Name: an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth at JoVE.com

Мы хотим поблагодарить Джулию Фарнан, Кайлу Грин и Тициану ДеАнджелис за их техническую помощь. Эта работа была частично поддержана Пенсильванской универсальной программой грантов на улучшение исследований (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) и благотворительными фондами W.W. Smith (EjH).

Этот протокол был одобрен и следует руководящим принципам ухода за животными Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Медицинского колледжа Университета Дрекселя (IACUC). В этом исследовании использовались nu/Nu атимические самки мышей (6-8 недель).
1. Вн?...

<ol>
	<li>Watase, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+brain+metastasis-overview+of+disease+state,+treatment+options+and+future+perspectives.">Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives.</a> Cancers. 13 (5), (2021).</li><li>Niikura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+outcomes+and+prognostic+factors+for+patients+with+brain+metastases+from+breast+cancer+of+each+subtype:+a+multicenter+retrospective+analysis.">Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).</li><li>Fong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Parker, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+glioblastoma+organotypic+slice+culture+model+for+study+of+tumor+cell+migration+and+patient-specific+effects+of+anti-invasive+drugs.">A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).</li><li>Chuang, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculture+system+with+an+organotypic+brain+slice+and+3D+spheroid+of+carcinoma+cells.">Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).</li><li>Hohensee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+mediates+the+cross+talk+between+breast+and+glial+cells+in+brain+metastases+leading+to+rapid+disease+progression.">PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression.</a> Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).</li><li>van de Merbel, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+Tissue+culture+model+for+the+assessment+of+individualized+drug+responses+in+prostate+and+bladder+cancer.">An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer.</a> Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).</li><li>Martin, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tissue+slice+culture+system+to+measure+drug-response+rates+of+hepatic+metastatic+colorectal+cancer.">Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer:+a+novel+tumor-promoting+cell+type.">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).</li><li>Lim, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+preserve+the+tumor+microenvironment+and+provide+a+platform+for+drug+response.">Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response.</a> Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain.">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).</li><li>Kyeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtypes+of+breast+cancer+show+different+spatial+distributions+of+brain+metastases.">Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases.</a> PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).</li><li>Hengel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attributes+of+brain+metastases+from+breast+and+lung+cancer.">Attributes of brain metastases from breast and lung cancer.</a> International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).</li><li>Jackson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters.">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).</li><li>Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+mitochondrial+dynamics+and+trafficking+in+astrocytes.">Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).</li><li>Simone, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+oxidative+stress+alters+miRNA+expression.">Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression.</a> PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).</li><li>Couturier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+that+glioblastoma+recapitulates+a+normal+neurodevelopmental+hierarchy.">Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy.</a> Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).</li><li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).</li><li>Fitzgerald, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+glia+are+recruited+by+highly+proliferative+brain+metastases+of+breast+cancer+and+promote+tumor+cell+colonization.">Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).</li><li>Kondru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Ex+Vivo+Brain+Slice+Culture+Model+of+Chronic+Wasting+Disease:+Implications+for+Disease+Pathogenesis+and+Therapeutic+Development.">An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development.</a> Scientific Reports. 10 (1), (2020).</li><li>Abu Samaan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel's+mechanistic+and+clinical+effects+on+breast+cancer.">Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer.</a> Biomolecules. 9 (12), (2019).</li><li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies.">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).</li><li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metastasis+cell+lines+panel:+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines.">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li></ol>

Это исследование устанавливает новый метод культивирования мозга ex vivo для эксплантированных опухолей головного мозга ксенотрансплантата. Мы показываем, что клетки BCBM MDA-MB-231BR, интракрационно вводимые в мозг мышей, могут выживать и расти в срезах мозга ex vivo . Исследование также...

Метастазы рака молочной железы в мозг (BCBM) развиваются, когда клетки распространяются от первичной опухоли молочной железы к мозгу. Рак молочной железы является второй наиболее частой причиной метастазирования в мозг после рака легких, причем метастазы встречаются у 10-16% пациентов1. К сожалению, метастазы в мозг остаются неизлечимыми, так как >80% пациентов умирают в течение года после постановки диагноза метастазирования в мозг, а качество их жизни ухудшается из-за неврологических дисфункций2. Существует острая необходимость в определении более эффективных вариантов лечения. Однослойные двухмерные или трехмерные модели культур являются наиболее часто используемыми методами тестирования терапевтических агентов в лаборатории. Тем не менее, они не имитируют сложную микросреду BCBM, основной фактор фенотипа и роста опухоли. Хотя эти модели полезны, они не охватывают сложные опухолево-стромальные взаимодействия, уникальные метаболические требования и гетерогенность опухолей3. Чтобы более точно повторить опухолево-стромальные взаимодействия и гетерогенность микроокружения, наша группа и другие начали генерировать органотипические культуры метастазов в мозг с опухолевыми клетками, полученными от пациента (первичными или метастатическими) или раковыми клеточными линиями 4,5,6. По сравнению с классическими системами in vitro, эта краткосрочная модель ex vivo может обеспечить более подходящие условия для скрининга новых терапевтических средств до доклинической оценки в больших когортах животных.
Модели ex vivo были построены и успешно используются в первую очередь для выявления успешных методов лечения различных видов рака. Они требуют нескольких дней оценки и, кроме того, могут быть адаптированы к скринингу лекарств для конкретного пациента. Например, ткани мочевого пузыря и предстательной железы ex vivo показали дозозависимый противоопухолевый ответ доцетаксела и гемцитабина7. Подобные ткани колоректальной карциномы ex vivo были разработаны для скрининга химиотерапевтических препаратов Оксалиплатина, Цетуксимаба и Пембролизумаба8. Это применение широко используется при раке поджелудочной железы, учитывая существенное взаимодействие между стромальной средой и генотипическими и фенотипическими характеристиками аденокарциномы протоков поджелудочной железы 9,10. Кроме того, такие органотипические модели были разработаны для аналогичных скринингов опухолей головы, шеи, желудка и молочной железы11,12.
Здесь генерируется модель среза мозга ex vivo ксенотрансплантированных метастатических опухолевых клеток рака молочной железы в их микросреде. Мышам интракраниально вводили метастатические трофическиеклетки мозга MDA-MB-231BR рака молочной железы - общий участок метастазирования TNBC14,15 и позволяли развивать опухоли. Срезы мозга были получены из этих ксенотрансплантированных животных и поддерживались ex vivo как оловоорганические культуры, как описано16,17. Эта новая модель ex vivo позволяет анализировать рост клеток BCBM в паренхиме мозга и может быть использована для тестирования терапевтических агентов и радиационного воздействия на опухолевые клетки в микроокружении мозга.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe, slip tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G1/2 Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Genessee</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microscope and LUMAVIEW software</td>
			<td>Etaluma</td>
			<td>LS720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (GEM21)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>400-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-210-685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt sable paintbrush, Size #5/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Wax</td>
			<td>ModoMed</td>
			<td>DYNJBW25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain injection Syringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP510-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase 3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14220S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060(95-0043)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-805a (1001-042)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sable paintbrush #2/0</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-H2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Corning cellgrow</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E and KI-67</td>
			<td>Jefferson Core Facility Pathology staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>YCQ2851920086082DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, free acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Just for mice Stereotaxic Frame</td>
			<td>Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).</td>
			<td>72-6049, 72-6044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231BR cells</td>
			<td>Kindly provided by Dr. Patricia Steeg</td>
			<td>Ref 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging device</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>IVIS 200 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice imaging software</td>
			<td>Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).</td>
			<td>Living Image Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Tecan Spark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS reagent</td>
			<td>Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution</td>
			<td>(Cat:G3582)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu/Nu athymic mice</td>
			<td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>145140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Suture</td>
			<td>Medex supply</td>
			<td>ETH-8556H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Swab sticks</td>
			<td>DME Supply USA</td>
			<td>Cat: 689286X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade #11 (pk of 100)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula/probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10090-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel</td>
			<td>Exelint International</td>
			<td>D29702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Brinkman</td>
			<td>(McIlwain type)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICMORG50 or PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray machine</td>
			<td>Precision 250 kVp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo brain slice model to study and target breast cancer brain metastatic tumor growth

Метастазы в мозг являются серьезным последствием рака молочной железы для женщин, поскольку эти опухоли трудно поддаются лечению и связаны с плохими клиническими результатами. Доклинические мышиные модели метастатического роста рака молочной железы (BCBM) полезны, но стоят дорого, и трудно отслеживать живые клетки и инвазию опухолевых клеток в паренхиме мозга. Здесь представлен протокол для культур срезов мозга ex vivo от ксенотрансплантированных мышей, содержащих внутрикраниально введенные клональные сублинии рака молочной железы. Клетки, помеченные люциферазой MDA-MB-231BR , вводились интракраниально в мозг самок мышей Nu/Nu, и после образования опухоли мозги были выделены, разрезаны и культивированы ex vivo. Срезы опухоли были сфотографированы для идентификации опухолевых клеток, экспрессирующих люциферазу, и мониторинга их пролиферации и инвазии в паренхиме головного мозга в течение 10 дней. Кроме того, протокол описывает использование покадровой микроскопии для изображения роста и инвазивного поведения опухолевых клеток после лечения ионизирующим излучением или химиотерапией. Реакция опухолевых клеток на лечение может быть визуализирована с помощью микроскопии с живой визуализацией, измерения интенсивности биолюминесценции и выполнения гистологии на срезе мозга, содержащем клетки BCBM. Таким образом, эта модель среза ex vivo может быть полезной платформой для быстрого тестирования новых терапевтических агентов отдельно или в сочетании с радиацией для идентификации лекарств, персонализированных для нацеливания на метастатический рост рака молочной железы отдельного пациента в микросреде мозга.

Клетки MDA-MB-231BR-GFP-Люциферазы вводили интракраниально в правое полушарие 4-6-недельных мышей Nu/Nu, как описано выше (рисунок 1A), и позволяли расти в течение 12-14 дней, в течение которых рост опухоли контролировался с помощью биолюминесцентной визуализации (рисунок 1...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth at JoVE.com

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Мы представляем протокол для измерения лекарственного и радиационного ответа в режиме реального времени метастатических клеток рака молочной железы в органотипической модели среза мозга. Методы обеспечивают количественный анализ для изучения терапевтического воздействия различных методов лечения на метастазы в мозг от рака молочной железы ex vivo в интерфейсе микроокружения мозга.

Модель среза мозга Ex Vivo для изучения и нацеливания на метастатический рост опухоли головного мозга рака молочной железы

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Этот протокол позволяет формировать метастатические опухолевые клетки мозга и генерировать срезы мозга ex vivo, что позволяет быстро тестировать эффективность лекарств и радиацию на предварительно сформированной опухоли. Основным преимуществом этого метода является возможность быстрого тестирования нескольких лекарств или методов лечения в физиологически значимых условиях, которые поддерживают взаимодействие мозг-опухоль-хозяин. Этот метод может помочь понять, как метастатические клетки мозга растут, выживают и вторгаются в паренхиму мозга, и понять роль микроокружения опухоли головного мозга в росте и распространении рака.Продемонстрировать процедуру будут Лорела Чираку и Эмили Эскеа, кандидаты наук из моей лаборатории. Для начала поместите обезболенных мышей в стереотаксическую рамку и обездвижите голову с помощью стандартных ушных вкладышей. Стерилизуют поверхность головки трижды путем повторного попеременного нанесения йодных тампонов и 70% этанола перед разрезом.Используя хирургический скальпель, сделайте сантиметровый разрез средней линии под диагональным углом к воображаемой оси, разделяющей мозг мышей на две симметричные половины, чтобы обнажить череп. После протирания любой крови ватным тампоном отклоните кожу вбок, чтобы обнажить место инъекции. Используйте 0,73-миллиметровый заусенец, чтобы проникнуть в череп и просверлить отверстие, используя небольшое давление и скручивающее движение.Чтобы ввести пять микролитров клеток, стабильно экспрессирующих люциферазу GFP, вставьте высокоточный шприц на глубину 3,5 миллиметра в мозг. Дайте ему отстояться в течение двух минут, а затем потяните шприц вверх примерно на один миллиметр. Через две минуты медленно введите первую половину объема и подождите еще две минуты, прежде чем вводить остальную часть объема.Через три минуты медленно потяните шприц. Нанесите костный воск на место инъекции на черепе и зашить ткань полипропиленовыми швами. Периодически контролируйте поведение мыши сразу после операции, чтобы определить, необходимо ли специальное лечение, включая инъекции физиологического раствора и мягкую пищу, чтобы помочь быстрому выздоровлению.Чтобы контролировать рост опухоли с помощью биолюминесцентной визуализации, сначала включите кислород и изофлуран в системе визуализации и позвольте им распределить их в отдельную камеру за пределами коробки визуализации. Затем, после включения программного обеспечения и инициализации инструмента, выберите подходящий вариант визуализации и захвата всего тела мыши. Затем перенесите мышей в камеру за пределами коробки визуализации, снабженную кислородом и изофлураном.Как только мыши окажутся под анестезирующим эффектом, вводят мышам внутрибрюшинно 200 микролитров по 30 миллиграммов на миллилитр люциферина. Поместите мышей в камеру визуализации животом лицом вниз к камере визуализации носовой губы. Заблокируйте камеру, выберите двухминутное время экспозиции, чтобы начать визуализацию, а затем завершите визуализацию.После помещения слайсера ткани в стерильный ламинарный проточный вытяжку очистите все инструменты и инструменты 70% этанолом. После эвтаназии мыши удалите и поместите мозг быстро в ледяной раствор сахарозы-ACSF. С помощью шпателя перенесите мозг на смачиваемую ACSF фильтровальную бумагу на 60-миллиметровую крышку тарелки.Используя острое, стерильное лезвие бритвы, отрежьте лишние части мозга, которые не содержат никакой опухоли, включая нижнюю часть мозга, чтобы довести форму мозга до неидеального куба. Поместив несколько листов смачиваемой ACSF фильтровальной бумаги на режущую платформу, поместите заблокированную ткань на фильтровальную бумагу. Чтобы разрезать ткань на участки толщиной от 200 до 250 микрометров, установите размер разреза на 2 или 2,5 единицы на линейке поставщика и начните резку.Используйте кисть для переноса ломтиков мозга в чашку, содержащую сахарозу-ACSF, и отделяйте ломтики под световым микроскопом с помощью игл 27-го калибра. Определите GFP-положительные срезы под флуоресцентным микроскопом. Затем, используя стерильную одномилитровую отколовшуюся пипетку с широким отверстием, переложите идентифицированные ломтики в новую 60-миллиметровую посуду, содержащую два-три миллилитра взрослой срезовой среды.Затем переложите от трех до пяти ломтиков на каждую культуру ткани, вставленную в каждую лунку шестилуночной пластины на безопасном расстоянии. После удаления лишней среды с поверхности вставки добавьте один миллилитр уравновешенного слоя взрослой мыши под каждую вставку. Инкубируйте ткани при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа и 95% влажности в течение 24 часов перед визуализацией.Пипетка пять микролитров по 30 миллиграммов на миллилитр раствора люциферина в среду под вставками внутри стерильного капюшона. Поместите шестилуночную пластину с крышкой внутрь камеры визуализации инструмента под стационарной камерой и закройте дверцу камеры. Откройте программное обеспечение и инициализируйте инструмент.После выбора настроек камеры, позволяющих визуализировать и захватывать только одну скважину на изображение, поместите колодец для изображения непосредственно под камерой. Используйте инструмент ROI, поместите его вокруг формы и размера опухоли, измерьте ROI и сообщите общие показания для количественной оценки биолюминесцентного сигнала каждой опухоли на срезе. После того, как пластина вернется к стерильному ламинарной вытяжке, используйте щипцы, чтобы слегка приподнять вставку из колодца.После аспирации среды замените среду одним миллилитром свежей среды и поместите вставку обратно в колодец. Для экспериментов, где срезы обрабатывают различными соединениями, такими как ингибиторы и метаболиты, готовят соответствующую концентрацию реагента в 1,2 миллилитрах мозговой срезовой среды в 1,5-миллилитровой трубке, а затем переносят один миллилитр реагента в скважину, содержащую срез. Люциферазные клетки MDA-MB-231 BR-GFP вводили обнаженным мышам, опухолям разрешалось расти, мозг с опухолями рассекалывали, разрезали, выращивали ex vivo, а рост опухоли контролировали с помощью биолюминесцентной визуализации.Окрашивание H&E и GFP-положительная флуоресценция подтвердили наличие опухоли в срезе мозга. Повышенное окрашивание Ki-67 подтвердило наличие высокопролиферативных раковых клеток. Опухоли в срезах мозга, которые не подвергались облучению, продолжали расти ex vivo, в то время как опухоли, подвергшиеся облучению, показали застопорившийся рост.Срезы мозга, содержащие опухоли, также контролировались с помощью живой визуализации для визуализации роста опухоли после облучения. В соответствии с биолюминесцентной визуализацией, контрольные раковые клетки быстро росли по мере увеличения интенсивности GFP, и клетки начали вторгаться в паренхиму мозга. Напротив, раковые клетки в срезах мозга, обработанных облучением, были цитостатическими, а интенсивность GFP поддерживалась.Были обнаружены крупные многоядерные раковые клетки и увеличение окрашивания маркера повреждения ДНК в ИК-обработанных раковых клетках. Также было обнаружено увеличение реактивных астроцитов. ИК-индуцированный апоптоз не был обнаружен в срезах мозга мыши без опухоли.Срезы мозга, содержащие опухоли, обрабатывали различными концентрациями паклитаксела, химиотерапевтического препарата. Лечение значительно уменьшило размер опухоли после 10-го дня лечения. Увеличение апоптоза было обнаружено в опухолевых клетках, обработанных паклитакселом.Лечение ингибитором не изменяло жизнеспособность тканей головного мозга. Увеличение апоптоза не было измерено расщепленным окрашиванием каспазы-3 в обработанном паклитакселом срезе мозга мыши без опухоли. Когда лечение препаратами, представляющими интерес, прекращено, срезы могут быть проанализированы на экспрессию белка с помощью иммуноцитохимии, омических исследований или достижения одноклеточной суспензии, подходящей для проточной цитометрии.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Воротной вены для инъекций модель для изучения печени метастазирования рака молочной железы

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Бесклеточной и клеточных легких модель для изучения метастазов опухоли

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Assays клеток опухоли стволовых клеток глиобластомы мозга исследования миграции и вторжения

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Парамиксовирусы для ориентированных на опухоль иммуномодуляция: дизайн и оценке Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Клиническое применение лечения глиобластома поля терапии опухоли

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Продольная интравитальная визуализация поведения опухолевых клеток головного мозга в ответ на инвазивную хирургическую биопсию

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

В Vivo ингибирование микроРНК для уменьшения роста опухоли у мышей

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

В vitro Анализ для изучения опухоли макрофаг взаимодействия

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Поколение ортотопических опухолей поджелудочной железы и Ex vivo Характеристика опухоли-проникновения T клеточной цитотоксичности

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...