Name: an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00
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Julia Farnan, Kayla Green 및 Tiziana DeAngelis의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 펜실베니아 연방 유니버설 연구 향상 보조금 프로그램 (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) 및 W.W. Smith Charitable Trusts (EjH)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

이 프로토콜은 Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)의 동물 관리 지침을 승인하고 준수합니다. Nu/Nu 흉선 여성 마우스(6-8주령)를 본 연구에 사용하였다.
1. 종양 세포의 두개내 주사
<ol><li>모든 장비 (핀셋, 가위, 봉합 가위, 핸드 드릴)를 오토클레이브의 건조 사이클 하에서 살균 표시기를 포함한 살균 파우치에서 최대 45 분 동안 멸균하십시오. ?...

<ol>
	<li>Watase, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+brain+metastasis-overview+of+disease+state,+treatment+options+and+future+perspectives.">Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives.</a> Cancers. 13 (5), (2021).</li><li>Niikura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+outcomes+and+prognostic+factors+for+patients+with+brain+metastases+from+breast+cancer+of+each+subtype:+a+multicenter+retrospective+analysis.">Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).</li><li>Fong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Parker, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+glioblastoma+organotypic+slice+culture+model+for+study+of+tumor+cell+migration+and+patient-specific+effects+of+anti-invasive+drugs.">A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).</li><li>Chuang, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculture+system+with+an+organotypic+brain+slice+and+3D+spheroid+of+carcinoma+cells.">Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).</li><li>Hohensee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+mediates+the+cross+talk+between+breast+and+glial+cells+in+brain+metastases+leading+to+rapid+disease+progression.">PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression.</a> Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).</li><li>van de Merbel, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+Tissue+culture+model+for+the+assessment+of+individualized+drug+responses+in+prostate+and+bladder+cancer.">An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer.</a> Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).</li><li>Martin, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tissue+slice+culture+system+to+measure+drug-response+rates+of+hepatic+metastatic+colorectal+cancer.">Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer:+a+novel+tumor-promoting+cell+type.">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).</li><li>Lim, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+preserve+the+tumor+microenvironment+and+provide+a+platform+for+drug+response.">Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response.</a> Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain.">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).</li><li>Kyeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+breast+cancer+show+different+spatial+distributions+of+brain+metastases.">Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases.</a> PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).</li><li>Hengel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attributes+of+brain+metastases+from+breast+and+lung+cancer.">Attributes of brain metastases from breast and lung cancer.</a> International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).</li><li>Jackson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters.">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).</li><li>Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+mitochondrial+dynamics+and+trafficking+in+astrocytes.">Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).</li><li>Simone, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+oxidative+stress+alters+miRNA+expression.">Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression.</a> PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).</li><li>Couturier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+that+glioblastoma+recapitulates+a+normal+neurodevelopmental+hierarchy.">Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy.</a> Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).</li><li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).</li><li>Fitzgerald, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+glia+are+recruited+by+highly+proliferative+brain+metastases+of+breast+cancer+and+promote+tumor+cell+colonization.">Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).</li><li>Kondru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ex+Vivo+Brain+Slice+Culture+Model+of+Chronic+Wasting+Disease:+Implications+for+Disease+Pathogenesis+and+Therapeutic+Development.">An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development.</a> Scientific Reports. 10 (1), (2020).</li><li>Abu Samaan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel's+mechanistic+and+clinical+effects+on+breast+cancer.">Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer.</a> Biomolecules. 9 (12), (2019).</li><li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies.">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).</li><li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metastasis+cell+lines+panel:+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines.">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li></ol>

이 연구는 외래식 이종이식편 뇌종양에 대한 새로운 생체외 뇌 배양 방법을 확립한다. 우리는 BCBM 세포 MDA-MB-231BR 세포가 마우스의 뇌에 두개내 주사되어 생체외 뇌 절편에서 생존하고 성장할 수 있음을 보여줍니다. 이 연구는 또한 두개내 주사 된 U87MG 교모세포종 (GBM) 세포를 테스트했으며 이러한 암세포가 뇌 조각에서 생존하고 성장한다는 것을 발견했습니다 (데이터는 표시되지 않...

유방암 뇌 전이 (BCBM)는 세포가 원발성 유방 종양에서 뇌로 퍼질 때 발생합니다. 유방암은 폐암 후 뇌 전이의 두 번째로 빈번한 원인이며, 전이는 환자의 10-16 %에서 발생합니다1. 불행히도, 뇌 전이 환자의 >80 %가 뇌 전이 진단 후 일년 이내에 사망하고 신경 기능 장애로 인해 삶의 질이 저하되기 때문에 뇌 전이는 여전히 치료할 수 없습니다2. 보다 효과적인 치료 옵션을 확인하는 것이 시급합니다. 단층 이차원 또는 입체 배양 모델은 실험실에서 치료제를 테스트하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그러나, 그들은 종양 표현형과 성장의 주요 동인인 복잡한 BCBM 미세환경을 모방하지 않는다. 이들 모델이 유용하지만, 이들은 복잡한 종양-기질 상호작용, 독특한 대사 요건, 및 종양의 이질성을 포착하지 못한다3. 종양-기질 상호작용 및 미세환경 이질성을 보다 충실하게 재조정하기 위해, 우리 그룹과 다른 사람들은 환자 유래 종양 세포(원발성 또는 전이성) 또는 암 세포주 4,5,6을 이용한 유기형 뇌 전이 "슬라이스" 배양물을 생성하기 시작했다. 고전적인 시험관내 시스템과 비교하여, 이러한 단기 생체외 모델은 대규모 동물 코호트에서 전임상 평가 전에 새로운 치료제를 스크리닝하기 위한 보다 관련성이 높은 조건을 제공할 수 있다.
Ex vivo 모델은 주로 다양한 암의 성공적인 치료법을 확인하기 위해 구축되고 성공적으로 사용되었습니다. 그들은 며칠의 평가가 필요하며 추가로 환자 별 약물 검사에 맞출 수 있습니다. 예를 들어, 인간 방광 및 전립선암 생체외 조직은 도세탁셀 및 겜시타빈7의 용량 의존적 항종양 반응을 나타내었다. 유사한 결장직장 암종 생체외 조직이 화학요법 약물인 옥살리플라틴, 세툭시맙 및 펨브롤리주맙8을 스크리닝하기 위해 개발되었다. 본 출원은 기질 환경과 췌장덕트 선암종 9,10의 유전형 및 표현형 특성 사이의 필수적인 상호작용을 고려하여 췌장암에서 널리 사용되어 왔다. 더욱이, 이러한 유기형 모델은 머리, 목, 위 및 유방 종양(11,12)에서 유사한 스크리닝을 위해 개발되었다.
여기서, 이종이식편된 유방암 뇌전이성 종양 세포의 생체외 뇌 슬라이스 모델이 그들의 미세환경에서 생성되고 있다. 마우스는 TNBC 전이 14,15의 공통 부위인 대뇌 피질 정수리 엽에 유방암 뇌 전이성 뇌 영양 MDA-MB-231BR 세포13을 두개내 주사하고 종양을 발생시키도록 허용하였다. 뇌 절편은 이들 이종이식편된 동물로부터 생성되었고,16,17에 기재된 바와 같이 유기형 배양물로서 생체외를 유지하였다. 이 신규한 생체외 모델은 뇌 실질종 내에서 BCBM 세포의 성장 분석을 허용하고 뇌 미세환경 내의 종양 세포에 대한 치료제 및 방사선 효과를 시험하는데 사용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, slip tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G1/2 Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microscope and LUMAVIEW software</td>
			<td>Etaluma</td>
			<td>LS720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (GEM21)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-210-685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt sable paintbrush, Size #5/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Wax</td>
			<td>ModoMed</td>
			<td>DYNJBW25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain injection Syringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP510-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase 3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14220S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060(95-0043)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-805a (1001-042)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sable paintbrush #2/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-H2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Corning cellgrow</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E and KI-67</td>
			<td>Jefferson Core Facility Pathology staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>YCQ2851920086082DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Just for mice Stereotaxic Frame</td>
			<td>Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).</td>
			<td>72-6049, 72-6044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231BR cells</td>
			<td>Kindly provided by Dr. Patricia Steeg</td>
			<td>Ref 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging device</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>IVIS 200 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging software</td>
			<td>Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).</td>
			<td>Living Image Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Tecan Spark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS reagent</td>
			<td>Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution</td>
			<td>(Cat:G3582)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu/Nu athymic mice</td>
			<td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>145140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Suture</td>
			<td>Medex supply</td>
			<td>ETH-8556H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Swab sticks</td>
			<td>DME Supply USA</td>
			<td>Cat: 689286X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade #11 (pk of 100)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula/probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel</td>
			<td>Exelint International</td>
			<td>D29702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Brinkman</td>
			<td>(McIlwain type)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICMORG50 or PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray machine</td>
			<td>Precision 250 kVp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth

뇌 전이는 이러한 종양이 치료하기 어렵고 열악한 임상 결과와 관련이 있기 때문에 여성에게 유방암의 심각한 결과입니다. 유방암 뇌 전이성 (BCBM) 성장의 전임상 마우스 모델은 유용하지만 고가이며, 뇌 실질 내에서 살아있는 세포 및 종양 세포 침윤을 추적하기가 어렵다. 여기에 제시된 것은 두개골 내 주사된 유방암 뇌-추구 클론 서브라인을 함유하는 이종이식편된 마우스로부터의 생체외 뇌 슬라이스 배양을 위한 프로토콜이다. MDA-MB-231BR 루시퍼라아제 태깅된 세포를 Nu/Nu 암컷 마우스의 뇌에 두개내 주사하고, 종양 형성 후, 뇌를 분리하고, 슬라이스하고, 생체외 배양하였다. 종양 절편을 영상화하여 루시퍼라아제를 발현하는 종양 세포를 확인하고 최대 10일 동안 뇌 실질에서 증식 및 침윤을 모니터링하였다. 또한, 프로토콜은 이온화 방사선 또는 화학요법으로 치료한 후 종양 세포의 성장 및 침습적 거동을 이미지화하기 위한 타임랩스 현미경의 사용을 기술한다. 치료에 대한 종양 세포의 반응은 라이브 이미징 현미경, 생체 발광 강도 측정, BCBM 세포를 포함하는 뇌 조각에 대한 조직학 수행으로 시각화 할 수 있습니다. 따라서, 이러한 생체외 슬라이스 모델은 뇌 미세환경 내에서 개별 환자의 유방암 뇌 전이성 성장을 표적으로 하는 개인화된 약물을 식별하기 위해 신규한 치료제를 단독으로 또는 방사선과 조합하여 신속하게 시험하는데 유용한 플랫폼이 될 수 있다.

MDA-MB-231BR-GFP-루시퍼라제 세포를 상기 설명된 바와 같이 4-6주령의 Nu/Nu 마우스의 우반구에 두개내 주사하고(도 1A) 12-14일 동안 성장시키고, 이 기간 동안 종양 성장을 생체발광 영상에 의해 모니터링하였다(도 1B). 우리는 다른 그룹19에 의해보고 된 것처럼 100,000 개의 암세포를 두개골 내로 주사했지만 20,000 세포만큼 낮은20...

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An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

우리는 유기형 뇌 슬라이스 모델에서 유방암 뇌 전이성 세포의 실시간 약물 및 방사선 반응을 측정하기위한 프로토콜을 소개합니다. 상기 방법은 뇌 미세환경 계면 내에서 생체외 방식으로 유방암으로부터의 뇌 전이에 대한 다양한 치료법의 치료 효과를 조사하기 위한 정량적 검정을 제공한다.

유방암 뇌 전이성 종양 성장을 연구하고 표적으로 삼는 Ex Vivo 뇌 슬라이스 모델

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

이 프로토콜은 뇌 전이성 종양 세포의 형성과 미리 형성된 종양에 대한 약물 효능 및 방사선의 신속한 테스트를 허용하는 생체외 뇌 절편의 생성을 허용합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 뇌 - 종양 - 숙주 상호 작용을 유지하는 생리 학적 관련 환경에서 여러 약물 또는 치료법을 신속하게 테스트 할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 뇌 전이성 세포가 어떻게 성장하고, 생존하고, 뇌 실질마를 침범하는지 이해하고 암 성장 및 확산에서 뇌 종양 미세 환경의 역할을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 Lorela Ciraku와 Emily Esquea, 내 실험실의 박사 학위 후보자가 될 것입니다. 우선, 마취 된 마우스를 입체 택시 프레임에 넣고 표준 이어 바를 사용하여 머리를 고정시킵니다. 절개 전에 요오드 면봉과 70 % 에탄올을 번갈아 가며 반복하여 머리 표면을 세 번 살균하십시오.외과 적 메스를 사용하여 상상의 축에 대각선 각도로 한 센티미터 중간 선 절개를 만들어 마우스의 뇌를 두 개의 대칭 반쪽으로 나누어 두개골을 노출시킵니다. 면봉으로 혈액을 닦은 후 피부를 옆으로 편향시켜 주사 부위를 노출시킵니다. 0.73 밀리미터 버 비트를 사용하여 두개골에 침투하고 약간의 압력과 비틀림 동작으로 구멍을 뚫습니다.GFP 루시페라아제를 안정적으로 발현하는 5마이크로리터의 세포를 주입하려면 뇌에서 3.5mm 깊이까지 고정밀 주사기를 삽입합니다. 두 분 동안 정착 한 다음 주사기를 약 한 밀리미터 위로 당깁니다. 두 분 후, 천천히 첫 번째 절반 볼륨을 주입하고 나머지 볼륨을 주입하기 전에 또 다른 두 분 동안 기다립니다.세 분 후에 천천히 주사기를 당깁니다. 두개골의 주사 부위에 뼈 왁스를 바르고 폴리 프로필렌 봉합사로 조직을 봉합하십시오. 수술 직후 마우스의 행동을 주기적으로 모니터링하여 빠른 회복을 돕기 위해 식염수 주사와 부드러운 음식을 포함한 특별한 치료가 필요한지 확인하십시오.생체 발광 이미징을 통해 종양 성장을 모니터링하려면 먼저 이미징 시스템에서 산소와 이소플루란을 켜고 이미징 박스 외부의 별도의 챔버에 둘 다 분배되도록 합니다. 그런 다음 소프트웨어를 켜고 계측기를 초기화 한 후 마우스 몸체 전체를 시각화하고 캡처하는 데 적합한 옵션을 선택하십시오. 다음으로, 마우스를 산소 및 이소플루란이 공급된 이미징 박스 외부의 챔버로 옮긴다.마우스가 마취 효과를 받으면 마우스를 복강 내 루시페린 밀리리터 당 30 밀리그램의 200 마이크로 리터로 주사하십시오. 마우스를 이미징 챔버 코 입술에 아래를 향하게하는 위장을 이미징 챔버에 놓습니다. 챔버를 잠그고 두 분 시간 노출을 선택하여 이미징을 시작한 다음 이미징을 완료합니다.멸균 된 층류 후드에 조직 슬라이서를 놓은 후 모든 도구와 도구를 70 % 에탄올로 청소하십시오. 마우스를 안락사시킨 후, 뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 수크로스-ACSF 용액에 빠르게 넣는다. 주걱을 사용하여 60mm 접시 뚜껑에 ACSF로 젖은 여과지에 뇌를 옮깁니다.날카롭고 멸균 된 면도날을 사용하여 뇌의 바닥 부분을 포함하여 종양이 포함되지 않은 뇌의 과도한 부분을 잘라 뇌의 모양을 완벽하지 않은 큐브로 만듭니다. ACSF로 젖은 여과지 몇 장을 절단 플랫폼 위에 놓은 후 차단된 조직을 여과지 위에 놓습니다. 조직을 200~250마이크로미터 두께의 섹션으로 분할하려면 공급자 눈금자에서 절단 크기를 2 또는 2.5단위로 설정하고 절단을 시작합니다.페인트 브러시를 사용하여 뇌 조각을 수크로오스-ACSF가 들어있는 접시에 옮기고 27 게이지 바늘을 사용하여 광학 현미경으로 조각을 분리하십시오. GFP 양성 슬라이스를 형광 현미경으로 확인한다. 그런 다음 넓은 개구부가있는 멸균 된 한 밀리리터의 깨진 피펫을 사용하여 식별 된 조각을 두 세 밀리리터의 성인 슬라이스 배지가 들어있는 새로운 60 밀리미터 접시로 옮깁니다.그런 다음, 세 개에서 다섯 개의 슬라이스를 여섯 웰 플레이트의 각 웰에 있는 각 조직 배양 삽입물 상으로 안전한 거리로 옮긴다. 인서트의 표면으로부터 과량의 배지를 제거한 후, 각 인서트 아래에 평형화된 성인 마우스 슬라이스 배지 한 밀리리터를 첨가한다. 이미징 전에 조직을 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 및 습도 95%에서 24시간 동안 배양합니다.밀리리터 루시페린 용액 당 30 밀리그램의 다섯 마이크로 리터를 멸균 후드 내부의 삽입물 아래의 매체에 피펫합니다. 뚜껑이 있는 여섯 웰 플레이트를 고정식 카메라 아래의 기기의 이미징 챔버 안에 놓고 챔버 도어를 잠급니다. 소프트웨어를 열고 계측기를 초기화합니다.시각화가 가능한 카메라 설정을 선택하고 이미지당 하나의 웰만 캡처한 후 이미징할 웰을 카메라 바로 아래에 놓습니다. ROI 도구를 사용하여 종양 모양과 크기 주위에 맞추고, ROI를 측정하고, 슬라이스에서 각 종양의 생체 발광 신호를 정량화하기 위해 총 판독값을보고하십시오. 플레이트를 멸균 층류 후드로 다시 가져온 후 포셉을 사용하여 인서트를 웰에서 약간 들어 올립니다.배지를 흡인 후 배지를 한 밀리리터의 신선한 배지로 교체하고 인셋을 다시 우물에 넣으십시오. 슬라이스가 억제제 및 대사 산물과 같은 다양한 화합물로 처리되는 실험의 경우, 1.5 밀리리터 튜브에서 1.2 밀리리터의 뇌 슬라이스 매체에 적절한 시약 농도를 준비한 다음 1 밀리리터의 시약을 슬라이스가 들어있는 웰로 옮깁니다. MDA-MB-231 BR-GFP 루시퍼라제 세포를 누드 마우스에 주사하고, 종양이 성장하도록 허용하고, 종양이 있는 뇌를 해부하고, 슬라이스하고, 생체외 성장시키고, 종양 성장을 생체발광 영상화에 의해 모니터링하였다.H&E 염색과 GFP 양성 형광은 뇌 절편에 종양이 존재함을 확인하였다. 증가된 Ki-67 염색은 고도로 증식성 암세포의 존재를 확인하였다. 조사에 노출되지 않은 뇌 조각의 종양은 생체 외 성장이 계속되었고, 방사선 조사에 노출 된 종양은 지속적인 성장을 보였다.종양을 함유하는 뇌 절편은 또한 조사 처리 후 종양 성장을 가시화하기 위해 라이브 이미징을 통해 모니터링되었다. 생체 발광 영상화와 일관되게 GFP 강도가 증가하고 세포가 뇌 실질에 침입하기 시작하면서 대조군 암세포가 빠르게 성장했습니다. 대조적으로, 방사선 조사로 처리된 뇌 절편에서 암세포는 세포증식 억제되었고 GFP 강도는 유지되었다.큰 다핵화된 암세포 및 IR-처리된 암 세포에서 DNA 손상 마커의 염색의 증가가 검출되었다. 또한, 반응성 성상세포의 증가가 검출되었다. IR 처리-유도된 아폽토시스는 종양이 없는 마우스 뇌 절편에서 검출되지 않았다.종양을 함유하는 뇌 절편을 화학요법 약물인 파클리탁셀의 상이한 농도로 처리하였다. 치료는 치료 10 일 이후에 종양의 크기를 크게 줄였습니다. 아폽토시스의 증가는 파클리탁셀-처리된 종양 세포에서 검출되었다.억제제 처리는 뇌 조직 생존력을 변화시키지 않았다. 아폽토시스의 증가는 파클리탁셀 처리된 종양이 없는 마우스 뇌 절편에서 절단된 카스파제-3 염색에 의해 측정되었다. 관심있는 약물에 의한 치료가 종료되면, 슬라이스는 면역세포화학, 오믹 연구를 통해 단백질 발현에 대해 분석되거나 유세포 측정에 적합한 단일 세포 현탁액을 달성할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

연구

암 연구학

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellular과 세포 폐 종양 전이 연구 모델

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

종양 대상 Immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

종양 세포종 필드 치료 치료의 임상 적용

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

침략적인 외과 생검에 응하여 뇌종양 세포 행동의 경도 내 활력 화상 진찰

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

쥐에서 종양 성장을 감소 하는 MicroRNA의 생체 내 억제

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...