Name: an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00
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Vogliamo ringraziare Julia Farnan, Kayla Green e Tiziana DeAngelis per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato in parte dal Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) e W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).

Questo protocollo è stato approvato e segue le linee guida per la cura degli animali dal Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). In questo studio sono stati utilizzati topi femmina atimici Nu/Nu (6-8 settimane di età).
1. Iniezione intracranica di cellule tumorali
<ol><li>Sterilizzare tutte le attrezzature (pinzette, forbici, forbici da sutura, trapano a mano) sotto un ciclo a secco di un'autoclave per un massimo di 45 minuti in sacchetti ...

<ol>
	<li>Watase, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+brain+metastasis-overview+of+disease+state,+treatment+options+and+future+perspectives.">Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives.</a> Cancers. 13 (5), (2021).</li><li>Niikura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+outcomes+and+prognostic+factors+for+patients+with+brain+metastases+from+breast+cancer+of+each+subtype:+a+multicenter+retrospective+analysis.">Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).</li><li>Fong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Parker, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+glioblastoma+organotypic+slice+culture+model+for+study+of+tumor+cell+migration+and+patient-specific+effects+of+anti-invasive+drugs.">A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).</li><li>Chuang, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculture+system+with+an+organotypic+brain+slice+and+3D+spheroid+of+carcinoma+cells.">Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).</li><li>Hohensee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+mediates+the+cross+talk+between+breast+and+glial+cells+in+brain+metastases+leading+to+rapid+disease+progression.">PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression.</a> Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).</li><li>van de Merbel, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+Tissue+culture+model+for+the+assessment+of+individualized+drug+responses+in+prostate+and+bladder+cancer.">An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer.</a> Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).</li><li>Martin, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tissue+slice+culture+system+to+measure+drug-response+rates+of+hepatic+metastatic+colorectal+cancer.">Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer:+a+novel+tumor-promoting+cell+type.">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).</li><li>Lim, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+preserve+the+tumor+microenvironment+and+provide+a+platform+for+drug+response.">Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response.</a> Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain.">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).</li><li>Kyeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+breast+cancer+show+different+spatial+distributions+of+brain+metastases.">Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases.</a> PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).</li><li>Hengel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attributes+of+brain+metastases+from+breast+and+lung+cancer.">Attributes of brain metastases from breast and lung cancer.</a> International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).</li><li>Jackson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters.">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).</li><li>Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+mitochondrial+dynamics+and+trafficking+in+astrocytes.">Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).</li><li>Simone, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+oxidative+stress+alters+miRNA+expression.">Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression.</a> PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).</li><li>Couturier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+that+glioblastoma+recapitulates+a+normal+neurodevelopmental+hierarchy.">Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy.</a> Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).</li><li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).</li><li>Fitzgerald, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+glia+are+recruited+by+highly+proliferative+brain+metastases+of+breast+cancer+and+promote+tumor+cell+colonization.">Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).</li><li>Kondru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ex+Vivo+Brain+Slice+Culture+Model+of+Chronic+Wasting+Disease:+Implications+for+Disease+Pathogenesis+and+Therapeutic+Development.">An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development.</a> Scientific Reports. 10 (1), (2020).</li><li>Abu Samaan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel's+mechanistic+and+clinical+effects+on+breast+cancer.">Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer.</a> Biomolecules. 9 (12), (2019).</li><li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies.">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).</li><li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metastasis+cell+lines+panel:+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines.">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li></ol>

Questo studio stabilisce un nuovo metodo di coltura cerebrale ex vivo per i tumori cerebrali allo xenotrapianto espiantato. Mostriamo che le cellule BCBM MDA-MB-231BR iniettate intracranicamente nel cervello dei topi possono sopravvivere e crescere in fette di cervello ex vivo . Lo studio ha anche testato le cellule di glioblastoma U87MG iniettate intracranicamente (GBM) e ha anche scoperto che queste cellule tumorali sopravvivono e crescono in fette di cervello (dati non mostrati). Riteniamo che questo...

Le metastasi cerebrali del cancro al seno (BCBM) si sviluppano quando le cellule si diffondono dal tumore mammario primario al cervello. Il cancro al seno è la seconda causa più frequente di metastasi cerebrali dopo il cancro del polmone, con metastasi che si verificano nel 10-16% dei pazienti1. Sfortunatamente, le metastasi cerebrali rimangono incurabili poiché >80% dei pazienti muore entro un anno dalla diagnosi di metastasi cerebrali e la loro qualità di vita è compromessa a causa di disfunzioni neurologiche2. C'è un urgente bisogno di identificare opzioni di trattamento più efficaci. I modelli di coltura monostrato bidimensionali o tridimensionali sono i metodi più comunemente usati per testare gli agenti terapeutici in laboratorio. Tuttavia, non imitano il complesso microambiente BCBM, uno dei principali driver del fenotipo tumorale e della crescita. Sebbene questi modelli siano utili, non catturano le complesse interazioni tumore-stromale, i requisiti metabolici unici e l'eterogeneità dei tumori3. Per ricapitolare più fedelmente le interazioni tumore-stromale e l'eterogeneità del microambiente, il nostro gruppo e altri hanno iniziato a generare metastasi cerebrali organotipiche "slice" colture con cellule tumorali derivate dal paziente (primarie o metastatiche) o linee cellulari tumorali 4,5,6. Rispetto ai sistemi classici in vitro, questo modello ex vivo a breve termine può fornire condizioni più rilevanti per lo screening di nuove terapie prima della valutazione preclinica in grandi coorti di animali.
Modelli ex vivo sono stati costruiti e utilizzati con successo principalmente per l'identificazione di trattamenti di successo di vari tumori. Richiedono alcuni giorni di valutazione e inoltre possono essere adattati allo screening farmacologico specifico del paziente. Ad esempio, i tessuti ex vivo del cancro della vescica e della prostata umano hanno mostrato una risposta antitumorale dose-dipendente di docetaxel e gemcitabina7. Simili tessuti di carcinoma colorettale ex vivo sono stati sviluppati per lo screening dei farmaci chemioterapici Oxaliplatino, Cetuximab e Pembrolizumab8. Questa applicazione è stata ampiamente utilizzata nel cancro del pancreas, considerando l'interazione essenziale tra l'ambiente stromale e le caratteristiche genotipiche e fenotipiche dell'adenocarcinoma duttale pancreatico 9,10. Inoltre, tali modelli organotipici sono stati sviluppati per screening simili nei tumori della testa, del collo, gastrici e della mammella11,12.
Qui, viene generato un modello ex vivo di fette di cervello di cellule tumorali metastatiche cerebrali xenografate del cancro al seno nel loro microambiente. I topi sono stati iniettati intracranicamente con carcinoma mammario cerebrale metastatico trofico mdA-MB-231BR cellule13 nel lobo parietale della corteccia cerebrale - un sito comune di metastasi TNBC14,15 e permesso di sviluppare tumori. Le fette di cervello sono state generate da questi animali xenografati e mantenute ex vivo come colture organotipiche come descritto16,17. Questo nuovo modello ex vivo consente l'analisi della crescita delle cellule BCBM all'interno del parenchima cerebrale e può essere utilizzato per testare agenti terapeutici ed effetti delle radiazioni sulle cellule tumorali all'interno del microambiente cerebrale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, slip tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G1/2 Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microscope and LUMAVIEW software</td>
			<td>Etaluma</td>
			<td>LS720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (GEM21)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-210-685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt sable paintbrush, Size #5/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Wax</td>
			<td>ModoMed</td>
			<td>DYNJBW25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain injection Syringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP510-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase 3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14220S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060(95-0043)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-805a (1001-042)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sable paintbrush #2/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-H2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Corning cellgrow</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E and KI-67</td>
			<td>Jefferson Core Facility Pathology staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>YCQ2851920086082DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Just for mice Stereotaxic Frame</td>
			<td>Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).</td>
			<td>72-6049, 72-6044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231BR cells</td>
			<td>Kindly provided by Dr. Patricia Steeg</td>
			<td>Ref 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging device</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>IVIS 200 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging software</td>
			<td>Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).</td>
			<td>Living Image Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Tecan Spark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS reagent</td>
			<td>Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution</td>
			<td>(Cat:G3582)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu/Nu athymic mice</td>
			<td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>145140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Suture</td>
			<td>Medex supply</td>
			<td>ETH-8556H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Swab sticks</td>
			<td>DME Supply USA</td>
			<td>Cat: 689286X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade #11 (pk of 100)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula/probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel</td>
			<td>Exelint International</td>
			<td>D29702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Brinkman</td>
			<td>(McIlwain type)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICMORG50 or PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray machine</td>
			<td>Precision 250 kVp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth

Le metastasi cerebrali sono una grave conseguenza del cancro al seno per le donne in quanto questi tumori sono difficili da trattare e sono associati a scarsi risultati clinici. I modelli murini preclinici di crescita metastatica cerebrale del cancro al seno (BCBM) sono utili ma sono costosi ed è difficile tracciare le cellule vive e l'invasione delle cellule tumorali all'interno del parenchima cerebrale. Qui viene presentato un protocollo per colture di fette di cervello ex vivo da topi xenografati contenenti sottolinee clonali di ricerca cerebrale per cancro al seno iniettato intracranicamente. Le cellule marcate con luciferasi MDA-MB-231BR sono state iniettate intracranicamente nel cervello dei topi femmina Nu / Nu e, dopo la formazione del tumore, i cervelli sono stati isolati, affettati e coltivati ex vivo. Le fette tumorali sono state fotografate per identificare le cellule tumorali che esprimono luciferasi e monitorare la loro proliferazione e invasione nel parenchima cerebrale per un massimo di 10 giorni. Inoltre, il protocollo descrive l'uso della microscopia time-lapse per visualizzare la crescita e il comportamento invasivo delle cellule tumorali dopo il trattamento con radiazioni ionizzanti o chemioterapia. La risposta delle cellule tumorali ai trattamenti può essere visualizzata mediante microscopia live-imaging, misurando l'intensità della bioluminescenza ed eseguendo l'istologia sulla fetta di cervello contenente cellule BCBM. Pertanto, questo modello di slice ex vivo può essere una piattaforma utile per la sperimentazione rapida di nuovi agenti terapeutici da soli o in combinazione con radiazioni per identificare farmaci personalizzati per indirizzare la crescita metastatica del cervello del cancro al seno di un singolo paziente all'interno del microambiente cerebrale.

Le cellule mdA-MB-231BR-GFP-luciferasi sono state iniettate intracranicamente nell'emisfero destro di topi Nu/Nu di 4-6 settimane come spiegato sopra (Figura 1A) e sono state lasciate crescere per 12-14 giorni, durante i quali la crescita tumorale è stata monitorata mediante imaging a bioluminescenza (Figura 1B). Abbiamo iniettato 100.000 cellule tumorali in modo intracranico come riportato da altri gruppi19, ma è possibile iniettare fi...

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An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Introduciamo un protocollo per misurare in tempo reale la risposta ai farmaci e alle radiazioni delle cellule metastatiche cerebrali del cancro al seno in un modello organotipico di fetta di cervello. I metodi forniscono un test quantitativo per studiare gli effetti terapeutici di vari trattamenti sulle metastasi cerebrali da cancro al seno in modo ex vivo all'interno dell'interfaccia del microambiente cerebrale.

Un modello di fetta di cervello Ex Vivo per studiare e indirizzare la crescita del tumore metastatico cerebrale del cancro al seno

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Questo protocollo consente la formazione di cellule tumorali metastatiche cerebrali e la generazione di fette di cervello ex vivo che consentono di testare rapidamente l'efficacia del farmaco e le radiazioni su un tumore preformato. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di testare rapidamente più farmaci o trattamenti in un ambiente fisiologicamente rilevante che mantiene le interazioni cervello-tumore-ospite. Questo metodo può aiutare a capire come le cellule metastatiche del cervello crescono, sopravvivono e invadono il parenchima cerebrale e comprendere il ruolo del microambiente tumorale cerebrale nella crescita e nella diffusione del cancro.A dimostrare la procedura saranno Lorela Ciraku ed Emily Esquea, entrambe dottorande del mio laboratorio. Per iniziare, con posizionare i mouse anestetizzati in una cornice stereotassica e immobilizzare la testa usando le barre auricolari standard. Sterilizzare la superficie della testa tre volte mediante l'applicazione ripetuta alternata di tamponi di iodio e 70% di etanolo prima dell'incisione.Usando un bisturi chirurgico, fai un'incisione della linea mediana di un centimetro con un angolo diagonale rispetto all'asse immaginario dividendo il cervello dei topi in due metà simmetriche per esporre il cranio. Dopo aver asciugato il sangue con un batuffolo di cotone, deviare la pelle lateralmente per esporre il sito di iniezione. Utilizzare una punta di bava da 0,73 millimetri per penetrare nel cranio e praticare un foro con una leggera pressione e movimento di torsione.Per iniettare cinque microlitri di cellule che esprimono stabilmente la GFP luciferasi, inserire una siringa ad alta precisione a 3,5 millimetri di profondità nel cervello. Lasciare riposare per due minuti e poi tirare la siringa verso l'alto di circa un millimetro. Dopo due minuti, iniettare lentamente il primo mezzo volume e attendere altri due minuti prima di iniettare il resto del volume.Dopo tre minuti, tirare lentamente la siringa. Applicare la cera ossea sul sito di iniezione sul cranio e suturare il tessuto con suture in polipropilene. Monitorare periodicamente il comportamento del topo subito dopo l'intervento chirurgico per determinare se sono necessari trattamenti speciali, tra cui iniezione salina e cibo morbido, per aiutare un rapido recupero.Per monitorare la crescita del tumore tramite l'imaging a bioluminescenza, accendere prima l'ossigeno e l'isoflurano sul sistema di imaging e consentire che entrambi vengano distribuiti nella camera separata al di fuori della scatola di imaging. Quindi, dopo aver acceso il software e inizializzato lo strumento, scegliere l'opzione appropriata per visualizzare e catturare l'intero corpo del mouse. Quindi, trasferire i topi nella camera all'esterno della scatola di imaging fornita con ossigeno e isoflurano.Una volta che i topi sono sotto l'effetto anestetico, iniettare i topi per via intraperitoneale con 200 microlitri di 30 milligrammi per millilitro di luciferina. Posizionare i topi nella camera di imaging con lo stomaco rivolto verso il basso verso il labbro del naso delle camere di imaging. Bloccare la camera, scegliere due minuti di esposizione per avviare l'imaging e quindi completare l'imaging.Dopo aver posizionato l'affettatrice per tessuti in una cappa a flusso laminare sterile, pulire tutti gli strumenti e gli strumenti con etanolo al 70%. Dopo l'eutanasia del topo, rimuovere e posizionare rapidamente il cervello in una soluzione ghiacciata di saccarosio-ACSF. Usando una spatola, trasferire il cervello su una carta da filtro bagnata ACSF su un coperchio del piatto da 60 millimetri.Usando una lama di rasoio affilata e sterile, taglia le parti in eccesso del cervello che non contengono alcun tumore, compresa la parte inferiore del cervello, per portare la forma del cervello a un cubo non perfetto. Dopo aver posizionato diversi fogli di carta da filtro bagnata ACSF sulla piattaforma di taglio, posizionare il tessuto bloccato sulla carta da filtro. Per affettare il tessuto in sezioni spesse da 200 a 250 micrometri, impostare la dimensione del taglio su 2 o 2,5 unità sul righello del fornitore e iniziare a tagliare.Usa un pennello per trasferire le fette di cervello in un piatto contenente saccarosio-ACSF e separa le fette al microscopio ottico usando aghi calibro 27. Identificare le fette GFP-positive al microscopio fluorescente. Quindi, utilizzando una pipetta sterile rotta da un millilitro con un'ampia apertura, trasferire le fette identificate in un nuovo piatto da 60 millimetri contenente da due a tre millilitri di media a fette per adulti.Quindi, trasferire da tre a cinque fette su ogni inserto di coltura tissutale in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti a distanza di sicurezza. Dopo aver rimosso il mezzo in eccesso dalla superficie dell'inserto, aggiungere un millilitro di mezzo di fetta di topo adulto equilibrato sotto ogni inserto. Incubare i tessuti a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità per 24 ore prima dell'imaging.Pipettare cinque microlitri da 30 milligrammi per millilitro di soluzione di luciferina nel mezzo sotto gli inserti all'interno di un cappuccio sterile. Posizionare la piastra a sei pozzetti con il coperchio all'interno della camera di imaging dello strumento sotto la telecamera fissa e bloccare la porta della camera. Aprire il software e inizializzare lo strumento.Dopo aver scelto le impostazioni della fotocamera che consentono la visualizzazione e l'acquisizione di un solo pozzo per immagine, posizionare il pozzo da visualizzare direttamente sotto la fotocamera. Usa lo strumento ROI, adattalo alla forma e alle dimensioni del tumore, misura il ROI e riporta le letture totali per quantificare il segnale bioluminescente di ciascun tumore sulla fetta. Dopo aver riportato la piastra alla cappa a flusso laminare sterile, utilizzare una pinza per sollevare leggermente l'inserto dal pozzo.Dopo aver aspirato il mezzo, sostituire il mezzo con un millilitro di mezzo fresco e riposizionare l'inserto nel pozzetto. Per gli esperimenti in cui le fette sono trattate con vari composti, come inibitori e metaboliti, preparare la concentrazione appropriata di reagente in 1,2 millilitri di mezzo di fetta di cervello in un tubo da 1,5 millilitri, quindi trasferire un millilitro di reagente al pozzo contenente la fetta. Le cellule di luciferasi MDA-MB-231 BR-GFP sono state iniettate in topi nudi, i tumori sono stati lasciati crescere, i cervelli con tumori sono stati sezionati, affettati, cresciuti ex vivo e la crescita del tumore è stata monitorata mediante imaging a bioluminescenza.La colorazione H&E e la fluorescenza GFP-positiva hanno confermato la presenza di un tumore nella fetta di cervello. L'aumento della colorazione Ki-67 ha confermato la presenza di cellule tumorali altamente proliferative. I tumori nelle fette di cervello che non sono stati esposti all'irradiazione hanno continuato a crescere ex vivo, mentre i tumori esposti all'irradiazione hanno mostrato una crescita in stallo.Le fette di cervello contenenti tumori sono state monitorate anche tramite imaging dal vivo per visualizzare la crescita del tumore dopo il trattamento di irradiazione. Coerentemente con l'imaging bioluminescente, le cellule tumorali di controllo sono cresciute rapidamente con l'aumentare dell'intensità della GFP e le cellule hanno iniziato a invadere il parenchima cerebrale. Al contrario, le cellule tumorali nelle fette di cervello trattate con irradiazione erano citostatiche e l'intensità della GFP è stata mantenuta.Sono state rilevate grandi cellule tumorali multi-nucleate e un aumento della colorazione del marcatore di danno al DNA nelle cellule tumorali trattate con IR. Inoltre, è stato rilevato un aumento degli astrociti reattivi. L'apoptosi indotta dal trattamento IR non è stata rilevata nelle fette di cervello di topo prive di tumore.Le fette di cervello contenenti tumori sono state trattate con diverse concentrazioni di paclitaxel, un farmaco chemioterapico. Il trattamento ha ridotto significativamente le dimensioni del tumore dopo il giorno 10 del trattamento. Un aumento dell'apoptosi è stato rilevato nelle cellule tumorali trattate con paclitaxel.Il trattamento con inibitori non ha alterato la vitalità del tessuto cerebrale. Nessun aumento dell'apoptosi è stato misurato mediante colorazione di caspasi-3 scissa in fette di cervello di topo senza tumore trattate con paclitaxel. Quando il trattamento con i farmaci di interesse è terminato, le fette possono essere analizzate per l'espressione proteica attraverso immunocitochimica, studi omici o ottenere sospensioni unicellulari adatte alla citometria a flusso.

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