Name: an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth at JoVE.com

Queremos agradecer julia Farnan, Kayla Green e Tiziana DeAngelis por sua assistência técnica. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Programa de Subvenção universal de pesquisa da Pensilvânia (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA2227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) e W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).

Este protocolo foi aprovado e segue as diretrizes de cuidados com animais pelo Comitê de Uso e Uso Institucional de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade Drexel (IACUC). Camundongos fêmeas atímicas nu/nu (6-8 semanas de idade) foram utilizados neste estudo.
1. Injeção intracraniana de células tumorais
<ol><li>Esterilizar todos os equipamentos (pinças, tesouras, tesoura suturando, broca de mão) sob um ciclo seco de uma autoclave por até 45 minutos em bolsas de esterilizaç...

<ol>
	<li>Watase, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+brain+metastasis-overview+of+disease+state,+treatment+options+and+future+perspectives.">Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives.</a> Cancers. 13 (5), (2021).</li><li>Niikura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+outcomes+and+prognostic+factors+for+patients+with+brain+metastases+from+breast+cancer+of+each+subtype:+a+multicenter+retrospective+analysis.">Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).</li><li>Fong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Parker, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+glioblastoma+organotypic+slice+culture+model+for+study+of+tumor+cell+migration+and+patient-specific+effects+of+anti-invasive+drugs.">A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).</li><li>Chuang, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculture+system+with+an+organotypic+brain+slice+and+3D+spheroid+of+carcinoma+cells.">Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).</li><li>Hohensee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+mediates+the+cross+talk+between+breast+and+glial+cells+in+brain+metastases+leading+to+rapid+disease+progression.">PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression.</a> Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).</li><li>van de Merbel, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+Tissue+culture+model+for+the+assessment+of+individualized+drug+responses+in+prostate+and+bladder+cancer.">An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer.</a> Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).</li><li>Martin, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tissue+slice+culture+system+to+measure+drug-response+rates+of+hepatic+metastatic+colorectal+cancer.">Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer:+a+novel+tumor-promoting+cell+type.">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).</li><li>Lim, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+preserve+the+tumor+microenvironment+and+provide+a+platform+for+drug+response.">Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response.</a> Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain.">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).</li><li>Kyeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+breast+cancer+show+different+spatial+distributions+of+brain+metastases.">Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases.</a> PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).</li><li>Hengel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attributes+of+brain+metastases+from+breast+and+lung+cancer.">Attributes of brain metastases from breast and lung cancer.</a> International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).</li><li>Jackson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters.">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).</li><li>Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+mitochondrial+dynamics+and+trafficking+in+astrocytes.">Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).</li><li>Simone, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+oxidative+stress+alters+miRNA+expression.">Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression.</a> PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).</li><li>Couturier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+that+glioblastoma+recapitulates+a+normal+neurodevelopmental+hierarchy.">Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy.</a> Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).</li><li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).</li><li>Fitzgerald, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+glia+are+recruited+by+highly+proliferative+brain+metastases+of+breast+cancer+and+promote+tumor+cell+colonization.">Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).</li><li>Kondru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ex+Vivo+Brain+Slice+Culture+Model+of+Chronic+Wasting+Disease:+Implications+for+Disease+Pathogenesis+and+Therapeutic+Development.">An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development.</a> Scientific Reports. 10 (1), (2020).</li><li>Abu Samaan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel's+mechanistic+and+clinical+effects+on+breast+cancer.">Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer.</a> Biomolecules. 9 (12), (2019).</li><li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies.">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).</li><li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metastasis+cell+lines+panel:+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines.">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li></ol>

Este estudo estabelece um novo método de cultura cerebral ex vivo para tumores cerebrais de xenoenxerto explantado. Mostramos que as células BCBM MDA-MB-231BR intracranianamente injetadas no cérebro de camundongos podem sobreviver e crescer em fatias cerebrais ex vivo . O estudo também testou células intracranianamente injetadas de glioblastoma U87MG (GBM) e também descobriu que essas células cancerígenas sobrevivem e crescem em fatias cerebrais (dados não mostrados). Acreditamos que esse model...

As metástases cerebrais do câncer de mama (BCBM) se desenvolvem quando as células se espalham do tumor primário de mama para o cérebro. O câncer de mama é a segunda causa mais frequente de metástase cerebral após o câncer de pulmão, com metástases ocorrendo em 10-16% das pacientes1. Infelizmente, as metástases cerebrais permanecem incuráveis, pois >80% dos pacientes morrem dentro de um ano após o diagnóstico de metástase cerebral, e sua qualidade de vida é prejudicada devido a disfunções neurológicas2. É urgente identificar opções de tratamento mais eficazes. Modelos de cultura bidimensional ou tridimensional são os métodos mais utilizados para testar agentes terapêuticos em laboratório. No entanto, eles não imitam o complexo microambiente BCBM, um dos principais impulsionadores do fenótipo e crescimento tumoral. Embora esses modelos sejam úteis, eles não capturam as complexas interações tumorais-estromais, os requisitos metabólicos únicos e a heterogeneidade dos tumores3. Para recapitular mais fielmente as interações tumorais e a heterogeneidade do microambiente, nosso grupo e outros começaram a gerar culturas organotípicas de metástase cerebral "fatia" com células tumorais derivadas do paciente (primárias ou metastáticas) ou linhasde células cancerígenas 4,5,6. Comparado aos sistemas in vitro clássicos, este modelo ex vivo de curto prazo pode fornecer condições mais relevantes para a triagem de novas terapêuticas antes da avaliação pré-clínica em grandes coortes animais.
Modelos ex vivo foram construídos e utilizados com sucesso principalmente para a identificação de tratamentos bem-sucedidos de vários cânceres. Eles requerem poucos dias de avaliação e, além disso, podem ser adaptados para a triagem de medicamentos específico do paciente. Por exemplo, os tecidos ex vivo do câncer de bexiga e próstata têm mostrado uma resposta anti-tumor dependente de dose de docetaxel e gemcitabina7. Carcinoma colorretal ex vivo semelhantes foram desenvolvidos para tela quimioterapia oxaliplatina, Cetuximab e Pembrolizumab8. Esta aplicação tem sido amplamente utilizada no câncer de pâncreas, considerando a interação essencial entre o ambiente estromal e as características genotípicas e fenotípicas do adenocarcinoma ductal 9,10. Além disso, tais modelos organotípicos foram desenvolvidos para exames semelhantes em tumores de cabeça, pescoço, gástrico e mama11,12.
Aqui, um modelo de fatia cerebral ex vivo de células tumorais metastáticas do câncer de mama xenoenxerados em seu microambiente está sendo gerado. Camundongos foram intracranianamente injetados com câncer de mama cérebro tátático cérebro trófico células MDA-MB-231BR13 no lobo parietal córtex cerebral- um local comum de metástase TNBC 14,15 e permitido desenvolver tumores. Fatias cerebrais foram geradas a partir desses animais xenoengrafados e mantidas ex vivo como culturas organotípicas como descrito16,17. Este novo modelo ex vivo permite a análise do crescimento da célula BCBM dentro do parenchyma cerebral e pode ser usado para testar agentes terapêuticos e efeitos de radiação em células tumorais dentro do microambiente cerebral.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, slip tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G1/2 Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microscope and LUMAVIEW software</td>
			<td>Etaluma</td>
			<td>LS720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (GEM21)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-210-685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt sable paintbrush, Size #5/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Wax</td>
			<td>ModoMed</td>
			<td>DYNJBW25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain injection Syringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP510-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase 3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14220S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060(95-0043)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-805a (1001-042)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sable paintbrush #2/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-H2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Corning cellgrow</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E and KI-67</td>
			<td>Jefferson Core Facility Pathology staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>YCQ2851920086082DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Just for mice Stereotaxic Frame</td>
			<td>Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).</td>
			<td>72-6049, 72-6044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231BR cells</td>
			<td>Kindly provided by Dr. Patricia Steeg</td>
			<td>Ref 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging device</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>IVIS 200 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging software</td>
			<td>Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).</td>
			<td>Living Image Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Tecan Spark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS reagent</td>
			<td>Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution</td>
			<td>(Cat:G3582)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu/Nu athymic mice</td>
			<td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>145140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Suture</td>
			<td>Medex supply</td>
			<td>ETH-8556H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Swab sticks</td>
			<td>DME Supply USA</td>
			<td>Cat: 689286X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade #11 (pk of 100)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula/probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel</td>
			<td>Exelint International</td>
			<td>D29702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Brinkman</td>
			<td>(McIlwain type)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICMORG50 or PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray machine</td>
			<td>Precision 250 kVp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth

A metástase cerebral é uma consequência séria do câncer de mama para as mulheres, pois esses tumores são difíceis de tratar e estão associados a desfechos clínicos ruins. Modelos pré-clínicos de camundongos do câncer de mama câncer de mama o crescimento metastático cerebral (BCBM) são úteis, mas são caros, e é difícil rastrear células vivas e invasão de células tumorais dentro do parnchyma cerebral. Apresentado aqui é um protocolo para culturas de fatias cerebrais ex vivo de camundongos xenoenxerados contendo sublines clonais intracranianas injetadas no cérebro do câncer de mama. Células etiquetadas de luciferase MDA-MB-231BR foram injetadas intracranianamente no cérebro de camundongos fêmeas Nu/Nu, e após a formação de tumores, os cérebros foram isolados, fatiados e cultivados ex vivo. As fatias tumorais foram imagens para identificar células tumorais expressando luciferase e monitorar sua proliferação e invasão no parênquim cerebral por até 10 dias. Além disso, o protocolo descreve o uso de microscopia de lapso de tempo para visualizar o crescimento e o comportamento invasivo das células tumorais após o tratamento com radiação ionizante ou quimioterapia. A resposta das células tumorais aos tratamentos pode ser visualizada por microscopia de imagem viva, medindo a intensidade da bioluminescência e realizando histologia na fatia cerebral contendo células BCBM. Assim, este modelo de fatia ex vivo pode ser uma plataforma útil para testes rápidos de novos agentes terapêuticos sozinhos ou em combinação com radiação para identificar drogas personalizadas para direcionar o crescimento metastático do cérebro do câncer de mama de uma paciente individual dentro do microambiente cerebral.

As células MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase foram intracranianamente injetadas no hemisfério direito de camundongos Nu/Nu de 4-6 semanas de idade, conforme explicado acima (Figura 1A) e foram autorizadas a crescer por 12-14 dias, período durante o qual o crescimento do tumor foi monitorado por imagens de bioluminescência (Figura 1B). Injetamos 100.000 células cancerígenas intracranianamente como relatado por outros grupos19, mas é poss?...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth at JoVE.com

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Introduzimos um protocolo para medir a resposta de drogas e radiação em tempo real de células metastáticas cerebrais do câncer de mama em um modelo organotípico de fatia cerebral. Os métodos fornecem um ensaio quantitativo para investigar os efeitos terapêuticos de vários tratamentos em metástases cerebrais do câncer de mama de forma ex vivo dentro da interface de microambiente cerebral.

Um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar e direcionar o crescimento do tumor metastático do câncer de mama

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Este protocolo permite a formação de células tumorais metastáticas cerebrais e a geração de fatias cerebrais ex vivo que permitem testes rápidos de eficácia e radiação de drogas em um tumor pré-formado. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de testar rapidamente vários medicamentos ou tratamentos em um ambiente fisiologicamente relevante que mantém interações cérebro-tumor-hospedeiro. Este método pode ajudar a entender como as células metastáticas cerebrais crescem, sobrevivem e invadem o parênquim cerebral e entendem o papel do microambiente tumoral cerebral no crescimento e disseminação do câncer.Demonstrando o procedimento estarão Lorela Ciraku e Emily Esquea, ambas candidatas ao doutorado do meu laboratório. Para começar, coloque os ratos anestesiados em uma estrutura estereotaxica e imobilize a cabeça usando barras de ouvido padrão. Esterilize a superfície da cabeça três vezes por repetida aplicação alternada de cotonetes de iodo e 70% de etanol antes da incisão.Usando um bisturi cirúrgico, faça uma incisão de uma centimétrica de linha média em um ângulo diagonal para o eixo imaginário dividindo o cérebro do camundongo em duas metades simétricas para expor o crânio. Depois de limpar qualquer sangue com um cotonete, desvie a pele lateralmente para expor o local da injeção. Use uma broca de 0,73 milímetros para penetrar no crânio e fazer um furo usando leve pressão e movimento de torção.Para injetar cinco microliters de células expressando a luciferase GFP, insira uma seringa de alta precisão a 3,5 milímetros de profundidade no cérebro. Deixe-o se acomodar por dois minutos e, em seguida, puxe a seringa para cima cerca de um milímetro. Após dois minutos, injete lentamente o primeiro volume e espere por mais dois minutos antes de injetar o resto do volume.Depois de três minutos, puxe lentamente a seringa. Aplique cera óssea no local da injeção no crânio e sutura o tecido com suturas de polipropileno. Monitore o comportamento do camundongo logo após a cirurgia periodicamente para determinar se o tratamento especial, incluindo injeção salina e alimentos macios, são necessários para ajudar na recuperação rápida.Para monitorar o crescimento do tumor através de imagens de bioluminescência, primeiro ligue o oxigênio e o isoflurane no sistema de imagem e permita que ambos sejam distribuídos para a câmara separada fora da caixa de imagem. Em seguida, depois de ligar o software e inicializar o instrumento, escolha a opção apropriada para visualizar e capturar todo o corpo do mouse. Em seguida, transfira os ratos para a câmara fora da caixa de imagens fornecida com oxigênio e isoflurano.Uma vez que os camundongos estejam sob o efeito anestésico, injete os ratos intraperitonealmente com 200 microlitros de 30 miligramas por mililitro de luciferina. Coloque os ratos na câmara de imagem com o estômago voltado para o lábio do nariz das câmaras de imagem. Bloqueie a câmara, escolha dois minutos de exposição para iniciar a imagem e, em seguida, complete a imagem.Depois de colocar o cortador de tecido em uma capa de fluxo laminar estéril, limpe todas as ferramentas e instrumentos com 70% de etanol. Depois de eutanásia do camundongo, remova e coloque o cérebro rapidamente na solução de sacarose-ACSF gelada. Usando uma espátula, transfira o cérebro em um papel filtro molhado pela ACSF em uma tampa de prato de 60 milímetros.Usando uma lâmina afiada e estéril, corte o excesso de partes do cérebro que não contenham nenhum tumor, incluindo a parte inferior do cérebro, para trazer a forma do cérebro para um cubo não perfeito. Depois de colocar várias folhas de papel filtro molhado pela ACSF na plataforma de corte, coloque o tecido bloqueado sobre o papel do filtro. Para cortar o tecido em seções de 200 a 250 micrômetros de espessura, ajuste o tamanho do corte para 2 ou 2,5 unidades na régua do provedor e comece a cortar.Use um pincel para transferir fatias cerebrais em um prato contendo sacarose-ACSF e separe as fatias sob um microscópio leve usando agulhas de calibre 27. Identifique as fatias positivas do GFP sob o microscópio fluorescente. Em seguida, usando uma pipeta quebrada de um mililitro estéril com uma abertura ampla, transfira fatias identificadas para um novo prato de 60 milímetros contendo dois a três mililitros de mídia de fatia adulta.Em seguida, transfira de três a cinco fatias para cada inserção de cultura de tecido em cada poço de uma placa de seis poços a uma distância segura. Depois de remover o meio de excesso da superfície da pastilha, adicione um mililitro de meio de fatia de rato adulto equilibrado por baixo de cada inserção. Incubar os tecidos a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade por 24 horas antes da imagem.Pipeta cinco microlitres de 30 miligramas por solução de luciferina mililitro no meio sob as pastilhas dentro de um capô estéril. Coloque a placa de seis poços com a tampa dentro da câmara de imagem do instrumento abaixo da câmera estacionária e tranque a porta da câmara. Abra o software e inicialize o instrumento.Depois de escolher as configurações da câmera permitindo visualização e captura de apenas um poço por imagem, coloque o poço para ser filmado diretamente sob a câmera. Use a ferramenta ROI, encaixe-a em torno da forma e tamanho do tumor, meça o ROI e informe as leituras totais para quantificar o sinal bioluminescente de cada tumor na fatia. Depois de trazer a placa de volta para o capô de fluxo laminar estéril, use fórceps para levantar ligeiramente a pastilha do poço.Depois de aspirar o meio, substitua o meio por um mililitro de meio fresco e coloque o inset de volta no poço. Para os experimentos onde as fatias são tratadas com vários compostos, como inibidores e metabólitos, prepare a concentração de reagente apropriada em 1,2 mililitros de mídia de fatia cerebral em um tubo de 1,5 mililitro, e, em seguida, transfira um mililitro de reagente para o poço que contém a fatia. As células luciferase MDA-MB-231 BR-GFP foram injetadas em camundongos nus, tumores foram autorizados a crescer, cérebros com tumores foram dissecados, fatiados, ex vivo crescidos e o crescimento do tumor foi monitorado por imagens de bioluminescência.A coloração de H&E e a fluorescência GFP-positiva confirmaram a presença de um tumor na fatia cerebral. O aumento da coloração ki-67 confirmou a presença de células cancerígenas altamente proliferativas. Os tumores em fatias cerebrais que não foram expostos à irradiação continuaram a crescer ex vivo, enquanto tumores expostos à irradiação mostraram um crescimento paralisado.As fatias cerebrais contendo tumores também foram monitoradas através de imagens ao vivo para visualizar o crescimento do tumor após o tratamento de irradiação. Consistente com a imagem bioluminescente, o controle das células cancerígenas cresceu rapidamente à medida que a intensidade do GFP aumentava e as células começaram a invadir o parênquim cerebral. Em contraste, as células cancerígenas em fatias cerebrais tratadas com irradiação eram citostáticas e a intensidade do GFP foi mantida.Grandes células cancerígenas multinucleadas e um aumento na coloração do marcador de dano de DNA em células cancerígenas tratadas pelo IR foram detectadas. Além disso, foi detectado um aumento nos astrócitos reativos. A apoptose induzida pelo tratamento de RI não foi detectada nas fatias cerebrais do camundongo sem tumor.As fatias cerebrais contendo tumores foram tratadas com diferentes concentrações de paclitaxel, uma droga quimioterápica. O tratamento diminuiu significativamente o tamanho do tumor após o 10º dia de tratamento. Foi detectado um aumento da apoptose nas células tumorais tratadas com paclitaxel.O tratamento inibidor não alterou a viabilidade do tecido cerebral. Nenhum aumento na apoptose foi medido pela coloração de caspase-3 em fatia cerebral de camundongo livre de tumores tratada com paclitaxel. Quando o tratamento com os medicamentos de interesse terminou, as fatias podem ser analisadas para expressão proteica através de imunocytoquímica, estudos omicos ou alcançar suspensão unicelular adequada para citometria de fluxo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Pesquisa do câncer

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Modelo de pulmão acelular e celular para estudar o Tumor metástase

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Imagem latente da viver-pilha ensaios de migração de células-tronco do estudo Glioblastoma cerebral Tumor e invasão

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses para imunomodulação Tumor-alvo: Design e avaliação Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

A aplicação clínica do Tumor, tratamento de terapia de campos em Glioblastoma

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Imagem latente longitudinal de intravital do comportamento da pilha do tumor cerebral em resposta a uma biópsia cirúrgica invasora

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo inibição de MicroRNA para diminuir o crescimento tumoral em camundongos

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Ensaio in vitro para estudo do tumor-interação macrófago

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Geração de tumores pancreáticos ortotópicos e caracterização ex vivo da citotoxicidade de células T infiltrada tumoral

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...