Name: expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00
Duration: 11 min 51 s
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我们感谢莫菲特癌症中心的细胞免疫疗法 - 研究者发起的试验奖壁内资助机会，为该方案的开发提供资金。我们也感谢克劳迪奥·阿纳塞蒂博士通过这个项目提供的宝贵帮助和指导。最后，我们感谢 Justin Boucher 博士对手稿的见解和审阅。

注：已获得IRB批准，并已获得捐赠者的知情同意。
1. 淋巴细胞分离
<ol><li>将血液分离产物转移到洁净室。 注意：过程验证是使用来自外部商业供应商的正常供体血液分离术进行的，符合原始细胞材料收集法规。</li>
	<li>收集样本进行无菌测试，细胞计数和细胞表型分析。</li>
	<li>使用汉克斯平衡盐溶液的主要培养基，加上1%的人血清白蛋白（HSA）和盐水溶液（0.9%氯化钠注射液USP）或Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）的二级培养基，在逆流离心装置上洗脱。将洗脱离心速度设置为900× g ，并根据流速和时间收集馏分。</li>
	<li>从馏分2中收集样本并进行以下测试：2 mL用于无菌测试;0.5 mL用于细胞计数和活力，使用吖啶橙/碘化丙啶（AO / PI）;5 ×106 个细胞，通过流式细胞术进行细胞表型分析。</li>
	<li>在1L封闭系统生物反应器中以10×106 个细胞/ cm 2扩增培养细胞的纯淋巴细胞部分（部分2 ），其中含有5μmol/ L唑来膦酸和300IU / mL IL-2。</li>
	<li>在37°C的培养箱中孵育7天，其中CO 2含量为5%。</li>
</ol>2. α-β（αβ）T细胞耗竭
<ol><li>从1L封闭系统生物反应器烧瓶中收获细胞。将1 L转印包无菌焊接到封闭系统生物反应器的红线上，并使用适当的药物泵将细胞转移到转印包中。</li>
	<li>取以下样品：10毫升用于用过的中等无菌;0.5 mL细胞，用于使用AO / PI进行细胞计数和活力;5 × 106 个细胞用于流式细胞术</li>
	<li>将细胞重悬于~5×108 个细胞/mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）或（PBS/乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液+ 0.5%HSA和生物素化的TCR αβ特异性抗体中。</li>
	<li>将振荡器置于冰箱中，并在2-8°C下振荡将细胞孵育约15分钟。</li>
	<li>用总共600 mL PBS / EDTA缓冲液+ 0.5%HSA洗涤细胞。在2-8°C下离心以200-500× g 离心除去未结合的抗体15分钟。 将约 5 × 108 个细胞/mL 重悬于 PBS/EDTA 缓冲液 + 0.5% HSA 和抗生物素特异性微珠（7.5 mL/1 小瓶）中。</li>
	<li>将振荡器置于冰箱中，并在2-8°C下振荡将细胞孵育约15分钟。孵育后，在2-8°C下以200-500× g 离心细胞15分钟以除去未结合的微珠。将约 6 × 107 个细胞/mL 重悬于 PBS/EDTA 缓冲液 + 0.5% HSA 中，并将其转移到转运包装袋中。</li>
	<li>按照制造商的说明将管组安装在临床级磁细胞分离装置中，将装有PBS / EDTA缓冲液的包装和带有细胞产物的转移包放入仪器中，并在仪器指示时将其刺入。</li>
	<li>选择 耗尽1.2 方案用于标记的αβ T细胞的耗尽。</li>
	<li>离心目标组分（富集的γδ T细胞）并将细胞重悬于补充有10%人AB血清的培养基中。</li>
	<li>取0.5 mL样品，并用AO / PI染色剂进行细胞计数和活力。使细胞达到约1×106 个细胞/ mL的最终浓度。取5×106 个细胞的样本进行流式细胞术表型分析，</li>
</ol>3. 与aPAC共培养
<ol><li>在X射线发生仪器上以100 Gy照射5×107 aAPCs/烧瓶。</li>
	<li>在与γδ T细胞以10：1的比例共培养时使用aAPCs。将辐照的aACPC（5×107 个细胞/烧瓶）和γδ T细胞（5×106 个细胞/烧瓶）置于1L封闭式系统生物反应器烧瓶中，其中1L培养基补充10%人AB血清。播种至 10 个烧瓶。</li>
	<li>在37°C和5%CO 2的培养箱中扩增细胞在培养物中培养10天。</li>
	<li>每 3-4 天使用试纸、葡萄糖和乳酸仪监测葡萄糖和乳酸水平。</li>
	<li>如果葡萄糖降至250 mg / dL，则使用制药泵将烧瓶中的体积减小至200 mL，方法是将1 L转印包无菌焊接到封闭系统生物反应器的红线上。</li>
	<li>将细胞混合在剩余的200 mL中，并取0.5 mL样品通过AO-PI染色进行细胞计数和活力测量。如果细胞计数≥109，将一个烧瓶分成两个烧瓶，并用补充10%人AB血清的AIM-V填充每个烧瓶，最大1L。如果细胞计数<109，则用补充有10%人AB血清的新鲜培养基喂养细胞。</li>
	<li>对所有烧瓶重复步骤3.6，并在37°C和5%CO 2下将其返回培养箱。每 3 到 4 天重复一次步骤 3.4-3.7。</li>
</ol>4. 细胞采集
<ol><li>在共培养10天结束时，收获所有生物反应器烧瓶。一次收获1个生物反应器烧瓶，并将所有细胞汇集到适当大小的转移包中。将转印包无菌焊接到封闭系统生物反应器的红线上，并使用制药泵将细胞转移到转印包中。</li>
	<li>除去以下质控样品：1%的药物产品（DP）通过血培养和革兰氏染色进行无菌;0.5 mL用于使用AO / PI进行细胞计数和活力;5-10×106 个细胞用于流式细胞术（见 图1 门控策略）;0.5毫升内毒素;0.5 mL 用于革兰氏染色;将106 个细胞加入10 mL用过的培养基中进行支原体检测。</li>
	<li>在室温下以200-500× g 离心细胞15分钟并弃去上清液。</li>
	<li>在室温下以200-500× g 在平衡晶体溶液+ 0.5%HSA的溶液中洗涤细胞15分钟。将它们重悬于目标体积为100-300 mL的平衡晶体溶液+ 0.5%HSA中。</li>
</ol>5. 发布测试
<ol><li>对γδ T细胞DP进行质量控制测试，用于以下方面：流式细胞术的纯度和身份（活/死，CD45，CD3，TCR αβ，TCR γδ，CD20，CD56，CD16）;通过AO / PI染色的活力;内毒素;通过聚合酶链反应（PCR）进行支原体检测;革兰氏染色和需氧和厌氧血培养的无菌;通过流式细胞术（CD3-CD16-CD56-CD71+）测定残留的K562。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation:+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study.">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation.">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li><li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment,+risk+factors,+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li><li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph++leukemia+model.">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).</li><li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;&#948;+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-&#945;&#946;+/CD19++lymphocytes.">&#947;&#948; T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-&#945;&#946;+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li><li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+T+cell+receptor:+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors.">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells.">Large-scale expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li><li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+for+immunotherapy.">In vitro expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+V&#947;9V&#948;2+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer.">Allogeneic V&#947;9V&#948;2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li></ol>

作者没有利益冲突需要披露。

Moffit细胞治疗实验室开发了一种方案，具有高纯度γδ T细胞的双相扩增，用于临床试验中的DP。该协议在封闭系统中提供了一种在cGMP指南下的制造方法，该封闭系统产生高纯度的γδ T细胞DP，该DP被唑来膦酸和WCB aAPCs成功激活和扩增。该协议已被FDA批准用于制造AML患者的同种异体γδ T细胞DP。使用健康供体，我们在短短7天内成功地将供体γδ T细胞的小群体从2.06±0.45%扩大到54.45±28.34%。在用唑来膦酸扩增7天后，观察到供体2在NK人群中增加。
唑来膦酸抑制单核细胞中的法呢基二磷酸合酶（FDPS），这反过来又导致焦磷酸异戊烯酯（IPP）的积累，这与T细胞和天然NK细胞增殖的显着增加相关7，8，9。这种增加的NK群体阻碍了aAPCs的第二 阶段扩增，因为aAPCs只会有助于NK细胞的进一步扩增。因此，修改了捐助方标准，以排除纳戈尔诺-卡拉巴赫人口较多的献血者。αβ T细胞耗尽后，γδ T细胞进一步富集至76.61±27.51%。这种独特的方案包括利用Moffit制造的aACCs的第二次扩增，以靶向γδ T细胞中的CD8，CD28和CD127L受体。使用aAC的第二个扩增阶段产生了DP，CD3 + TCR γδ + T细胞的dp为≥65%，≤1%TCRαβ T和<35%CD3-CD16 + CD56 + NK细胞。由于使用了K562衍生的aPC，因此有必要证明这些aPC占最终产品的<1%。
Moffit CTF开发了一种用于释放标准的流式细胞术测定法，以测量最终DP中残留的K562细胞的百分比。这种流式细胞术测定减轻了利用细胞表面抗原鉴定K562细胞的所有问题。由于活化的T细胞可以表达CD71，我们设计了一种策略，通过对CD3-CD56-和CD16-群体进行门控，然后检查CD71 +细胞，这些细胞将完全是K562细胞，从而排除所有T细胞和NK细胞。该方案表明，γδ T细胞DP产生0.48±0.42%的残留K562细胞，并且符合≥70%活力，PCR支原体阴性，革兰氏染色未见的微生物，≤2 EU / mL内毒素以及无生长最终（14天）血培养无菌的所有释放标准。

白血病复发是AML患者造血细胞移植（HCT）后死亡的主要原因1，2，3。据报道，HCT后血液γδ T细胞的恢复增加，无白血病生存率更高，而移植物抗宿主病（GVHD）的风险增加4。γδ T 细胞能够以独立于 MHC 的方式识别抗原并产生强大的细胞溶解和 Th1 样效应器功能，这使得这种较小的 T 细胞亚群非常适合治疗接受异体移植且有复发风险的 AML 患者5。鉴于Vγ9Vδ2 T细胞是T淋巴细胞的一个小亚群，范围从外围T细胞的0.5%到5%6，我们开始建立一个强大的系统来扩大这种罕见的血细胞群，以达到临床试验的潜在治疗剂量。
尽管其他人已经使用唑来膦酸甚至aAC成功扩增了γδ T细胞，但我们已经开发出一种可能将γδ T细胞扩增229，749倍的工艺。扩增是双相的：首先，淋巴细胞通过使用分离仪器洗脱获得。该设备提供了一个封闭的系统，允许通过逆流离心根据其大小，形状和密度分离细胞。富集淋巴细胞后，用唑来膦酸和IL-2处理7天，实现Vγ9Vδ2 T细胞的选择性扩增。在这种处理之后，立即使用微珠技术耗尽TCR-αβ T细胞，从而允许随后用K562衍生的aACPC扩增γδ T细胞。
对于工艺验证，仅使用5×106 个唑来膦酸扩增γδ T细胞用于与aAPCs的2期共培养扩增。在第二阶段的扩增中，使用在莫菲特制造的基因工程K562衍生aAPCs（K562VL6（scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA）的当前良好生产规范（cGMP）兼容的工作细胞库（WCB）激活γδ T细胞。这种双相扩增的基本原理是基于唑来膦酸抑制单核细胞中法呢基二磷酸合酶（FDPS）的能力，导致焦磷酸异戊烯酯的积累，其直接刺激Vγ2Vδ2细胞。在扩增的第二阶段，K562衍生的aACPC（K562VL6（scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA））为所有T细胞提供强大的刺激。然而，细胞产物已经为γδ T细胞富集，导致γδ T细胞的稳健扩增。
通过使用特定的设备和烧瓶，该过程是一个功能封闭的系统，从而降低了污染的风险。此外，1 L封闭式系统生物反应器有助于在总体积为1 L的培养基中最大限度地生长和扩增细胞，并且只需要最少的喂养。Moffitt方法的优点是它提供了一种快速，可重复且高度可行的GMP系统，以产生用于异体给药的高纯度供体衍生的γδ T细胞产物。该方法可应用于任何旨在使用表达Vγ2Vδ2 T细胞受体的人γδ T细胞作为过继免疫疗法以介导部分和完全缓解的癌症患者对微生物和肿瘤的免疫的任何临床试验。此外，它还为γδ嵌合抗原受体阳性（CAR +）T细胞的开发和生产提供了一个强大的平台。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>285-GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin 25%</td>
			<td>Grifolis</td>
			<td>65483-16-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalyte A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>2B2543Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoledronic Acid (Zometa)</td>
			<td>Hos pira</td>
			<td>4215-04--8</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS10</td>
			<td>BIOLIFE SOLUTIONS</td>
			<td>210374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL syringe</td>
			<td>JMS</td>
			<td>992861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18g Needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials 1.8 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367610Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 mL Transfer Pack</td>
			<td>TERUMO BCT INC</td>
			<td>1BBT060CB71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Plasma Transfer Set</td>
			<td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td>
			<td>03-220-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra Tubing Set</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>70800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 MCS GREX</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td>81100-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acacia Pump boot</td>
			<td>MPS Medical In</td>
			<td>17789HP3MLL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-070-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dornase Alpha</td>
			<td>Genentech, Inc</td>
			<td>50242-100-40/186-0055</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL 0.22 um Filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>157-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Filter 170um</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>V2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACs Tubing set</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-090-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS TCR&#945;/&#946; Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-021-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-Type blood set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>FWL4C2498H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 mL Flask</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>65483-116-071</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM-V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0870112BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Gemini Bio-Product</td>
			<td>100H41T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Liter Transfer pack</td>
			<td>Independent Medical Associates</td>
			<td>T3109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000&#160; pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5991040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF-250</td>
			<td>KOLBio</td>
			<td>CF-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra</td>
			<td>TERUMOBCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Vios CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product

虽然Vγ9Vδ2 T细胞是T淋巴细胞的一个次要亚群，但该群体因其以主要组织相容性复合物（MHC）独立的方式识别抗原的能力而备受追捧，并发展出强大的细胞溶解效应功能，使其成为癌症免疫治疗的理想候选者。由于外周血中γ-Delta（γδ）T细胞的低频率，我们开发了一种有效的方案，以大大扩增高纯度的γδ T细胞药物产物，用于急性髓系白血病（AML）患者中首次使用同种异体γδ T细胞。使用健康的供体血液分离作为同种异体细胞来源，使用经过验证的设备分离淋巴细胞，用于逆流离心方法，按大小和密度分离细胞。 
利用富含淋巴细胞的部分，并优先用唑来膦酸（FDA批准）和白细胞介素（IL）-2激活γδT细胞7天。在γδ T细胞优先扩增之后，使用临床级磁细胞分离装置和TCRαβ微球来消耗污染的T细胞受体（TCR）αβ T细胞。然后，高度富集的γδ T细胞使用来自K562细胞的工程化人工抗原呈递细胞（aAPCs）进行第二次扩增 - 经过基因工程改造以表达CD3和CD28，41BBL（CD137L）和IL15-RA的单链可变片段（scFv）以及唑来膦酸和IL-2。在与aAPCs共培养物中接种所有日7高浓度的γδ T细胞有助于制造高纯度γδ T细胞，平均折叠扩增>229，000倍的健康供体血液。

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Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

提出的是用于扩增γ-Δ（γδ）T细胞药物产物的方案。淋巴细胞通过洗脱分离，并富含唑来膦酸和白细胞介素-2的γδ。使用临床级磁分离装置消耗α-β-T细胞。γδ细胞与K562衍生的人工抗原呈递细胞共培养并扩增。

来自分离人产品的γ-Delta（γδ）T细胞的扩增和富集

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

γ-Delta T细胞对许多癌症类型（包括急性髓系白血病）具有强大的细胞毒性活性。然而，血液中循环的γ-Δ T细胞相对罕见，特别是在恶性肿瘤患者中。输注供体来源的X-vivo扩增的γ-δ T细胞，有望减少白血病的复发，并提高急性髓系白血病患者的生存率。所提出的方法在三个简单的步骤中实现了大于200， 000倍的γ-Δ细胞扩增，达到治疗相关剂量的高纯度γ-δ细胞产物。因此，连接IEL以扩增，通过磁选和AAPCs的赏金二次扩增来消耗αβ-T细胞。所提出的方法通过快速创建大量可以现成使用的细胞，扩展了γ-Delta T细胞对癌症和自身免疫性疾病等疾病的效用。该过程可以适应使用不同的富集方法扩增γ-Delta细胞，并添加其他操作，如转导。演示该程序将在洛杉矶进行，他是一位细胞治疗技术专家，来自我的实验室的三位。首先在逆流离心装置上使用Hanks平衡盐溶液的主要培养基，将泡腾产物样品洗脱，其中含有1%的人血清白蛋白和盐水溶液或DPBS的二级培养基。洗脱离心速度为900倍G，根据流速和时间收集馏分。从馏分二中收集样品，通过流式细胞术进行无菌测试，细胞计数和细胞表型分析。从第二部分开始，以10倍10的比例扩增培养物中细胞的纯淋巴细胞部分至每平方的第六个细胞，每升唑来膦酸5微摩尔，在一升封闭系统生物反应器中每毫升白细胞介素-2300单位。将系统在37摄氏度下孵育七天，其中二氧化碳含量为5%。孵育后，从一升封闭系统生物反应器烧瓶中收获细胞。为此，将一升转印包无菌焊接到生物反应器的红线上，并使用适当的药物泵将细胞转移到转印包中。取样通过流式细胞术测试用过的培养基无菌性，细胞计数和细胞表型。从剩余的样品中，将细胞以每毫升10至8个细胞的五倍重新悬浮在含有0.5%HSA和生物素化T细胞受体，αβ特异性抗体的PBS-EDTA缓冲液中。并在2至8摄氏度下振荡孵育细胞。15分钟后，用含有0.5 HSA的600毫升PBS-EDTA缓冲液洗涤细胞，并以200至500倍G离心15分钟，在2至8摄氏度下，以除去未结合的抗体。然后，将细胞以每毫升约5倍10至8个细胞重新悬浮在含有0.5%HSA和每瓶抗生物素特异性微珠7.5毫升的PBS-EDTA缓冲液中。如前所述，在离心细胞悬浮液以除去未结合的微珠之前，用振荡孵育细胞。在PBS-EDTA缓冲液中以0.5%HSA重新悬浮每毫升10至7个细胞六次。将它们收集到转运包袋中。在仪器的指示下将其刺入。接下来，在临床级磁细胞分离装置中安装导管组。将装有PBS-EDTA缓冲液的包以及带有细胞产物的转印包放入仪器中。对于标记的αβ-T细胞的耗尽，请在软件中选择耗尽1.2方案。然后，离心细胞产物以收集富含γ-Δ T细胞的目标级分。将收集的细胞重新悬浮在培养基中，补充10%人AB血清。在耗竭后进行细胞计数活力和流式细胞术表型分析。使细胞达到每毫升约10至第六个细胞的终浓度。在X射线生成仪器上，将每个烧瓶10至第七个人工抗原呈递细胞或AAPC照射5次，以100灰色照射。制备共培养物，通过将辐照的AAPC和γ-Δ T细胞以10比1的比例置于一升封闭系统生物反应器烧瓶中。用一升培养基，补充10%人AB血清，播种至10个烧瓶。将培养物在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育10天，每3至4天使用条带，葡萄糖和乳酸仪筛选葡萄糖和乳酸水平。如果葡萄糖水平降至每分升215毫克，则将烧瓶中的体积减少到200毫升。将细胞混合在剩余的200毫升培养基中，并取出0.5毫升样品，通过吖啶橙或碘化丙啶染色进行细胞计数和活力测量。如果细胞计数等于或超过10到第九个，则将一个烧瓶的内容物分成两个，并用AIM-V培养基填充每个烧瓶，最多一升，并补充10%人AB血清。如果细胞计数小于10至第九个，则用新鲜的1升培养基喂养细胞，补充10%人AB血清，并将烧瓶返回培养箱。在共培养10天结束时，一次收获一个生物反应器烧瓶，并将所有细胞拉入适当大小的转移包中。除去质控样品后，在室温下以200至500倍G离心细胞15分钟，并弃去上清液。在平衡晶体溶液中洗涤细胞，在室温下以200至500倍G补充0.5%HSA15分钟。将它们重新悬浮在目标体积为100至300毫升的平衡晶体溶液中，HSA为0.5%。将细胞从逆流后离心馏分中分离出来。两个产生了纯淋巴细胞群，具有95.80%的出色平均活力，γ-Delta T细胞特异性扩增，唑来膦酸取决于洗脱后淋巴细胞部分中存在的自然杀伤细胞的初始百分比。γ-δ T细胞药物物质的富集与T细胞受体α-β消耗是一致的。由三个健康供体生产的γ-Delta T细胞药物产品符合释放标准，即少于1%的T细胞受体αβ阳性T细胞，平均0.11%CD20阳性B细胞和0.00%T细胞受体αβ阳性T细胞。最终产品中自然杀伤细胞的平均百分比约为17.06%，符合小于35%的释放标准 细胞表面染色和流式细胞术分析，用于表征原料药和药物产品的身份，纯度和工艺杂质。通过AAPC和γ-Δ T细胞药物物质的共培养实现的第二次再扩增，产生了符合所有释放标准的γ-Δ-T细胞药物产物。富集T细胞群的病理会影响产物的扩增和特性。在开始浓缩方法之前，需要对浓缩方法进行充分的考虑和调查。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

单细胞下游特征的靶细胞预富集与全基因组扩增

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

科研

癌症研究

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

正常结肠和结直肠癌患者内皮细胞的分离--一种改进的协议

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

利用傅里叶变换和自组织映射的形态学区分健康和病理细胞

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

毛细管电泳质谱法提取培养细胞中的水代谢物进行代谢组学分析

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

利用人类诱导多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

细胞毒性细胞因子诱导的杀伤性T细胞的分离和扩张，用于癌症治疗

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

从Sézary综合征患者中分离人外周血单核细胞和CD4 + T细胞以进行转录组学分析

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

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从细胞和组织样本中分离和功能评估人类乳腺癌干细胞

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

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Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

实时检测和捕获共培养物中的侵袭细胞亚群

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...