Name: expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

نقدم الشكر للعلاجات المناعية الخلوية - المحقق بدء التجارب جائزة فرصة التمويل داخل العين من مركز موفيت للسرطان لتوفير التمويل لهذا التطور البروتوكول. كما نشكر الدكتور كلاوديو أنسيتي على مساعدته وتوجيهاته القيمة من خلال هذا المشروع. وأخيرا، نشكر الدكتور جاستن باوتشر على أفكاره ومراجعة المخطوطة.

ملاحظة: تم الحصول على موافقة مجلس الهجرة والحواسة، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من الجهات المانحة.
1. عزل الخلايا الليمفاوية
<ol><li>نقل المنتج apheresis إلى غرفة نظيفة. ملاحظة: تم إجراء التحقق من صحة العملية باستخدام apheresis المانح العادي من بائع تجاري خارجي متوافق مع لوائح جمع المواد الخلوية الخام.</li>
	<li>جمع عينات لاختبار العقم، وعدد الخلايا، وphenotyping الخلية.</li>
	<li>Elutriate على جهاز الطرد المركزي التدفق المضاد باستخدام وسيلة أساسية من هانكس متوازنة ملح الحل مع 1٪ من الألبومين مصل الإنسان (HSA) ووسيط ثانوي من محلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم حقن USP) أو ملحية الفوسفات المخزنة بالفوسفات (DPBS). تعيين سرعة الطرد المركزي elutriation في 900 × غرام وجمع الكسور على أساس معدل التدفق والوقت.</li>
	<li>جمع عينات من الكسر 2 وإجراء الاختبارات التالية: 2 مل لاختبار العقم; 0.5 مل لعدد الخلايا وقابليتها للاستمرار باستخدام برتقالة acridine / البروبيديوم يوديد (AO / PI)؛ 5 × 106 خلايا لفينوتيبينج الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي.</li>
	<li>توسيع كسر الخلايا الليمفاوية النقية (كسر 2) من الخلايا في الثقافة في 10 × 106 خلايا / سم2 في 1 لتر مفاعل حيوي مغلق النظام مع 5 ميكرومول / لتر من حمض الزوليدرونيك و 300 وحدة/ مل من IL-2.</li>
	<li>احتضان لمدة سبعة أيام في حاضنة حددت في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.</li>
</ol>2. ألفا بيتا (αβ) استنفاد الخلايا التائية
<ol><li>حصاد الخلايا من قارورة مفاعل حيوي مغلقة 1 لتر. العقيمة لحام حزمة نقل 1 لتر إلى الخط الأحمر من المفاعل الحيوي مغلق النظام، واستخدام مضخة الصيدلانية المناسبة لنقل الخلايا إلى حزمة نقل.</li>
	<li>خذ العينات التالية: 10 مل للعقم المتوسط المستهلك؛ 0.5 مل من الخلايا لحساب الخلايا وقابليتها للحياة باستخدام AO / PI؛ 5 × 106 خلايا لقياس التدفق الخلوي</li>
	<li>إعادة إنفاق الخلايا في ~ 5 × 108 خلايا / مل في المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) أو (PBS / حمض الإيثيلينامينتتراستيك (EDTA)) العازلة + 0.5٪ HSA والأجسام المضادة TCR αβ محددة.</li>
	<li>وضع شاكر في الثلاجة واحتضان الخلايا في 2-8 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا مع اهتزاز.</li>
	<li>غسل الخلايا مع ما مجموعه 600 مل من مخزن مؤقت PBS / EDTA + 0.5٪ HSA. جهاز طرد مركزي لإزالة الأجسام المضادة غير المنضمة في 200-500 × غرام لمدة 15 دقيقة في 2-8 درجة مئوية. Resuspend ~ 5 × 108 خلايا / مل في برنامج تلفزيوني / EDTA العازلة + 0.5 ٪ HSA مع الميكروبات المضادة للبيوتين محددة (7.5 مل / 1 قارورة).</li>
	<li>وضع شاكر في الثلاجة واحتضان الخلايا في 2-8 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا مع اهتزاز. بعد الحضانة، والطرد المركزي الخلايا في 200-500 × غرام لمدة 15 دقيقة في 2-8 درجة مئوية لإزالة الميكروبات غير المنضمة. Resuspend ~ 6 × 107 خلايا / مل في برنامج تلفزيوني / EDTA العازلة + 0.5 ٪ HSA ونقلها إلى حقيبة نقل حزمة.</li>
	<li>تثبيت مجموعة أنابيب في الصف السريري جهاز فصل الخلايا المغناطيسية باتباع تعليمات الشركة المصنعة، ووضع حزم مع المخزن المؤقت PBS / EDTA وحزمة نقل مع المنتج الخلية في الصك وارتفاع عندما أمرت من قبل الصك.</li>
	<li>حدد بروتوكول Depletion 1.2 لاستنفاد الخلايا التائية المسماة αβ.</li>
	<li>الطرد المركزي الكسر المستهدف (المخصب γδ الخلايا التائية) وإعادة إنفاق الخلايا في المتوسط تكملها 10٪ مصل AB الإنسان.</li>
	<li>خذ عينة 0.5 مل واحسب عدد الخلايا وقابليتها للاستمرار مع بقعة AO/PI. جلب الخلايا إلى تركيز النهائي من حوالي 1 × 106 خلايا / مل. خذ عينة من 5 × 106 خلايا من المنتج لتدفق الخلايا phenotyping بعد الاستنفاد.</li>
</ol>3. الثقافة المشتركة مع AAPCs
<ol><li>إشعاع 5 × 107 aAPCs / قارورة في 100 Gy على أداة توليد الأشعة السينية.</li>
	<li>استخدام aAPCs في الثقافة المشتركة بنسبة 10:1 مع الخلايا التائية γδ. ضع AAPCs المشععة (5 × 107 خلايا / قارورة) والخلايا التائية (5 × 106 خلايا / قارورة) في 1 L قوارير مفاعل حيوي مغلق النظام مع 1 لتر من الثقافة المتوسطة تكملها 10٪ مصل AB الإنسان. البذور تصل إلى 10 قوارير.</li>
	<li>توسيع الخلايا في الثقافة لمدة 10 أيام في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.</li>
	<li>مراقبة مستويات الجلوكوز واللاكتات كل 3-4 أيام باستخدام شرائح, الجلوكوز, ومتر اللاكتات.</li>
	<li>إذا انخفض الجلوكوز إلى 250 ملغم/ديسيلتر، قم بتخفيض الحجم في القارورة إلى 200 مل باستخدام مضخة صيدلانية عن طريق اللحام العقيم لحزمة نقل 1 لتر إلى الخط الأحمر للمقلح الحيوي للنظام المغلق.</li>
	<li>اخلط الخلايا في 200 مل المتبقية، وأخذ عينة 0.5 مل لعد الخلايا وقياس قابليتها للحياة عن طريق تلطيخ AO-PI. إذا كان عدد الخلايا هو ≥109، وتقسيم قارورة واحدة إلى قارورتين وملء كل قارورة تصل إلى 1 L مع AIM-V تكملها 10٪ مصل AB الإنسان. إذا كان عدد الخلايا هو <109، تغذية الخلايا مع لتر جديد من الثقافة المتوسطة تكملها 10٪ مصل AB الإنسان.</li>
	<li>كرر الخطوة 3.6 لجميع القوارير وإعادتها إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. كرر الخطوات 3.4-3.7 كل 3 إلى 4 أيام.</li>
</ol>4. حصاد الخلية
<ol><li>في نهاية 10 أيام في الثقافة المشتركة، حصاد جميع قوارير المفاعل الحيوي. حصاد قارورة مفاعل حيوي واحد في وقت واحد، وتجمع جميع الخلايا في حزمة نقل من الحجم المناسب. العقيمة لحام حزمة نقل إلى الخط الأحمر من المفاعل الحيوي مغلق النظام، واستخدام مضخة الصيدلانية لنقل الخلايا إلى حزمة نقل.</li>
	<li>إزالة عينات مراقبة الجودة التالية: 1٪ من منتج الدواء (DP) للعقم عن طريق زراعة الدم وتلطيخ الغرام؛ 0.5 مل لحساب الخلايا وقابليتها للاستمرار باستخدام AO/PI؛ 5-10 × 106 خلايا لقياس التدفق الخلوي (انظر الشكل 1 لاستراتيجية الغاينغ)؛ 0.5 مل للسمين الإندوتوشين؛ 0.5 مل لتلطيخ غرام; ارتفعت 106 خلايا إلى 10 مل من المتوسطة المستهلكة لاختبار الميكوبلازما.</li>
	<li>الطرد المركزي الخلايا في 200-500 × غرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والتخلص من supernatant.</li>
	<li>غسل الخلايا في حل من محلول كريستالويد متوازن + 0.5٪ HSA في 200-500 × غرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. Resuspend لهم في حجم مستهدف من 100-300 مل من محلول كريستالويد متوازن + 0.5٪ HSA.</li>
</ol>5. اختبار الإصدار
<ol><li>إجراء اختبار مراقبة الجودة للخلية γδ T DP لما يلي: النقاء والهوية حسب قياس التدفق الخلوي (لايف / ميت، CD45، CD3، TCR αβ، TCR γδ، CD20، CD56، CD16)؛ قابلية البقاء بواسطة AO / PI تلطيخ; السموم الداخلية; اختبار الميكوبلازما بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؛ العقم عن طريق تلطيخ غرام والثقافات الهوائية والهوائية الدم; فحص K562 المتبقي حسب قياس التدفق الخلوي (CD3-CD16-CD56-CD71+).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation:+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study.">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation.">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li><li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment,+risk+factors,+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li><li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph++leukemia+model.">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).</li><li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;&#948;+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-&#945;&#946;+/CD19++lymphocytes.">&#947;&#948; T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-&#945;&#946;+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li><li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+T+cell+receptor:+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors.">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells.">Large-scale expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li><li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+for+immunotherapy.">In vitro expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+V&#947;9V&#948;2+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer.">Allogeneic V&#947;9V&#948;2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li></ol>

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

وقد وضعت مختبر Moffit العلاج بالخلايا بروتوكول مع التوسع ثنائي الطور من الخلايا التائية نقية للغاية لاستخدامها ك DP في التجارب السريرية. يوفر هذا البروتوكول طريقة تصنيع تحت المبادئ التوجيهية cGMP في نظام مغلق ينتج خلية T نقية للغاية DP التي يتم تنشيطها وتوسيعها بنجاح بواسطة حمض الزوليدروك وAPCs WCB. وقد تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل ادارة الاغذية والعقاقير لتصنيع خلية γδ T allogeneic DP لمرضى مكافحة غسل الأموال. باستخدام المتبرعين الأصحاء، قمنا بنجاح بتوسيع عدد السكان الصغير من الخلايا التائية المانحة في 7 أيام فقط من 2.06 ± 0.45٪ إلى 54.45 ± 28.34٪. بعد التوسع لمدة 7 أيام مع حمض الزوليدرونيك ، لوحظ أن المانح 2 كان لديه زيادة في عدد سكان ناغورني كاراباخ.
حمض الزوليدرونيك يمنع فارنسيل ثنائي فوسفات synthase (FDPS) في monocytes، والذي، بدوره، يؤدي إلى تراكم الفوسفات ثنائي فوسفات الإيزوبينيل (IPP)، والتي ارتبطت مع زيادة كبيرة في انتشار الخلايا التائية والخلايا الطبيعية NK7،8،9. هذه الزيادة في عدد سكان ناغورني كاراباخ تعيق المرحلة الثانية من التوسع مع AAPCs ، لأن AAPCs لن تسهم إلا في زيادة توسيع خلايا ناغورني كاراباخ. ولهذا السبب، عدلت معايير المانحين لاستبعاد المانحين الذين ترتفع أعدادهم في ناغورني كاراباخ. بعد استنفاد الخلايا التائية αβ، تم إثراء الخلايا التائية إلى 76.61 ± 27.51٪. يتضمن هذا البروتوكول الفريد توسعا ثانيا باستخدام مستقبلات Moffit المصنعة لاستهداف مستقبلات CD8 و CD28 و CD127L في الخلايا التائية. هذه المرحلة التوسع الثاني مع aAPCs أسفرت عن DP مع ≥65٪ للخلايا CD3 + TCR γδ + T، ≤1٪ TCRαβ، وخلايا CD3-CD16 + CD56 + NK <35٪. ونظرا لاستخدام مركبات الكربون الهيدروفلورية المشتقة من K562، كان من الضروري إثبات أن هذه المركبات تشكل <1 في المائة من المنتج النهائي.
طور Moffit CTF فحصا للتدفق الخلوي يستخدم لمعايير الإطلاق لقياس النسبة المئوية لخلايا K562 المتبقية في DP النهائي. هذا المقايسة الخلوية التدفق يخفف من جميع القضايا من استخدام مستضدات سطح الخلية لتحديد خلايا K562. كما تنشيط الخلايا التائية يمكن التعبير عن CD71، وضعنا استراتيجية لاستبعاد جميع الخلايا التائية وخلايا NK عن طريق gating على CD3- CD56- و CD16- السكان ومن ثم فحص خلايا CD71+ ، والتي ستكون حصرا خلايا K562. هذا البروتوكول يدل على أن οδ T الخلية DP تسفر عن 0.48 ± 0.42٪ من الخلايا K562 المتبقية ويلبي جميع معايير الإفراج عن ≥70٪ الجدوى، سلبية الميكوبلازما من قبل PCR، لا الكائنات الحية التي ينظر إليها من قبل تلطيخ غرام، ≤2 الاتحاد الأوروبي / مل من endotoxin، وليس نهائي النمو (14 يوما) عقم ثقافة الدم.

الانتكاس سرطان الدم هو السبب الرئيسي للوفيات بعد زرع الخلايا الدموية (HCT) في المرضى الذين يعانون من AML1,2,3. تم الإبلاغ عن بقاء أفضل خالية من سرطان الدم مع زيادة انتعاش خلايا الدم T γδ بعد HCT دون زيادة خطر الكسب غير المشروع مقابل المرض المضيف (GVHD)4. قدرة الخلايا التائية γδ على التعرف على المستضدات بطريقة مستقلة MHC وتطوير وظائف قوية المتحللة الخلوية وTh1 مثل تأثير جعل هذا السكان الفرعية طفيفة من الخلايا التائية مثالية لعلاج المرضى الذين يخضعون لعملية زرع الخلايا الالوجينية في خطر الانتكاس5. وبالنظر إلى أن الخلايا التائية Vγ9Vδ2 هي مجموعة فرعية ثانوية من الخلايا الليمفاوية T تتراوح بين 0.5٪ إلى 5٪ من الخلايا التائية في المحيط6، شرعنا في إنشاء نظام قوي لتوسيع هذه المجموعة النادرة من خلايا الدم لتحقيق جرعات علاجية محتملة للتجارب السريرية.
على الرغم من أن البعض الآخر قد توسعت بنجاح γδ الخلايا التائية باستخدام حمض الزوليدروك وحتى aAPCs, لقد وضعنا عملية يمكن أن توسع يحتمل أن γδ الخلايا التائية من قبل 229,749 أضعاف. التوسع ثنائي الطور: أولا ، يتم الحصول على الخلايا الليمفاوية عن طريق التملص باستخدام أداة الفصل. توفر المعدات نظاما مغلقا يسمح بفصل الخلايا استنادا إلى حجمها وشكلها وكثافتها عن طريق الطرد المركزي للتدفق المضاد. بعد إثراء للخلايا الليمفاوية، يتم تحقيق التوسع الانتقائي للخلايا T Vγ9Vδ2 عن طريق العلاج مع حمض الزوليدرونيك وIL-2 لمدة 7 أيام. بعد هذا العلاج مباشرة، يتم استنفاد الخلايا TCR-αβ باستخدام تكنولوجيا الميكروبات، مما يسمح للتوسع اللاحق للخلايا T γδ مع AAPCs المشتقة من K562.
للتحقق من صحة العملية، تم استخدام 5 × 106 خلايا تي موسعة حمض الزوليدرونيك فقط لتوسيع المرحلة-2 الثقافة المشتركة مع aAPCs. في هذه المرحلة الثانية من التوسع، يتم تنشيط الخلايا التائية باستخدام بنك خلايا العمل المتوافق مع ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (cGMP) (WCB) من AAPCs المشتقة من K562 المعدلة وراثيا (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL; scFv-CD28-IL15-RA)) المصنعة في موفيت. ويستند الأساس المنطقي لهذا التوسع ثنائي الطور على قدرة حمض الزوليدرونيك على تثبيط فارنيسيل ثنائي فوسفات synthase (FDPS) في الخلايا الأحادية، مما يؤدي إلى تراكم الفوسفات البروفاسي الإيزوبينيل، الذي يحفز مباشرة خلايا Vγ2Vδ2. في المرحلة الثانية من التوسع، توفر المركبات المشتقة من K562 (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) تحفيزا قويا لجميع الخلايا التائية. ومع ذلك، تم بالفعل إثراء منتج الخلية للخلايا التائية γδ، مما أدى إلى توسع قوي في الخلايا التائية γδ.
مع استخدام معدات وقوارير محددة ، فإن العملية هي نظام مغلق وظيفيا ، وبالتالي تقليل خطر التلوث. بالإضافة إلى ذلك، يسهل المفاعل الحيوي المغلق 1 لتر النمو الأقصى وتوسيع الخلايا في حجم إجمالي قدره 1 لتر من المتوسط مع الحد الأدنى من الحاجة للتغذية. ميزة طريقة موفيت هو أنه يوفر نظام خلية T سريعة وقابلة للاستنساخ وقابلة للاستنساخ وممكنة للغاية لإنتاج نقية للغاية، مشتقة من المانح γδ منتج الخلية التائية للإدارة allogeneic. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي تجربة سريرية تهدف إلى استخدام الخلايا التائية البشرية التي تعبر عن مستقبلات الخلايا T Vγ2Vδ2 كتناعي بالتبني للتوسط في المناعة ضد الميكروبات والأورام في مرضى السرطان الذين يعانون من مغفرة جزئية وكاملة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر منصة قوية لتطوير وإنتاج γδ مستقبلات مستضد الشيمي إيجابية (CAR +) الخلايا التائية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>285-GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin 25%</td>
			<td>Grifolis</td>
			<td>65483-16-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalyte A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>2B2543Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoledronic Acid (Zometa)</td>
			<td>Hos pira</td>
			<td>4215-04--8</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS10</td>
			<td>BIOLIFE SOLUTIONS</td>
			<td>210374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL syringe</td>
			<td>JMS</td>
			<td>992861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18g Needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials 1.8 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367610Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 mL Transfer Pack</td>
			<td>TERUMO BCT INC</td>
			<td>1BBT060CB71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Plasma Transfer Set</td>
			<td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td>
			<td>03-220-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra Tubing Set</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>70800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 MCS GREX</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td>81100-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acacia Pump boot</td>
			<td>MPS Medical In</td>
			<td>17789HP3MLL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-070-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dornase Alpha</td>
			<td>Genentech, Inc</td>
			<td>50242-100-40/186-0055</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL 0.22 um Filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>157-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Filter 170um</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>V2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACs Tubing set</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-090-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS TCR&#945;/&#946; Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-021-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-Type blood set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>FWL4C2498H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 mL Flask</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>65483-116-071</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM-V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0870112BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Gemini Bio-Product</td>
			<td>100H41T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Liter Transfer pack</td>
			<td>Independent Medical Associates</td>
			<td>T3109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000&#160; pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5991040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF-250</td>
			<td>KOLBio</td>
			<td>CF-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra</td>
			<td>TERUMOBCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Vios CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product

على الرغم من أن Vγ9Vδ2 T الخلايا هي مجموعة فرعية ثانوية من الخلايا الليمفاوية T, وسعى بعد هذه المجموعة لقدرتها على التعرف على المستضدات في مجمع التوافق النسيجي الرئيسية (MHC) بطريقة مستقلة وتطوير وظيفة قوية التأثير الخلوي الذي يجعلها مرشحا مثاليا للعلاج المناعي للسرطان. نظرا لانخفاض وتيرة غاما دلتا (γδ) الخلايا التائية في الدم المحيطي، وضعنا بروتوكول فعال لتوسيع كبير في نقية للغاية γδ الخلايا التائية المنتج المخدرات للاستخدام الأول في الإنسان من الخلايا التائية الالوجينية في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم النخاعي الحاد (AML). باستخدام التخسيس المانح السليم كمصدر للخلايا المسببة للسرطان ، يتم عزل الخلايا الليمفاوية باستخدام جهاز تم التحقق من صحته لطريقة الطرد المركزي للتدفق المضاد لفصل الخلايا حسب الحجم والكثافة. 
يستخدم الكسر الغني بالخلايا اللمفاوية ، ويتم تنشيط الخلايا التائية بشكل تفضيلي مع حمض الزوليدرونيك (وافقت عليه FDA) وinterleukin (IL) - 2 لمدة 7 أيام. بعد التوسع التفضيلي للخلايا التائية γδ، يتم استخدام جهاز فصل الخلايا المغناطيسية من الدرجة السريرية والخرز TCRαβ لاستنفاد مستقبلات الخلايا التائية الملوثة (TCR)αβ T cells. ثم تخضع الخلايا التائية عالية الإثراء لتوسع ثان باستخدام خلايا عرض مستضد اصطناعية هندسية (aAPCs) مشتقة من خلايا K562 المعدلة وراثيا للتعبير عن جزء متغير أحادي السلسلة (scFv) ل CD3 و CD28 و 41BBL (CD137L) و IL15-RA جنبا إلى جنب مع حمض الزولدروك وIL-2. البذر كل يوم-7 المخصب γδ الخلايا التائية في الثقافة المشتركة مع aAPCs يسهل تصنيع الخلايا التائية نقية للغاية مع متوسط توسيع أضعاف >229,000 أضعاف من الدم المتبرع صحية.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

المقدمة هو بروتوكول لتوسيع غاما دلتا (γδ) تي منتج المخدرات الخلية. يتم عزل الخلايا الليمفاوية عن طريق التملؤ وتخصيب γδ مع حمض الزوليدرونيك وبينلوكين-2. يتم استنفاد خلايا ألفا بيتا تي باستخدام جهاز فصل مغناطيسي من الدرجة السريرية. يتم استزراع الخلايا مع خلايا تقديم مستضد اصطناعية مشتقة من K562 وتوسيعها.

توسيع وإثراء الخلايا التائية من منتج بشري غير مشفر

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

تتمتع خلايا جاما دلتا تي بنشاط سام للخلايا قوي ضد العديد من أنواع السرطان، بما في ذلك سرطان الدم النخاعي الحاد. ومع ذلك ، فإن تعميم خلايا غاما دلتا تي في الدم نادر نسبيا ، خاصة في المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة. ضخ المتبرع المستمدة، X-vivo توسيع غاما دلتا الخلايا التائية، لديها وعد في الحد من تكرار سرطان الدم، وتحسين بقاء المرضى الذين يعانون من سرطان الدم النخاعي الحاد.الأسلوب المقترح يحقق أكبر من 200، 000 أضعاف غاما دلتا تي توسيع الخلية، والوصول إلى جرعات ذات الصلة علاجيا من منتج خلية غاما دلتا تي نقية للغاية، في ثلاث خطوات سهلة. ربط ذلك IEL للتوسع، ألفا بيتا استنفاد الخلية T عن طريق الفرز المغناطيسي والتوسع الثانوي مكافأة مع AAPCs. وتوسع الطريقة المقترحة فائدة خلايا غاما دلتا تي لأمراض مثل السرطان وأمراض المناعة الذاتية من خلال إنشاء عدد كبير من الخلايا التي يمكن استخدامها على الرف بسرعة.ويمكن تكييف هذه العملية لتوسيع خلايا غاما دلتا باستخدام أساليب تخصيب مختلفة وإضافة عمليات معالجة إضافية مثل النقل. إثبات الإجراء سيتم في لوس انجليس ، وهو تقني العلاج بالخلايا ، وثلاثة من مختبري. تبدأ عن طريق التملص من عينة المنتج الفوارة، على جهاز الطرد المركزي التدفق المضاد، وذلك باستخدام وسيلة أساسية من محلول الملح المتوازن هانكس، مع 1٪ ألبومين مصل الإنسان والمتوسطة الثانوية للمحلول المالح أو DPBS.مع سرعة الطرد المركزي elutriation في 900 مرة G، وجمع الكسور على أساس معدل التدفق والوقت. جمع العينات من الكسر الثاني لإجراء اختبار العقم، وعدد الخلايا وphenotyping الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي. من الكسر الثاني، قم بتوسيع جزء من الخلايا اللمفاوية النقية في الثقافة بمعدل 10 مرات إلى 10 إلى الخلايا السادسة لكل سنتيمتر مربع، مع خمسة ميكرومولات لكل لتر من حمض الزوليدرونيك و300 وحدة لكل ملليلتر من إنترلوكين-2 في مفاعل حيوي مغلق للتر الواحد.احتضان النظام لمدة سبعة أيام عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة، حصاد الخلايا من قارورة مفاعل حيوي النظام مغلقة لتر واحد. للقيام بذلك، لحام عقيمة حزمة نقل لتر واحد إلى الخط الأحمر من المفاعل الحيوي، واستخدام مضخة الصيدلانية المناسبة لنقل الخلايا إلى حزمة نقل.خذ العينات لاختبار العقم المتوسط المستهلك وعدد الخلايا وفينوتيبينج الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي. من العينة المتبقية، إعادة تعليق الخلايا في خمس مرات 10 إلى الخلايا الثامنة لكل ملليلتر، في مخزن مؤقت PBS-EDTA تحتوي على 0.5٪ HSA ومستقبلات الخلايا التائية البيوتينية، ألفا بيتا الأجسام المضادة محددة. واحتضان الخلايا في درجتين إلى ثماني درجات مئوية مع اهتزاز.بعد 15 دقيقة، اغسل الخلايا ب 600 ملليلتر من مخزن PBS-EDTA المؤقت الذي يحتوي على 0.5 HSA والطرد المركزي بمعدل 200 إلى 500 مرة G لمدة 15 دقيقة، عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية، لإزالة الجسم المضاد غير المنضم. ثم، إعادة تعليق الخلايا في ما يقرب من خمس مرات 10 إلى الخلايا الثامنة لكل ملليلتر، في مخزن مؤقت PBS-EDTA تحتوي على 0.5٪ HSA و 7.5 ملليلتر لكل قارورة من الميكروبات المضادة للبيوتين محددة. كما هو موضح سابقا، احتضان الخلايا مع اهتزاز، قبل الطرد المركزي تعليق الخلية لإزالة الميكروبات غير المقيدة.إعادة تعليق ست مرات 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر في المخزن المؤقت PBS-EDTA مع 0.5٪ HSA. جمعها في حقيبة نقل حزمة. سبايك عندما تعليمات من قبل الصك.بعد ذلك، قم بتركيب مجموعة أنابيب في جهاز فصل الخلايا المغناطيسية السريري. ضع الحزم مع المخزن المؤقت PBS-EDTA وحزمة النقل مع منتج الخلية في الأداة. لاستنفاد خلايا ألفا بيتا T المسماة، حدد بروتوكول استنفاد 1.2 في البرنامج.ثم، طرد مركزي منتج الخلية لجمع الكسر الهدف المخصب مع الخلايا التائية غاما دلتا. إعادة تعليق الخلايا التي تم جمعها في المتوسط، وتستكمل مع 10٪ مصل AB الإنسان. إجراء صلاحية عدد الخلايا وتدفق قياس الخلايا phenotyping استنفاد آخر.جلب الخلايا إلى تركيز النهائي من حوالي مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر. تشعيع خمس مرات 10 إلى السابعة الاصطناعية المضادة لتقديم الخلايا أو AAPCs لكل قارورة، في 100 رمادي على أداة توليد الأشعة السينية. إعداد ثقافة مشتركة، عن طريق وضع الخلايا المشععة AAPCs و جاما دلتا T في نسبة 10 هو واحد، في قارورة مفاعل حيوي نظام مغلق لتر واحد.مع لتر واحد من الثقافة المتوسطة، تكملها 10٪ مصل AB الإنسان، البذور تصل إلى 10 قوارير. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 أيام، مع فحص مستويات الجلوكوز واللاكتات كل ثلاثة إلى أربعة أيام باستخدام شرائح والجلوكوز ومتر اللاكتات. إذا انخفض مستوى الجلوكوز إلى 215 ملليغرام لكل ديسيلتر، خفض حجم في القارورة إلى 200 ملليلتر.اخلط الخلايا في ال 200 ملليلتر المتبقية من الوسائط، وأزل عينة 0.5 ملليلتر لحساب الخلايا وقياس قابليتها للحياة عن طريق تلطيخ البرتقال أو يوديد البروبيديوم. إذا كان عدد الخلايا يساوي، أو أكثر من 10 إلى التاسع، تقسيم محتويات قارورة واحدة إلى قسمين وملء كل قارورة تصل إلى لتر واحد مع متوسط AIM-V، تكملها 10٪ مصل AB الإنسان. إذا كان عدد الخلايا أقل من 10 إلى التاسع، وإطعام الخلايا مع لتر واحد جديد من المتوسطة الثقافة، وتستكمل مع مصل AB الإنسان 10٪، والعودة قوارير إلى الحاضنة.في نهاية 10 أيام في الثقافة المشتركة، حصاد قوارير المفاعل الحيوي واحد في وقت واحد، وسحب جميع الخلايا في حزمة نقل من الحجم المناسب. بعد إزالة عينات مراقبة الجودة، والطرد المركزي الخلايا في 200 إلى 500 مرة G لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والتخلص من supernatant. غسل الخلايا في حل من محلول كريستالويد متوازن, تستكمل مع 0.5٪ HSA في 200 إلى 500 مرات G لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.إعادة تعليقها في حجم مستهدف من 100 إلى 300 ملليلتر من محلول كريستالويد متوازن مع 0.5٪ HSA. الخلايا المنفصلة عن كسر الطرد المركزي بعد التدفق المضاد. اثنين أسفرت عن السكان الخلايا الليمفاوية نقية، مع متوسط ممتاز البقاء من 95.80٪ الخلايا التائية غاما دلتا توسع محدد، مع حمض الزوليدرونيك تعتمد على النسبة المئوية الأولية للخلايا القاتلة الطبيعية الموجودة في كسر الخلايا الليمفاوية بعد التملذ.وكان إثراء مادة غاما دلتا تي الخلية المخدرات، مع مستقبلات الخلايا التائية ألفا بيتا استنفاد متسقة. المنتج المخدرات غاما دلتا تي الخلية المصنعة من ثلاثة متبرعين أصحاء, اجتمع معيار الإفراج عن أقل من 1٪ من مستقبلات الخلايا التائية ألفا بيتا الخلايا التائية الإيجابية, مع متوسط 0.11٪ CD20 الخلايا B إيجابية, و 0.00٪ مستقبلات الخلايا التائية ألفا بيتا إيجابية الخلايا التائية. وكان متوسط النسبة المئوية للخلايا القاتلة الطبيعية في المنتج النهائي حوالي 17.06٪ التي تلبي معيار الإفراج عن أقل من 35٪ تلطيخ سطح الخلية وتحليل تدفق الخلايا، واستخدمت لتوصيف الهوية والنقاء وعملية الشوائب من مادة المخدرات ومنتج المخدرات.أما إعادة التوسع الثانية التي تحققت من الثقافة المشتركة لمادة المخدرات المضادة للخلايا التائية AAPC وTasta-Delta، فقد ولدت منتجا من أدوية الخلايا التائية غاما - دلتا يستوفي جميع معايير الإطلاق. الباثونات التي تثري سكان الخلايا التائية تؤثر على توسع وخصائص المنتج. ويلزم النظر في أساليب الإثراء والتحقيق فيها على قدم افية قبل بدء عملية التخصيب.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

الخلية الهدف الجينوم قبل التخصيب وكله التضخيم لتوصيف المصب خلية مفردة

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

عزل الخلايا البطانية البشرية من القولون العادي وسرطان القولون والمستقيم-وضع بروتوكول تحسين

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

المستندة إلى علم التشكل التمييز بين صحية ومرضية الخلايا استخدام فورييه التحويلات وخرائط التنظيم الذاتي

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

استخراج الأيض المائي من خلايا ملتصقة مثقفه للتحليل الأيضي بواسطة الكهربائي الكهربي-الطيف الكتلي

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث لتوليد خلايا T الأورام مستضد محدده

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

عزل وتوسيع الخلايا التائية القاتلة التي يسببها الخلايا السامة للخلايا السامة لعلاج السرطان

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

عزل خلايا الدم الطرفية البشرية أحادية النواة والخلايا التائية CD4+ من مرضى متلازمة سيزاري للتنميط النسخي

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

العزل والتقييم الوظيفي للخلايا الجذعية لسرطان الثدي البشري من عينات الخلايا والأنسجة

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

توليد وتوسيع خطوط ورم المتوسطة الجنبي الأولي الخبيث

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

الكشف في الوقت الحقيقي والتقاط المجموعات الفرعية للخلايا الغازية من الثقافات المشتركة

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...