Name: an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00
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ジュリア・ファーナン、ケイラ・グリーン、ティツィアナ・デアンジェリスの技術支援に感謝します。この研究は、ペンシルベニア州ユニバーサル研究強化助成金プログラム(MJR、JGJ)、UO1CA244303(MJR)、R01CA227479(NLS)、R00CA207855(EJH)、およびW.W. Smith Charitable Trusts(EjH)によって部分的に支援されました。

このプロトコルは、ドレクセル大学医学部施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、動物ケアガイドラインに従っています。Nu/Nu無胸腺雌マウス(6〜8週齢)を本研究に使用した。
1. 腫瘍細胞の頭蓋内注射
<ol><li>滅菌インジケータを含む滅菌パウチで、オートクレーブの乾燥サイクル下ですべての機器(ピンセット、はさみ、縫合はさみ、ハンドドリル)を滅菌...

<ol>
	<li>Watase, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+brain+metastasis-overview+of+disease+state,+treatment+options+and+future+perspectives.">Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives.</a> Cancers. 13 (5), (2021).</li><li>Niikura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+outcomes+and+prognostic+factors+for+patients+with+brain+metastases+from+breast+cancer+of+each+subtype:+a+multicenter+retrospective+analysis.">Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).</li><li>Fong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Parker, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+glioblastoma+organotypic+slice+culture+model+for+study+of+tumor+cell+migration+and+patient-specific+effects+of+anti-invasive+drugs.">A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).</li><li>Chuang, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculture+system+with+an+organotypic+brain+slice+and+3D+spheroid+of+carcinoma+cells.">Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).</li><li>Hohensee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+mediates+the+cross+talk+between+breast+and+glial+cells+in+brain+metastases+leading+to+rapid+disease+progression.">PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression.</a> Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).</li><li>van de Merbel, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain.">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).</li><li>Kyeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+breast+cancer+show+different+spatial+distributions+of+brain+metastases.">Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases.</a> PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).</li><li>Hengel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attributes+of+brain+metastases+from+breast+and+lung+cancer.">Attributes of brain metastases from breast and lung cancer.</a> International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).</li><li>Jackson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters.">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).</li><li>Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+mitochondrial+dynamics+and+trafficking+in+astrocytes.">Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).</li><li>Simone, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+oxidative+stress+alters+miRNA+expression.">Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression.</a> PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).</li><li>Couturier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+that+glioblastoma+recapitulates+a+normal+neurodevelopmental+hierarchy.">Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy.</a> Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).</li><li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).</li><li>Fitzgerald, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+glia+are+recruited+by+highly+proliferative+brain+metastases+of+breast+cancer+and+promote+tumor+cell+colonization.">Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).</li><li>Kondru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ex+Vivo+Brain+Slice+Culture+Model+of+Chronic+Wasting+Disease:+Implications+for+Disease+Pathogenesis+and+Therapeutic+Development.">An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development.</a> Scientific Reports. 10 (1), (2020).</li><li>Abu Samaan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel's+mechanistic+and+clinical+effects+on+breast+cancer.">Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer.</a> Biomolecules. 9 (12), (2019).</li><li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies.">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).</li><li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metastasis+cell+lines+panel:+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines.">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li></ol>

この研究は、外植異種移植片脳腫瘍のための新規なex vivo 脳培養方法を確立する。我々は、マウスの脳に頭蓋内注射されたBCBM細胞MDA-MB-231BR細胞が 、エクスビボ 脳スライス中で生存および増殖し得ることを示す。この研究はまた、頭蓋内注射されたU87MG膠芽腫(GBM)細胞を試験し、これらの癌細胞が脳スライスで生き残り、増殖することも見出した(データは示されていない)。この?...

乳がんの脳転移(BCBM)は、原発性乳房腫瘍から脳に細胞が広がると発症します。乳がんは、肺がんに次いで脳転移の2番目に頻繁な原因であり、転移は患者の10〜16%で起こる1。残念なことに、患者の>80%が脳転移診断後1年以内に死亡し、神経機能障害のために生活の質が損なわれているため、脳転移は依然として不治の病のままです2。より効果的な治療選択肢を特定することが急務です。単層二次元または三次元培養モデルは、実験室で治療薬を試験する際に最も一般的に使用される方法である。しかし、それらは、腫瘍表現型および増殖の主要な要因である複雑なBCBM微小環境を模倣していない。これらのモデルは有用であるが、腫瘍の複雑な間質相互作用、固有の代謝要求、および腫瘍の不均一性を捉えていない3。腫瘍間質相互作用と微小環境の不均一性をより忠実に再現するために、我々のグループと他のグループは、患者由来の腫瘍細胞(原発性または転移性)または癌細胞株を用いて有機型脳転移「スライス」培養物を生成し始めている4,5,6。古典的なin vitroシステムと比較して、この短期のex vivoモデルは、大型動物コホートにおける前臨床評価の前に新しい治療法をスクリーニングするためのより関連性の高い条件を提供する可能性がある。
エクスビボモデルは、主に様々な癌の成功した治療法の同定のために構築され、首尾よく使用されてきた。評価には数日が必要であり、さらに患者固有の薬物スクリーニングに合わせて調整することができます。例えば、ヒト膀胱および前立腺癌エクスビボ組織は、ドセタキセルおよびゲムシタビンの用量依存的な抗腫瘍応答を示している7。同様の結腸直腸癌のエクスビボ組織が、化学療法薬オキサリプラチン、セツキシマブ、およびペムブロリズマブ8をスクリーニングするために開発された。この用途は、間質環境と膵管腺癌の遺伝子型および表現型特性との間の本質的な相互作用を考慮して、膵臓癌において広く使用されている9,10。さらに、このような有機型モデルが、頭部、頸部、胃、および乳房腫瘍における同様のスクリーニングのために開発されている11、12。
ここで、異種移植乳癌脳転移性腫瘍細胞のエクスビボ脳スライスモデルをそれらの微小環境において生成させている。マウスに乳癌脳転移性脳栄養性MDA-MB-231BR細胞13を大脳皮質頭頂葉-TNBC転移14、15の共通部位に頭蓋内注射し、腫瘍を発症させた。脳スライスを、これらの異種移植動物から生成し、16、17に記載のように器官型培養物としてエクスビボで維持した。この新規なエクスビボモデルは、脳実質内のBCBM細胞の成長の分析を可能にし、脳微小環境内の腫瘍細胞に対する治療薬および放射線効果の試験に使用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, slip tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G1/2 Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microscope and LUMAVIEW software</td>
			<td>Etaluma</td>
			<td>LS720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (GEM21)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-210-685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt sable paintbrush, Size #5/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Wax</td>
			<td>ModoMed</td>
			<td>DYNJBW25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain injection Syringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP510-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase 3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14220S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060(95-0043)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-805a (1001-042)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sable paintbrush #2/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-H2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Corning cellgrow</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E and KI-67</td>
			<td>Jefferson Core Facility Pathology staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>YCQ2851920086082DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Just for mice Stereotaxic Frame</td>
			<td>Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).</td>
			<td>72-6049, 72-6044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231BR cells</td>
			<td>Kindly provided by Dr. Patricia Steeg</td>
			<td>Ref 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging device</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>IVIS 200 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging software</td>
			<td>Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).</td>
			<td>Living Image Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Tecan Spark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS reagent</td>
			<td>Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution</td>
			<td>(Cat:G3582)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu/Nu athymic mice</td>
			<td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>145140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Suture</td>
			<td>Medex supply</td>
			<td>ETH-8556H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Swab sticks</td>
			<td>DME Supply USA</td>
			<td>Cat: 689286X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade #11 (pk of 100)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula/probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel</td>
			<td>Exelint International</td>
			<td>D29702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Brinkman</td>
			<td>(McIlwain type)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICMORG50 or PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray machine</td>
			<td>Precision 250 kVp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth

脳転移は、これらの腫瘍が治療が困難であり、臨床転帰不良と関連しているため、女性にとって乳癌の重篤な結果である。乳癌脳転移(BCBM)増殖の前臨床マウスモデルは有用であるが高価であり、脳実質内での生細胞および腫瘍細胞浸潤を追跡することは困難である。ここに提示されるのは、頭蓋内注射された乳癌脳シーククローンサブラインを含む異種移植マウスからの ex vivo 脳スライス培養のためのプロトコールである。 MDA-MB-231BR ルシフェラーゼタグ付き細胞をNu/Nu雌マウスの脳に頭蓋内注射し、腫瘍形成後、脳を単離、スライス、 エクスビボで培養した。腫瘍スライスを画像化して、ルシフェラーゼを発現する腫瘍細胞を同定し、脳実質におけるそれらの増殖および浸潤を最大10日間モニターした。さらに、このプロトコルは、電離放射線または化学療法による治療後の腫瘍細胞の増殖および浸潤挙動を画像化するためのタイムラプス顕微鏡の使用を記載している。治療に対する腫瘍細胞の応答は、ライブイメージング顕微鏡、生物発光強度の測定、およびBCBM細胞を含む脳スライスの組織学の実施によって視覚化することができる。したがって、この エキソビボ スライスモデルは、脳微小環境内の個々の患者の乳癌脳転移増殖を標的とするようにパーソナライズされた薬物を同定するために、新規治療薬を単独で、または放射線と組み合わせて迅速に試験するための有用なプラットフォームであり得る。

MDA-MB-231BR-GFP-ルシフェラーゼ細胞を、上記で説明したように4~6週齢のNu/Nuマウスの右半球に頭蓋内注射し(図1A)、12~14日間増殖させ、その間、腫瘍の成長を生物発光イメージングによってモニターした(図1B)。他のグループ19で報告されているように、100,000個のがん細胞を頭蓋内に注射しましたが、20,000個の細胞20個...

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An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

乳がん脳転移細胞の薬物および放射線応答を器官型脳スライスモデルでリアルタイムに測定するためのプロトコルを紹介します。本方法は、脳微小環境界面内での乳癌からの脳転移に対する様々な治療の治療効果を ex vivo 方式で調査するための定量的アッセイを提供する。

乳がん脳転移性腫瘍増殖を研究し、標的とする Ex Vivo 脳スライスモデル

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

このプロトコルは、脳転移性腫瘍細胞の形成および既成腫瘍に対する薬物有効性および放射線の迅速な試験を可能にするex vivo脳スライスの生成を可能にする。この技術の主な利点は、脳-腫瘍-宿主相互作用を維持する生理学的に関連する環境で複数の薬物または治療法を迅速に試験できることである。この方法は、脳転移細胞がどのように成長し、生存し、脳実質に侵入するかを理解し、癌の成長および広がりにおける脳腫瘍微小環境の役割を理解するのに役立つ可能性がある。この手順を実演するのは、私の研究室の博士候補であるLorela CirakとEmily Esqueaです。まず、麻酔をかけたマウスを定位フレームに入れ、標準的なイヤーバーを使用して頭を固定します。切開前にヨウ素綿棒と70%エタノールを交互に繰り返し塗布することによって、頭部の表面を3回滅菌する。外科用メスを使用して、マウスの脳を2つの対称的な半分に分割し、頭蓋骨を露出させるために、虚数軸に対して対角線角度で1センチメートルの正中線切開を行う。綿棒で血液を拭いた後、皮膚を横にそらして注射部位を露出させます。0.73ミリメートルのバリビットを使用して頭蓋骨を貫通し、わずかな圧力とねじれ運動を使用して穴を開けます。GFPルシフェラーゼを安定に発現する細胞5マイクロリットルを注入するには、高精度シリンジを脳内の深さ3.5ミリメートルに挿入する。それが2分間落ち着くのを許してから、シリンジを約1ミリメートル引き上げます。2分後、最初の半分のボリュームをゆっくりと注入し、さらに2分間待ってから残りのボリュームを注入します。3分後、ゆっくりとシリンジを引く。頭蓋骨の注射部位に骨ワックスを塗布し、ポリプロピレン縫合糸で組織を縫合する。手術直後のマウスの行動を定期的に監視して、生理食塩水注射やソフトフードなどの特別な治療が迅速な回復に役立つかどうかを判断する。生物発光イメージングを介して腫瘍の成長を監視するには、まずイメージングシステム上の酸素とイソフルランをオンにし、両方をイメージングボックスの外側の別々のチャンバに分配できるようにします。次に、ソフトウェアをオンにして機器を初期化した後、マウス本体全体を視覚化してキャプチャするための適切なオプションを選択します。次に、酸素とイソフルランを供給した撮像箱の外側のチャンバーにマウスを移す。マウスが麻酔効果を受けたら、マウスに200マイクロリットルのルシフェリン1ミリリットルあたり30ミリグラムを腹腔内に注射する。マウスを、胃が鼻唇を撮像室に下に向けて画像化室内に置く。チャンバーをロックし、露光時間 2 分を選択してイメージングを開始し、イメージングを完了します。組織スライサーを滅菌層流フードに入れた後、すべてのツールと器具を70%エタノールで洗浄します。マウスを安楽死させた後、脳を取り出し、氷冷スクロースACSF溶液に素早く入れます。ヘラを使用して、60ミリメートルの皿蓋の上のACSF濡れろ紙に脳を移す。鋭利で滅菌されたカミソリの刃を使用して、脳の底部を含む腫瘍を含まない脳の余分な部分を切断し、脳の形状を非完全な立方体にする。ACSFで濡らしたろ紙を数枚切断プラットフォーム上に置いた後、ブロックされた組織をろ紙の上に置きます。組織を厚さ 200 ~ 250 マイクロメートルのセクションにスライスするには、プロバイダ定規で切断サイズを 2 または 2.5 単位に設定し、切断を開始します。ペイントブラシを使用して脳スライスをスクロース-ACSFを含む皿に移し、27ゲージの針を使用して光学顕微鏡下でスライスを分離します。蛍光顕微鏡下でGFP陽性スライスを同定する。次いで、広い開口部を有する滅菌1ミリリットルの壊れたピペットを用いて、同定されたスライスを、2〜3ミリリットルの成人スライス培地を含む新しい60ミリシャーレに移す。次いで、6ウェルプレートの各ウェル内の各組織培養インサート上に3〜5枚のスライスを安全な距離で移す。インサートの表面から余分な培地を除去した後、各インサートの下に平衡化した成体マウススライス培地を1ミリリットル加える。イメージングする前に、組織を摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度95%で24時間インキュベートします。1ミリリットル当たり30ミリグラムのルシフェリン溶液5マイクロリットルを滅菌フード内のインサートの下の培地にピペットする。固定カメラの下の機器の撮像チャンバ内に蓋付きの6ウェルプレートを置き、チャンバドアをロックします。ソフトウェアを開き、計測器を初期化します。画像ごとに 1 つのウェルのみの視覚化とキャプチャを可能にするカメラ設定を選択したら、イメージするウェルをカメラの真下に配置します。ROIツールを使用して、腫瘍の形状と大きさの周りにそれを合わせ、ROIを測定し、総測定値を報告して、スライス上の各腫瘍の生物発光シグナルを定量化します。プレートを滅菌層流フードに戻した後、鉗子を使用してインサートをウェルからわずかに持ち上げます。培地を吸引した後、培地を1ミリリットルの新鮮な培地と交換し、差し込み口をウェルに戻します。スライスを阻害剤や代謝産物などの各種化合物で処理する実験では、1.5ミリリットルのチューブで1.2ミリリットルの脳スライス培地に適切な試薬濃度を調製し、スライスを含むウェルに1ミリリットルの試薬を移します。MDA-MB-231 BR-GFPルシフェラーゼ細胞をヌードマウスに注射し、腫瘍を増殖させ、腫瘍を有する脳を解剖し、スライスし、エクスビボで増殖させ、腫瘍増殖を生物発光イメージングによってモニターした。H&E染色およびGFP陽性蛍光は、脳スライスにおける腫瘍の存在を確認した。Ki−67染色の増加は、増殖性の高い癌細胞の存在を確認した。照射に曝されなかった脳スライス中の腫瘍は、エクスビボで増殖し続けたが、放射線照射に曝露された腫瘍は、持続的な成長を示した。腫瘍を含む脳スライスもライブイメージングを介してモニターし、照射処理後の腫瘍増殖を可視化した。生物発光イメージングと一致して、対照癌細胞はGFP強度が増加し、細胞が脳実質に侵入し始めるにつれて急速に成長した。対照的に、照射で処理した脳スライス中の癌細胞は細胞増殖抑制され、GFP強度は維持されていた。大きな多核癌細胞およびIR処理癌細胞におけるDNA損傷マーカーの染色の増加が検出された。また、反応性アストロサイトの増加も検出された。IR処置誘発性アポトーシスは、腫瘍のないマウス脳スライスでは検出されなかった。腫瘍を含む脳スライスを、化学療法薬であるパクリタキセルの異なる濃度で処理した。治療は、治療の10日目に腫瘍のサイズを有意に減少させた。アポトーシスの増加は、パクリタキセル処理腫瘍細胞において検出された。インヒビター治療は脳組織の生存率を変化させなかった。アポトーシスの増加は、パクリタキセル処理された腫瘍のないマウス脳スライスにおける切断されたカスパーゼ−3染色によって測定されなかった。目的の薬物による治療が終了したら、スライスを免疫細胞化学、オミック研究を通じてタンパク質発現について分析するか、フローサイトメトリーに適した単一細胞懸濁液を達成することができます。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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