באמצעות פיפטה סטרילית של מיליליטר אחד שבורה עם פתח רחב, מעבירים פרוסות מזוהות לתבשיל חדש של 60 מילימטרים המכיל שניים עד שלושה מיליליטרים של מדיית פרוסות בוגרת.לאחר מכן, העבירו שלוש עד חמש פרוסות על כל תוסף תרבית רקמה בכל באר של צלחת בת שש בארות במרחק בטוח. לאחר הסרת המדיום העודף מפני השטח של התוסף, הוסף מיליליטר אחד של מדיום פרוסת עכבר בוגר שיווי משקל מתחת לכל תוספת. דגירה של הרקמות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני ו-95% לחות למשך 24 שעות לפני ההדמיה.פיפט חמישה מיקרוליטרים של 30 מיליגרם לכל מיליליטר לוציפרין תמיסה לתוך המדיום שמתחת לתוספות בתוך מכסה המנוע הסטרילי. מניחים את צלחת ששת הבארים עם המכסה בתוך תא ההדמיה של המכשיר מתחת למצלמה הנייחת ונועלים את דלת החדר. פתח את התוכנה ואתחל את המכשיר.לאחר בחירת הגדרות המצלמה המאפשרות הדמיה ולכידה של באר אחת בלבד לכל תמונה, מקם את הבאר שתצולם ישירות מתחת למצלמה. השתמש בכלי ROI, התאם אותו סביב הצורה והגודל של הגידול, מדוד את ההחזר על ההשקעה ודווח על הקריאות הכוללות כדי לכמת את האות הביו-לומינסנטי של כל גידול על הפרוסה. לאחר החזרת הצלחת למכסה הזרימה הלמינרי הסטרילי, השתמשו במלקחיים כדי להרים מעט את התוספת מהבאר.לאחר שאיפת המדיום, החליפו את המדיום במיליליטר אחד של מדיום טרי והניחו את הכניסה בחזרה לבאר. עבור הניסויים שבהם הפרוסות מטופלות בתרכובות שונות, כגון מעכבים ומטבוליטים, מכינים את ריכוז הריאגנט המתאים ב-1.2 מיליליטר של מדיית פרוסות מוח בצינור של 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן מעבירים מיליליטר אחד של מגיב לבאר המכילה את הפרוסה. תאי הלוציפראז MDA-MB-231 BR-GFP הוזרקו לעכברים עירומים, גידולים הורשו לגדול, מוחות עם גידולים נותחו החוצה, נחתכו, גדלו ex vivo, וצמיחת הגידול נוטרה על ידי הדמיית bioluminescence.צביעת H&E ופלואורסצנציה חיובית ל-GFP אישרו את נוכחותו של גידול בפרוסת המוח. הכתם המוגבר של Ki-67 אישר את נוכחותם של תאים סרטניים מתרבים מאוד. הגידולים בפרוסות המוח שלא נחשפו להקרנה המשיכו לצמוח ex vivo, בעוד שגידולים שנחשפו להקרנה הראו צמיחה מעוותת.פרוסות מוח המכילות גידולים נוטרו גם הן באמצעות הדמיה חיה כדי לדמיין את צמיחת הגידול לאחר טיפול ההקרנה. בהתאם להדמיה הביולומינסנטית, תאי סרטן הבקרה גדלו במהירות ככל שעוצמת ה-GFP עלתה והתאים החלו לפלוש לפרנכימה המוחית. לעומת זאת, התאים הסרטניים בפרוסות המוח שטופלו בהקרנה היו ציטוסטטיים ועוצמת ה-GFP נשמרה.זוהו תאים סרטניים גדולים מרובי גרעינים ועלייה בכתם של סמן נזק לדנ"א בתאים סרטניים שטופלו ב-IR. כמו כן, זוהתה עלייה באסטרוציטים תגובתיים. האפופטוזיס הנגרם על ידי טיפול IR לא זוהה בפרוסות המוח של העכברים נטולי הגידולים.פרוסות המוח המכילות גידולים טופלו בריכוזים שונים של פקליטקסל, תרופה כימותרפית. הטיפול הפחית את גודל הגידול באופן משמעותי לאחר יום 10 של הטיפול. עלייה באפופטוזיס זוהתה בתאי גידול שטופלו בפקליטקסל.הטיפול במעכב לא שינה את הכדאיות של רקמת המוח. שום עלייה באפופטוזיס לא נמדדה על ידי צביעת קספאזה-3 מבוקעת בפרוסת מוח של עכברים שטופלו בפקליטקסל ללא גידולים. כאשר הטיפול בתרופות המעניינות הסתיים, ניתן לנתח פרוסות לביטוי חלבונים באמצעות אימונוציטוכימיה, מחקרים אומיים, או להשיג תרחיף חד-תאי המתאים לציטומטריה של זרימה.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

היישום הקליני של הגידול לטיפול שדות טיפול ב גליובלסטומה

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

האורך הדמיה של התנהגות המוח תאים סרטניים בתגובה ביופסיה פולשנית כירורגית

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

ב Vivo עיכוב של מיקרואורנה כדי להקטין את צמיחת הגידול בעכברים

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...