Name: an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth at JoVE.com

Vi vil takke Julia Farnan, Kayla Green og Tiziana DeAngelis for deres tekniske assistanse. Dette arbeidet ble delvis støttet av Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) og W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).

Denne protokollen ble godkjent og følger retningslinjene for dyrepleie av Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Nu/Nu athymic kvinnelige mus (6-8 uker gamle) ble brukt i denne studien.
1. Intrakraniell injeksjon av tumorceller
<ol><li>Steriliser alt utstyr (pinsett, saks, suturering saks, håndbor) under en tørr syklus av en autoklav i opptil 45 minutter i steriliseringsposer, inkludert en steriliseringsindikator. Hvis du utfører operas...

<ol>
	<li>Watase, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+brain+metastasis-overview+of+disease+state,+treatment+options+and+future+perspectives.">Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives.</a> Cancers. 13 (5), (2021).</li><li>Niikura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+outcomes+and+prognostic+factors+for+patients+with+brain+metastases+from+breast+cancer+of+each+subtype:+a+multicenter+retrospective+analysis.">Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).</li><li>Fong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Parker, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+glioblastoma+organotypic+slice+culture+model+for+study+of+tumor+cell+migration+and+patient-specific+effects+of+anti-invasive+drugs.">A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).</li><li>Chuang, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculture+system+with+an+organotypic+brain+slice+and+3D+spheroid+of+carcinoma+cells.">Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).</li><li>Hohensee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+mediates+the+cross+talk+between+breast+and+glial+cells+in+brain+metastases+leading+to+rapid+disease+progression.">PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression.</a> Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).</li><li>van de Merbel, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+Tissue+culture+model+for+the+assessment+of+individualized+drug+responses+in+prostate+and+bladder+cancer.">An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer.</a> Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).</li><li>Martin, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tissue+slice+culture+system+to+measure+drug-response+rates+of+hepatic+metastatic+colorectal+cancer.">Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer:+a+novel+tumor-promoting+cell+type.">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).</li><li>Lim, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+preserve+the+tumor+microenvironment+and+provide+a+platform+for+drug+response.">Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response.</a> Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain.">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).</li><li>Kyeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+breast+cancer+show+different+spatial+distributions+of+brain+metastases.">Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases.</a> PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).</li><li>Hengel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attributes+of+brain+metastases+from+breast+and+lung+cancer.">Attributes of brain metastases from breast and lung cancer.</a> International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).</li><li>Jackson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters.">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).</li><li>Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+mitochondrial+dynamics+and+trafficking+in+astrocytes.">Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).</li><li>Simone, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+oxidative+stress+alters+miRNA+expression.">Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression.</a> PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).</li><li>Couturier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+that+glioblastoma+recapitulates+a+normal+neurodevelopmental+hierarchy.">Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy.</a> Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).</li><li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).</li><li>Fitzgerald, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+glia+are+recruited+by+highly+proliferative+brain+metastases+of+breast+cancer+and+promote+tumor+cell+colonization.">Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).</li><li>Kondru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ex+Vivo+Brain+Slice+Culture+Model+of+Chronic+Wasting+Disease:+Implications+for+Disease+Pathogenesis+and+Therapeutic+Development.">An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development.</a> Scientific Reports. 10 (1), (2020).</li><li>Abu Samaan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel's+mechanistic+and+clinical+effects+on+breast+cancer.">Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer.</a> Biomolecules. 9 (12), (2019).</li><li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies.">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).</li><li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metastasis+cell+lines+panel:+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines.">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li></ol>

Denne studien etablerer en ny ex vivo hjernekulturmetode for utplantede xenograft hjernesvulster. Vi viser at BCBM celler MDA-MB-231BR celler intracranially injisert i hjernen til mus kan overleve og vokse i ex vivo hjerne skiver. Studien testet også intracranially injiserte U87MG glioblastom (GBM) celler og fant også at disse kreftcellene overlever og vokser i hjerneskiver (data ikke vist). Vi tror denne modellen kan utvides utover BCBM og GBM til andre kreftformer som lett metastaser til hjernen, in...

Brystkreft hjernemetastaser (BCBM) utvikler seg når celler sprer seg fra den primære brystsvulsten til hjernen. Brystkreft er den nest hyppigste årsaken til hjernemetastase etter lungekreft, med metastaser som forekommer hos 10-16% av pasientene1. Dessverre forblir hjernemetastaser uhelbredelige ettersom >80% av pasientene dør innen et år etter hjernemetastasediagnosen, og deres livskvalitet er svekket på grunn av nevrologiske dysfunksjoner2. Det er et presserende behov for å identifisere mer effektive behandlingsalternativer. Monolayer todimensjonale eller tredimensjonale kulturmodeller er de mest brukte metodene for å teste terapeutiske midler i laboratoriet. Imidlertid etterligner de ikke det komplekse BCBM mikromiljøet, en stor driver for tumorfenotype og vekst. Selv om disse modellene er nyttige, fanger de ikke de komplekse tumor-stromale interaksjonene, de unike metabolske kravene og heterogeniteten til svulstene3. For mer trofast å rekapitulere tumor-stromale interaksjoner og mikromiljø heterogenitet, har vår gruppe og andre begynt å generere organotypiske hjernemetastasekulturer med pasientavledede tumorceller (primære eller metastatiske) eller kreftcellelinjer 4,5,6. Sammenlignet med klassiske in vitro-systemer, kan denne kortsiktige ex vivo-modellen gi mer relevante forhold for screening av nye terapeutiske behandlinger før preklinisk vurdering i store dyrekohorter.
Ex vivo modeller har blitt konstruert og vellykket brukt primært for identifisering av vellykkede behandlinger av ulike kreftformer. De krever få dagers vurdering og kan i tillegg skreddersys til pasientspesifikk legemiddelscreening. For eksempel har human blære og prostatakreft ex vivo vev vist en doseavhengig anti-tumor respons av docetaksel og gemcitabine7. Lignende kolorektal karsinom ex vivo vev ble utviklet for å screene kjemoterapeutiske legemidler Oxaliplatin, Cetuximab og Pembrolizumab8. Denne applikasjonen har blitt mye brukt i bukspyttkjertelkreft, med tanke på det essensielle samspillet mellom det stromale miljøet og de genotypiske og fenotypiske egenskapene til bukspyttkjertelkanal adenokarsinom 9,10. Videre er slike organotypiske modeller utviklet for lignende screeninger i hode-, nakke-, mage- og brystsvulster 11,12.
Her genereres en ex vivo hjerneskivemodell av xenografted brystkreft hjerne metastatiske tumorceller i mikromiljøet. Mus ble intracranially injisert med brystkreft hjerne metastatisk hjerne trofisk MDA-MB-231BR celler13 i cerebral cortex parietal lobe- et vanlig sted for TNBC metastasering14,15 og fikk lov til å utvikle svulster. Hjerneskiver ble generert fra disse xenografterte dyrene og opprettholdt ex vivo som organotypiske kulturer som beskrevet16,17. Denne nye ex vivo-modellen tillater analyse av BCBM-cellens vekst i hjerneparenchyma og kan brukes til å teste terapeutiske midler og strålingseffekter på tumorceller i hjernemikromiljøet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, slip tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G1/2 Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microscope and LUMAVIEW software</td>
			<td>Etaluma</td>
			<td>LS720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (GEM21)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-210-685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt sable paintbrush, Size #5/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Wax</td>
			<td>ModoMed</td>
			<td>DYNJBW25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain injection Syringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP510-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase 3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14220S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060(95-0043)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-805a (1001-042)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sable paintbrush #2/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-H2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Corning cellgrow</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E and KI-67</td>
			<td>Jefferson Core Facility Pathology staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>YCQ2851920086082DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Just for mice Stereotaxic Frame</td>
			<td>Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).</td>
			<td>72-6049, 72-6044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231BR cells</td>
			<td>Kindly provided by Dr. Patricia Steeg</td>
			<td>Ref 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging device</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>IVIS 200 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging software</td>
			<td>Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).</td>
			<td>Living Image Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Tecan Spark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS reagent</td>
			<td>Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution</td>
			<td>(Cat:G3582)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu/Nu athymic mice</td>
			<td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>145140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Suture</td>
			<td>Medex supply</td>
			<td>ETH-8556H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Swab sticks</td>
			<td>DME Supply USA</td>
			<td>Cat: 689286X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade #11 (pk of 100)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula/probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel</td>
			<td>Exelint International</td>
			<td>D29702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Brinkman</td>
			<td>(McIlwain type)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICMORG50 or PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray machine</td>
			<td>Precision 250 kVp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth

Hjernemetastase er en alvorlig konsekvens av brystkreft for kvinner, da disse svulstene er vanskelige å behandle og er forbundet med dårlige kliniske utfall. Prekliniske musemodeller av brystkreft hjernemetastatisk (BCBM) vekst er nyttige, men er dyre, og det er vanskelig å spore levende celler og tumorcelleinvasjon i hjernen parenchyma. Presentert her er en protokoll for ex vivo hjerneskive kulturer fra xenografted mus som inneholder intracranially injisert brystkreft hjernesøkende klonale underlinjer. MDA-MB-231BR luciferase taggede celler ble injisert intracranially i hjernen til Nu / Nu kvinnelige mus, og etter tumordannelse ble hjernene isolert, skiver og dyrket ex vivo. Tumorskivene ble avbildet for å identifisere tumorceller som uttrykker luciferase og overvåke spredning og invasjon i hjernen parenchyma i opptil 10 dager. Videre beskriver protokollen bruken av tidsforløpmikroskopi for å avbilde veksten og den invasive oppførselen til tumorcellene etter behandling med ioniserende stråling eller kjemoterapi. Responsen fra tumorceller til behandlinger kan visualiseres ved levende avbildningsmikroskopi, måling av bioluminescensintensitet og utføre histologi på hjernestykket som inneholder BCBM-celler. Dermed kan denne ex vivo-skivemodellen være en nyttig plattform for rask testing av nye terapeutiske midler alene eller i kombinasjon med stråling for å identifisere legemidler som er personlig tilpasset for å målrette en individuell pasients brystkrefthjerne metastatisk vekst i hjernemikromiljøet.

MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase-celler ble intracranially injisert i høyre halvkule av 4-6 uker gamle Nu / Nu-mus som forklart ovenfor (figur 1A) og fikk lov til å vokse i 12-14 dager, i løpet av hvilken tid tumorvekst ble overvåket av bioluminescensavbildning (figur 1B). Vi injiserte 100.000 kreftceller intracranially som rapportert av andre grupper19, men det er mulig å injisere så lavt som 20.000 celle20. Ette...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth at JoVE.com

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Vi introduserer en protokoll for måling av sanntids legemiddel- og strålingsrespons av brystkreft hjernemetastatiske celler i en organotypisk hjerneskivemodell. Metodene gir en kvantitativ analyse for å undersøke de terapeutiske effektene av ulike behandlinger på hjernemetastaser fra brystkreft på en ex vivo-måte i hjernemikromiljøet.

En Ex Vivo Brain Slice-modell for å studere og målrette brystkreft hjerne metastatisk tumorvekst

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Denne protokollen tillater dannelse av hjernemetastatiske tumorceller og generering av ex vivo hjerneskiver som muliggjør rask testing av legemiddeleffekt og stråling på en forhåndsformet svulst. Den største fordelen med denne teknikken er evnen til raskt å teste flere stoffer eller behandlinger i en fysiologisk relevant setting som opprettholder hjernesvulst-vert interaksjoner. Denne metoden kan bidra til å forstå hvordan hjernemetastatiske celler vokser, overlever og invaderer hjernens parenchyma og forstår rollen til hjernesvulstmikromiljøet i kreftvekst og spredning.Å demonstrere prosedyren vil være Lorela Ciraku og Emily Esquea, begge ph.d.-kandidater fra laboratoriet mitt. Til å begynne med, med plasser de bedøvede musene i en stereotaxisk ramme og immobiliser hodet ved hjelp av standard ørestenger. Steriliser overflaten av hodet tre ganger ved gjentatt vekslende påføring av jodpinner og 70% etanol før snitt.Bruk en kirurgisk skalpell, lag et en centimeter midtlinje snitt i en diagonal vinkel til den imaginære aksen som deler musenes hjerne i to symmetriske halvdeler for å eksponere skallen. Etter å ha tørket blod med en bomullspinne, avbøy huden sidelengs for å eksponere injeksjonsstedet. Bruk en 0,73 millimeter burr bit for å trenge inn i skallen og bore et hull ved hjelp av lett trykk og vridningsbevegelse.For å injisere fem mikroliter celler som stabilt uttrykker GFP luciferase, sett inn en sprøyte med høy presisjon til 3,5 millimeter dybde i hjernen. La den slå seg ned i to minutter og trekk deretter sprøyten opp omtrent en millimeter. Etter to minutter injiserer du sakte det første halve volumet og venter i ytterligere to minutter før du injiserer resten av volumet.Etter tre minutter trekker du sprøyten langsomt. Påfør benvoks på injeksjonsstedet på skallen og suturer vevet med polypropylen suturer. Overvåk musens oppførsel rett etter operasjonen med jevne mellomrom for å avgjøre om spesiell behandling, inkludert saltvannsinjeksjon og myk mat, er nødvendig for å bidra til rask gjenoppretting.For å overvåke tumorveksten via bioluminescensavbildning, må du først slå på oksygen og isofluran på bildesystemet og la begge distribueres til det separate kammeret utenfor bildeboksen. Deretter, etter å ha slått på programvaren og initialisert instrumentet, velger du riktig alternativ for å visualisere og fange hele musekroppen. Deretter overfører musene til kammeret utenfor bildeboksen som følger med oksygen og isofluran.Når musene er under bedøvelseseffekten, injiser musene intraperitonealt med 200 mikroliter på 30 milligram per milliliter luciferin. Plasser musene i bildekammeret med magen vendt ned til bildekamrenes neseleppe. Lås kammeret, velg to minutters tidseksponering for å starte bildet, og fullfør deretter bildet.Etter å ha plassert vevsskiven i en steril laminær strømningshette, rengjør alle verktøyene og instrumentene med 70% etanol. Etter å ha euthanizing musen, fjern og plasser hjernen raskt i iskald sukrose-ACSF løsning. Bruk en slikkepott til å overføre hjernen på et ACSF-fuktet filterpapir på et 60 millimeters parabollokk.Bruk et skarpt, sterilt barberblad, kutt de overskytende delene av hjernen som ikke inneholder noen svulst, inkludert den nederste delen av hjernen, for å bringe hjernens form til en ikke-perfekt kube. Når du har plassert flere ark med ACSF-fuktet filterpapir på skjæreplattformen, plasserer du det blokkerte vevet på filterpapiret. For å skjære vevet i 200-til-250-mikrometer tykke seksjoner, sett kuttstørrelsen til 2 eller 2,5 enheter på leverandørlinjalen og begynn å kutte.Bruk en pensel til å overføre hjerneskiver til en tallerken som inneholder sukrose-ACSF og skille skivene under et lett mikroskop ved hjelp av 27-gauge nåler. Identifiser GFP-positive skiver under det fluorescerende mikroskopet. Deretter, ved hjelp av en steril en milliliter ødelagt pipette med en bred åpning, overfør identifiserte skiver til en ny 60 millimeter tallerken som inneholder to til tre milliliter voksne skiver.Deretter overfører du tre til fem skiver til hver vevskulturinnsats i hver brønn på en seksbrønnsplate på trygg avstand. Etter å ha fjernet overflødig medium fra overflaten av innsatsen, legg til en milliliter likevektet voksen musskive medium under hver innsats. Inkuber vevet ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid og 95% fuktighet i 24 timer før avbildning.Pipette fem mikroliter på 30 milligram per milliliter luciferinoppløsning i mediet under innsatsene inne i en steril hette. Plasser seksbrønnsplaten med lokket inne i instrumentets bildekammer under det stasjonære kameraet og lås kammerdøren. Åpne programvaren og initialiser instrumentet.Etter å ha valgt kamerainnstillinger som tillater visualisering og opptak av bare en brønn per bilde, plasserer du brønnen som skal avbildes direkte under kameraet. Bruk roi-verktøyet, monter det rundt tumorformen og størrelsen, mål avkastningen og rapporter de totale avlesningene for å kvantifisere det bioluminescerende signalet til hver svulst på stykket. Etter å ha brakt platen tilbake til den sterile laminære strømningshetten, bruk tang for å løfte innsatsen litt fra brønnen.Etter å ha aspirert mediet, erstatt mediet med en milliliter friskt medium og legg innsettet tilbake i brønnen. For forsøkene der skivene behandles med ulike forbindelser, for eksempel inhibitorer og metabolitter, lag riktig reagenskonsentrasjon i 1,2 milliliter hjerneskivemedier i et 1,5 milliliter rør, og overfør deretter en milliliter reagens til brønnen som inneholder skiven. MDA-MB-231 BR-GFP luciferasecellene ble injisert i nakne mus, svulster fikk lov til å vokse, hjerner med svulster ble dissekert ut, skiver, vokst ex vivo, og tumorvekst ble overvåket av bioluminescensavbildning.H&E-fargingen og GFP-positiv fluorescens bekreftet tilstedeværelsen av en svulst i hjernestykket. Den økte Ki-67-fargingen bekreftet tilstedeværelsen av svært proliferative kreftceller. Svulstene i hjerneskiver som ikke ble utsatt for bestråling fortsatte å vokse ex vivo, mens svulster utsatt for bestråling viste en forsinket vekst.Hjerneskiver som inneholder svulster ble også overvåket via levende avbildning for å visualisere tumorveksten etter bestrålingsbehandlingen. I samsvar med bioluminescent avbildning, kontroll kreftceller raskt vokste som GFP intensitet økte og cellene begynte å invadere hjernen parenchyma. Kreftcellene i hjerneskiver behandlet med bestråling var derimot cytostatiske og GFP-intensiteten ble opprettholdt.Store flerkjernede kreftceller og en økning i farging av DNA-skademarkør i IR-behandlede kreftceller ble påvist. Det ble også oppdaget en økning i reaktive astrocytter. Den IR-behandlingsinduserte apoptose ble ikke oppdaget i tumorfrie musehjerneskiver.Hjerneskivene som inneholder svulster ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av paclitaksel, et kjemoterapeutisk stoff. Behandlingen reduserte svulstens størrelse betydelig etter dag 10 av behandlingen. En økning i apoptose ble påvist i paclitaxelbehandlede tumorceller.Inhibitorbehandlingen endret ikke levedyktigheten i hjernevevet. Ingen økning i apoptose ble målt ved spalte caspase-3 farging i paclitaxel-behandlet tumorfri musehjerneskive. Når behandlingen med medikamentene av interesse er avsluttet, kan skiver analyseres for proteinuttrykk gjennom immunocytokjemi, omic studier eller oppnå encellet suspensjon egnet for strømningscytometri.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

En Portal Vein Injection modell for å studere levermetastaser fra brystkreft

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellular og cellulær lunge modell å studere svulst metastasering

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging analyser studie Glioblastoma hjerne svulst stamcelleforskningen migrasjon og invasjon

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses for svulst målrettede Immunomodulation: Design og evaluering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Klinisk anvendelse av svulst behandling av feltene terapi i glioblastom

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Langsgående Intravital Imaging av Brain tumor Cell atferd som svar på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo hemming av MicroRNA å redusere tumor vekst i mus

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analysen for å studere tumor-macrophage interaksjon

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av Orthotopic bukspyttkjertel svulster og ex vivo karakterisering av tumor-infiltrere T Cell cytotoksisitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...