Name: dissection of single skeletal muscle fibers for immunofluorescent and morphometric analyses of whole-mount neuromuscular junctions
Uploaded: 2021-08-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions at JoVE.com

非常感谢CSIC和PEDECIBA为这项工作提供的财政支持：娜塔莉亚罗萨诺为她的手稿更正;马塞洛卡萨库贝塔， 使视频和尼科拉斯博拉托借给他的声音。

所有动物程序均按照国家法律 N+ 18611 的准则执行，该法律旨在保护用于实验目的的动物。该议定书已得到机构道德委员会（CEUA IIBCE，第004/09/2015号议定书）的批准。
1. 肌肉解剖（第1天）
注：在开始之前，在杜尔贝科的磷酸盐盐水（DPBS）中制作40 mL的0.5%的副甲醛（PFA），pH 7.4。可选，使 20 mL 的 4% PFA。准备 5 mL 阿利库特，并在 -20 °C 下冻结。 解剖当天，?...

在本文中，我们提出了一个详细的协议，用于解剖两个大鼠骨骼肌（一个慢抽搐，另一个快速抽搐），纤维肌肉隔离和免疫荧光检测的预和后合成标记，以定量评估NMJ的变化以及组装/拆解过程。这种协议可用于啮齿动物模型41，42评估NMJ在生理或病理过程中，如这里例证的运动神经元退化模型，如在ALS hSOD1G93A大鼠发现。
为了获得成...

哺乳动物神经肌肉结（NMJ）是由运动神经元神经末梢、骨骼肌肉纤维上的后关节膜和末梢施万细胞1、2、3组成的大型胆碱三方突触。这种突触表现出高形态和功能可塑性4，5，6，7，8，即使在成年时，NMJs可以进行动态结构修改。例如，一些研究人员已经表明，运动神经末梢在微米尺度9时不断改变其形状。另据报道，NMJ的形态响应功能要求，改变使用，老化，锻炼，或变化的运动活动4，10，11，12，13，14，15。因此，训练和缺乏使用是改变NMJ的一些特征的基本刺激，如其大小，长度，突触囊泡和受体的分散，以及神经末梢分支14，16，17，18，19，20。
此外，已经表明，任何结构变化或退化这个重要交汇点可能导致运动神经元细胞死亡和肌肉萎缩21。人们还认为，神经和肌肉之间交流的改变可能是生理年龄相关NMJ变化的原因，也可能是其在病理状态下的破坏。神经肌肉结拆解在肌萎缩性侧索硬化症（ALS）的发病中起着至关重要的作用，这是一种神经退行性疾病，是肌肉神经相互作用受损的最佳例子之一。尽管对运动神经元功能障碍进行了大量研究，但ALS中观察到的恶化是否由于运动神经元的直接损伤而发生，然后延伸到皮质-脊柱预测22：在ALS中观察到的恶化是否由于运动神经元的直接损伤而发生，以及是否延伸到皮质-脊柱预测22：是否由于运动神经元的直接损伤而恶化，仍有待讨论。或者，如果它应该被认为是一个离散轴突，其中退化开始在神经末梢和进展到运动神经元 Somas23，24。鉴于ALS病理学的复杂性，考虑独立过程的混合是合乎逻辑的。由于NMJ是肌肉和神经之间生理病理相互作用的核心作用，其不稳定性是有关疾病起源的关键点，有待分析。
哺乳动物神经肌肉系统在功能上被组织成离散的运动单元，由运动神经元和肌肉纤维组成，这些肌肉纤维完全由神经末梢内侧组成。每个电机单元都有具有相似或相同的结构和功能特性的纤维25。运动神经元选择性招募允许优化肌肉响应功能需求。现在很明显，哺乳动物的骨骼肌肉由四种不同的纤维类型组成。有些肌肉是根据他们最丰富的纤维类型的特征命名的。例如，鞋底（后肢后肢的后肢肌肉参与身体姿势的维护）具有大多数慢抽搐单位（类型 1），并被识别为慢肌肉。相反，扩展数字长久（EDL）基本上由具有类似快速抽搐特性的单位（2型纤维）组成，被称为用于运动所需的相位运动的快速肌肉。换句话说，虽然成人肌肉是塑料的性质，由于荷尔蒙和神经的影响，其纤维组成决定了执行不同活动的能力，如鞋底经历持续低强度活动和EDL，表现出更快速的单抽搐。不同类型的肌肉纤维中可变的其他特征与它们的结构有关（线粒体含量、肉瘤视网膜的延伸、Z线的厚度）、肌素ATPase含量和肌素重链组成26、27、28、29。
对于啮齿动物NMJ，肌肉之间有显著的差异28，29。从大鼠对鞋底和EDL进行的形态学分析显示突触区域与纤维直径之间呈正相关关系（即鞋底慢纤维的突触区域大于EDL快速纤维），但NMJ区域与纤维大小的比例在肌肉30、31两个肌肉中相似。此外，在神经末梢方面，1型纤维的端板绝对区域低于2型纤维，而纤维直径的正常化使1型纤维中的神经末梢区域成为最大的32。
然而，很少有研究侧重于形态学分析，以显示一些NMJ组件33，34的变化的证据。因此，由于NMJ在生物体功能中的相关性，其形态和生理学在各种病理中都发生了变化，因此，必须优化不同类型肌肉的解剖方案，使其质量足以使整个NMJ结构的可视化。也有必要评估在不同的实验情况或条件，如老化或运动35，36，37，38发生预或后合成变化。此外，它可以帮助证明NMJ成分的更微妙的变化，如改变神经丝磷化在终端神经末梢，如ALS39报道。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with cool light illumination</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-10A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>Biometra (WT 16)</td>
			<td>042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses (24 x 32 mm)</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium (Plus) microscope slides</td>
			<td>PORLAB</td>
			<td>PC-201-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uniband LA-4C Scissors 125mm</td>
			<td>E.M.S</td>
			<td>77910-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disponsable surgical blades #10</td>
			<td>Sakira Medical</td>
			<td>1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disponsable sterile syringe (1 ml)</td>
			<td>Sakira Medical</td>
			<td>1569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super PAP pen</td>
			<td>E.M.S</td>
			<td>71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;l or 200 &#956;l pipette</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>9400130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800 - AiryScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>2148-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (Dulbecco)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Bio Basic INC.</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>Previously Covance # SMI 31P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801701</td>
			<td>Previously Covance # SMI-32P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S32355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminophenylindole (DAPI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of single skeletal muscle fibers for immunofluorescent and morphometric analyses of whole-mount neuromuscular junctions

神经肌肉结 （NMJ） 是运动神经和骨骼肌之间的一个专门接触点。此外围突触具有高形态和功能可塑性。在许多神经系统疾病中，NMJ是导致神经转移衰竭、虚弱、萎缩，甚至肌肉纤维死亡的早期病理靶点。由于其相关性，对 NMJ 组件之间关系的某些方面进行定量评估的可能性有助于了解与其装配/拆解相关的流程。与肌肉配合时，第一个障碍是获得技术专长，在不损害肌肉纤维的情况下快速识别和解剖肌肉。第二个挑战是利用高质量的检测方法获取可用于进行定量分析的 NMJ 图像。本文提出了一个分步协议，从大鼠中解剖外周数字龙骨和鞋底肌肉。它还解释了使用免疫荧光来可视化全安装NMJ的预和后合成元素。 获得的结果表明，该技术可用于建立突触的微观解剖，并识别其某些成分在生理或病理条件下状态的微妙变化。

此协议提供了一个简单的方法来隔离和免疫污渍肌肉纤维从两种不同类型的肌肉（快速和慢抽搐肌肉，见 图1）。使用正确的标记和 /或探针，可以检测和评估 NMJ 组件，因为从定量角度来评估疾病进展或特定药物治疗可能产生的一些形态变化。在本研究中，NMJ的早熟和后合成成分分别使用抗Nf或抗磷Nf抗体和Btx（图2，上面板）进行荧光标记。免疫染色?...

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Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

准确检测神经肌肉结状组件的能力对于评估其结构中的修改至关重要，因为病理学或发育过程。在这里，我们提出了一个简单明了的方法，以获得全安装神经肌肉交汇点的高质量图像，可用于执行定量测量的完整描述。

单骨骼肌肉纤维解剖，用于全山神经肌肉结的免疫荧光和形态分析

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

解剖单骨骼肌纤维，用于全安装神经肌肉结的免疫荧光和形态分析。此视频将演示一个协议，以有效和安全地解剖EDL和鞋底肌肉与可重复的方法。此视频还将教如何获得全安装神经肌肉结点，目的是识别具有 3D 完整性的突触组件，以便进行准确的形态分析。为了解剖肌肉，这些手术器械是必要的。要启动程序，将动物的腹部朝上放置。使用脚趾之间的手术刀片对后肢进行初始切口。剥去皮肤，向上拉，直到右膝露出来。要找到 EDL，请按照脚肌腱到环状韧带。这个韧带绕两个肌腱。用两个肌腱之间的 Uniband 剪刀切开韧带。通过抬起两个并看到哪一个使脚趾向上移动来识别 EDL 肌腱。用剪刀切肌腱。当用生物钳子握住肌腱时，开始慢慢将EDL肌肉与其他后肢肌肉分离。在不造成损伤的情况下分离肌肉，可以通过对其他横向肌肉进行各种切口，以打开它们之间的路径，同时将肌肉从 EDL 肌腱的分裂部分保持和提升。要完全隔离肌肉，使用 Uniband 剪刀切割附着在鼠膝上的肌腱。将解剖的肌肉浸入固定溶液中，并在摄氏四度下将其保留 24 小时。一般来说，有一个拉长的肌肉是有用的。为此，使用纸板和主食连接肌肉固定。要隔离鞋底肌肉，翻转动物。通过皮肤，使用手术刀片切开钙化肌腱。在生物钳子和 Uniband 剪刀的帮助下，将胃内膜肌肉与骨骼分离，形成肌肉盖。鞋底将在肌肉盖的内侧。它可以识别，因为它是红色和平坦的。用一对生物钳子，伸手和抬起位于上面胃内皮上方的鞋底肌腱。用 Uniband 剪刀切肌腱。抬起整个肌肉，同时切割一些薄弱的附件点。最后，要完全释放鞋底肌肉，切开形成钙化肌腱的鞋底囊泡。重复固定步骤，就像EDL肌肉一样。要使用这种方法，重要的是确保主食的肌腱，而不是肌肉。一旦24小时固定期过去，冲洗DPBS溶液中的肌肉，然后开始分离肌肉纤维。为了隔离纤维，用一对生物钳轻轻握住一根肌腱。然后用另一对生物钳子，开始慢慢捏肌腱来分离肌肉纤维。要隔离纤维，慢慢向上拉向相反的肌肉肌腱。在获得多个、小的、孤立的捆绑包之前，必须重复多次此操作。一旦分离成小的隔离捆绑包，小心地将其放置在预先处理的硅化幻灯片中。有必要保持所有的纤维有序，以便它们不重叠。此时，纤维可以让空气干燥 24 小时。24小时后，开始免疫染色。要创建防水屏障，请使用 PAP 笔将预处理滑梯中孤立的肌肉纤维包围。这是根据此处描述的协议可以获取的高分辨率共焦图像的示例。在左上角，显示突触后元素，在右上角显示突触前元素，而底部图像显示突触元件的构图，以说明用于形态分析的参数。第二张幻灯片显示突触前和后信号与 API 核污渍的合并。转基因动物与非转基因动物神经肌肉结的差异是显而易见的。神经肌肉结的形态分析显示了转基因动物突触后信号的证据，并且似乎更紧凑，这主要是由于神经肌肉结总面积的减少。如这里所示，转基因动物的神经肌肉结突触前区域减少。检测到的最小是发现具有抗磷化神经丝带信号的信号，例如在图像 B 中所示。最后一张图片显示了与全安装神经肌肉结状态相关的结果。利用覆盖指数，确定发现转基因神经肌肉结部分衰减。此外，它可以确定磷酸化神经丝的覆盖范围和关系低于检测到非磷酸化神经丝时获得的覆盖范围和关系。拟议的协议允许从慢速和快速肌肉纤维获得高质量的神经肌肉结制剂。通过特定探头或抗体识别突触前和突触后神经肌肉结成分，然后通过共聚焦或超分辨率共聚焦显微镜成像，从而在微观尺度上进行形态学分析。

Research

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Neuroscience

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神经科学

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