Name: expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Vi takker Cellular Immunotherapies-Investigator Initiated Trials Award Intramural Funding Opportunity fra Moffitt Cancer Center for at yde finansiering til denne protokol udvikling. Vi takker også Dr. Claudio Anasetti for hans uvurderlige hjælp og vejledning gennem dette projekt. Endelig takker vi Dr. Justin Boucher for hans indsigt og gennemgang af manuskriptet.

BEMÆRK: IRB-godkendelse blev indhentet, og der blev indhentet informeret samtykke fra donorerne.
1. Lymfocyt isolation
<ol><li>Overfør afereseproduktet til et rent rum. BEMÆRK: Procesvalidering blev udført ved hjælp af normal donoraferese fra en ekstern kommerciel leverandør, der er i overensstemmelse med reglerne for indsamling af råvarer til cellulær materiale.</li>
	<li>Indsamle prøver til sterilitet test, celletal, og celle phenotyping.</li>
	<li>Elutriate på kontraflow centrifugering enhed ved hjælp af et primært medium af Hanks Balanced Salt Solution med 1% human serum albumin (HSA) og et sekundært medium af saltvandsopløsning (0,9% natriumchlorid Injection USP) eller Dulbecco's Fosfat-Buffered Saline (DPBS). Indstil elutriation centrifugering hastighed på 900 × g og indsamle fraktioner baseret på flowhastighed og tid.</li>
	<li>Prøver udtages prøver fra fraktion 2 og udfører følgende prøver: 2 mL til sterilitetstest; 0,5 mL for celleantal og levedygtighed ved hjælp af acridin orange/propidium jod (AO/PI); 5 × 106 celler til celle phenotyping ved flow cytometri.</li>
	<li>Udvid en ren lymfocytfraktion (fraktion 2) af celler i kultur ved 10 × 106 celler/cm2 i en 1 L lukket bioreaktor med 5 μmol/L zoledronsyre og 300 IE/mL IL-2.</li>
	<li>Inkuberes i syv dage i en inkubator, der er indstillet til 37 °C med 5% CO2.</li>
</ol>2. Alpha-beta (αβ) T celle udtømning
<ol><li>Høst celler fra 1 L lukket system bioreaktor kolbe. Steril-svejsning en 1 L overførselspakke til den røde linje af det lukkede system bioreaktor, og bruge den relevante farmaceutiske pumpe til at overføre cellerne i overførselspakken.</li>
	<li>Tag følgende prøver: 10 mL for brugt medium sterilitet; 0,5 mL celler til celleantal og levedygtighed ved hjælp af AO/PI 5 × 106 celler til flowcytometri</li>
	<li>Brug cellerne ved ~5 × 108 celler/mL i fosfatbufferet saltvand (PBS) eller (PBS/ethylendiamintetraacesyre (EDTA)) buffer + 0,5 % HSA og biotinyleret TCR αβspecifikt antistof.</li>
	<li>Sæt shakeren i køleskabet, og inkuber cellerne ved 2-8 °C i ca. 15 min med rysten.</li>
	<li>Vask cellerne med i alt 600 mL PBS/EDTA buffer + 0,5% HSA. Centrifuge til fjernelse af det ubundne antistof ved 200-500 × g i 15 min ved 2-8 °C. Resuspend ~5 × 108 celler/mL i PBS/EDTA buffer + 0,5% HSA med antibiotinspecifikke mikroperler (7,5 mL/1 hætteglas).</li>
	<li>Sæt shakeren i køleskabet, og inkuber cellerne ved 2-8 °C i ca. 15 min med rysten. Efter inkubation centrifugerer cellerne ved 200-500 × g i 15 min ved 2-8 °C for at fjerne de ubundne mikroperler. Resuspend ~ 6 × 107 celler / mL i PBS / EDTA buffer + 0,5% HSA og overføre dem til en overførsel pakke taske.</li>
	<li>Installer slangesættet i den magnetiske celleadskillelsesanordning af klinisk kvalitet ved at følge fabrikantens anvisninger, placer pakningerne med PBS/EDTA-bufferen og overførselspakken med celleproduktet i instrumentet, og spikes det, når instrumentet instruerer det.</li>
	<li>Vælg protokollen Udtømning 1.2 for udtømning af de mærkede αβ T-celler.</li>
	<li>Centrifuge målfraktionen (beriget γδ T-celler) og genbruge cellerne i medium suppleret med 10% human AB serum.</li>
	<li>Tag en 0,5 mL prøve og udføre en celle tæller og levedygtighed med AO / PI plet. Bringe celler til en endelig koncentration på ca. 1 × 106 celler / mL. Tag en prøve på 5 × 106 celler i produktet for flowcytometri phenotyping post-udtømning.</li>
</ol>3. Co-kultur med aAPCs
<ol><li>Bestråle 5 × 107 aAPCs/kolbe ved 100 Gy på røntgengenereringsinstrumentet.</li>
	<li>Brug aAPCs i co-kultur på en 10:1 forhold med γδ T celler. Anbring de bestrålede aAPC'er (5 × 107 celler/kolbe) og γδ T-celler (5 × 106 celler/kolbe) i 1 L lukkede bioreaktorflasker med 1 L kulturmedium suppleret med 10 % human AB-serum. Frø op til 10 kolber.</li>
	<li>Udvid cellerne i kulturen i 10 dage i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2.</li>
	<li>Overvåg glukose- og laktatniveauer hver 3-4. dag ved hjælp af strimler, glukose og en laktatmåler.</li>
	<li>Hvis glukose falder til 250 mg/dL, reduceres volumenet i kolben til 200 mL ved hjælp af en farmaceutisk pumpe ved steril svejsning en 1 L-overførselspakke til den røde linje i det lukkede system bioreaktor.</li>
	<li>Bland cellerne i de resterende 200 mL, og tag en 0,5 mL prøve til celletælling og levedygtighedsmåling ved AO-PI farvning. Hvis celletallet er ≥109, opdeles en kolbe i to kolber og hver kolbe fyldes op til 1 L med AIM-V suppleret med 10% human AB serum. Hvis celletallet er <109, fodre cellerne med en frisk liter kulturmedium suppleret med 10% human AB serum.</li>
	<li>Gentag trin 3.6 for alle kolber, og sæt dem tilbage til inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2. Gentag trin 3,4-3,7 hver 3.-4.</li>
</ol>4. Cellehøst
<ol><li>I slutningen af 10 dage i co-kultur, høste alle bioreaktor kolber. Høst 1 bioreaktorkolbe ad gangen, og pulje alle cellerne i en overførselspakke af passende størrelse. Steril-svejse overførselspakken til den røde linje af den lukkede system bioreaktor, og bruge den farmaceutiske pumpe til at overføre cellerne i overførselspakken.</li>
	<li>Fjern følgende kvalitetskontrolprøver: 1% af lægemidlet (DP) til sterilitet ved blodkultur og gram farvning; 0,5 mL for celletælling og levedygtighed ved hjælp af AO/PI 5-10 × 106 celler til flowcytometri (se figur 1 for gating strategi); 0,5 mL for endotoksin; 0,5 mL til gram farvning; 106 celler spiked i 10 mL af brugt medium til Mycoplasma test.</li>
	<li>Centrifugere cellerne ved 200-500 × g i 15 min ved stuetemperatur og kassér supernatanten.</li>
	<li>Vask cellerne i en opløsning af afbalanceret krystalloid opløsning+ 0,5% HSA ved 200-500 × g i 15 min ved stuetemperatur. Resuspend dem i et målvolumen på 100-300 mL afbalanceret krystalloid opløsning + 0,5% HSA.</li>
</ol>5. Udgivelsestest
<ol><li>Udføre kvalitetskontrol af γδ T-celle DP for følgende: renhed og identitet efter flowcytometri (Live/Dead, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); levedygtighed ved AO/PI farvning endotoxin; Mycoplasma test ved polymerase kædereaktion (PCR); sterilitet ved gram farvning og aerob og anaerobe blodkulturer; resterende K562-analyse efter flowcytometri (CD3-CD16-CD56-CD71+).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation:+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study.">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation.">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li><li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment,+risk+factors,+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li><li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph++leukemia+model.">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).</li><li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;&#948;+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-&#945;&#946;+/CD19++lymphocytes.">&#947;&#948; T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-&#945;&#946;+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li><li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+T+cell+receptor:+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors.">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells.">Large-scale expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li><li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+for+immunotherapy.">In vitro expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+V&#947;9V&#948;2+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer.">Allogeneic V&#947;9V&#948;2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Moffit Cell Therapy Lab har udviklet en protokol med en bifasisk udvidelse af meget rene γδ T-celler til brug som DP i kliniske forsøg. Denne protokol giver en fremstillingsmetode under cGMP retningslinjer i et lukket system, der giver en meget ren γδ T celle DP, der er succesfuldt aktiveret og udvidet med zoledronsyre og WCB aAPCs. Denne protokol er blevet godkendt af FDA til fremstilling af en allogen γδ T celle DP til AML patienter. Ved hjælp af sunde donorer, vi med succes udvidet den lille befolkning af donor γδ T-celler på bare 7 dage fra 2,06 ± 0,45% til 54,45 ± 28,34%. Efter 7-dages ekspansion med zoledronsyre blev det observeret, at donor 2 havde en stigning i NK-populationen.
Zoledronsyre hæmmer farnesyldiphosphatsyntase (FDPS) i monocytter, hvilket igen fører til ophobning af isopentenyl pyrophosphat (IPP), som er blevet korreleret med en betydelig stigning i spredningen af T-celler og naturlige NK-celler7,8,9. Denne øgede NK-population hindrer 2. fase af ekspansionen med AAPCs, da AAPCs kun vil bidrage til yderligere udvidelse af NK-celler. Af denne grund blev donorkriterierne ændret for at udelukke donorer med høje NK-populationer. Efter udtømning af αβ T-cellerne blev γδ T-cellerne yderligere beriget til 76,61 ± 27,51%. Denne unikke protokol indeholder en anden udvidelse udnytte Moffit-fremstillede aAPCs til at målrette CD8, CD28, og CD127L receptorer i γδ T celler. Denne anden udvidelsesfase med aAPCs gav en DP med ≥65% for CD3 + TCR γδ + T-celler, ≤1% TCRαβ T og <35% CD3-CD16 + CD56 + NK celler. På grund af anvendelsen af K562-afledte aAPCs var det nødvendigt at påvise, at disse AAPC'er udgjorde <1 % af slutproduktet.
Moffit CTF udviklede en flowcytometrisk analyse, der blev anvendt til frigivelseskriterierne til at måle procentdelen af de resterende K562-celler i den endelige DP. Denne flow cytometrisk assay afbøder alle de spørgsmål om at udnytte celle overflade antigener til at identificere K562 celler. Da aktiverede T-celler kan udtrykke CD71, udtænkte vi en strategi for at udelukke alle T-celler og NK-celler ved at gating på CD3- CD56- og CD16-populationer og derefter undersøge CD71+ celler, som udelukkende ville være K562-celler. Denne protokol viser, at γδ T-cellen DP giver 0,48 ± 0,42% af de resterende K562-celler og opfylder alle frigivelseskriterierne for ≥70% levedygtighed, Mycoplasma-negativitet af PCR, ingen organismer set ved gramfarvning, ≤2 EU / mL af endotoksin og ingen vækst endelig (14 dage) blodkultur sterilitet.

Leukæmi tilbagefald er den hyppigste årsag til dødelighed efter hæmatoopoietic celletransplantation (HCT) hos patienter med AML1,2,3. Bedre leukæmifri overlevelse blev rapporteret med øget genvinding af blod γδ T-celler efter HCT uden øget risiko for Graft-versus-Host Disease (GVHD)4. Γδ T-cellernes evne til at genkende antigener på en MHC-uafhængig måde og udvikle stærke cytolytiske og Th1-lignende effektorfunktioner gør denne mindre delpopulation af T-celler ideel til behandling af AML-patienter, der gennemgår allogen transplantation med risiko for tilbagefald5. I betragtning af at Vγ9Vδ2 T-cellerne er en mindre delmængde af T-lymfocytter fra 0,5% til 5% af T-cellerne i periferien6, satte vi os for at etablere et robust system til at udvide denne sjældne population af blodlegemer for at opnå potentielt terapeutiske doser til kliniske forsøg.
Selv om andre med succes har udvidet γδ T-celler ved hjælp af zoledronsyre og endda aAPCs, har vi udviklet en proces, der potentielt kan udvide γδ T-celler med 229.749 gange. Udvidelsen er bifasisk: For det første opnås lymfocytter ved opstemthed ved hjælp af separationsinstrumentet. Udstyret giver et lukket system, der gør det muligt adskillelse af celler baseret på deres størrelse, form og tæthed ved kontraløb centrifugering. Efter berigelse for lymfocytter opnås selektiv udvidelse af Vγ9Vδ2 T-celler ved behandling med zoledronsyre og IL-2 i 7 dage. Umiddelbart efter denne behandling nedbrydes TCR-αβ T-celler ved hjælp af mikroperleteknologi, hvilket giver mulighed for efterfølgende udvidelse af γδ T-cellerne med K562-afledte aAPCs.
Til procesvalidering blev der kun brugt 5 × 106 zoledronsyreforvoksede γδ T-celler til fase-2-samkulturudvidelsen med aAPCs. I denne anden fase af udvidelsen aktiveres γδ T-celler ved hjælp af en aktuel good manufacturing practices (cGMP)-kompatibel working cell bank (WCB) af genetisk manipulerede K562-afledte aAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) fremstillet på Moffitt. Rationalet for denne bifasiske ekspansion er baseret på zoledronsyres evne til at hæmme farnesyldiphosphatsynase (FDPS) i monocytter, hvilket fører til akkumulering af isopentenyl pyrophosphat, som direkte stimulerer Vγ2Vδ2-cellerne. I anden fase af udvidelsen giver de K562-afledte aAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) en robust stimulering til alle T-celler. Celleproduktet er dog allerede blevet beriget til γδ T-cellerne, hvilket resulterer i en robust udvidelse af γδ T-cellerne.
Ved brug af specifikt udstyr og kolber er processen et funktionelt lukket system, hvilket reducerer risikoen for forurening. Derudover letter 1 L-bioreaktoren 1 L-lukket system maksimal vækst og ekspansion af celler i et samlet volumen på 1 L medium med minimalt behov for fodring. Fordelen ved Moffitt-metoden er, at den giver et hurtigt, reproducerbart og meget muligt GMP-system til fremstilling af et meget rent, donorafledt γδ T-celleprodukt til allogen administration. Denne metode kan anvendes på ethvert klinisk forsøg, der har til formål at bruge humane γδ T-celler, der udtrykker Vγ2Vδ2 T-cellereceptorer som adoptivimmunterapi for at mægle immunitet mod mikrober og tumorer hos kræftpatienter med delvis og fuldstændig remission. Derudover giver det en robust platform til udvikling og produktion af γδ kimær antigen receptor-positive (CAR +) T-celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>285-GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin 25%</td>
			<td>Grifolis</td>
			<td>65483-16-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalyte A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>2B2543Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoledronic Acid (Zometa)</td>
			<td>Hos pira</td>
			<td>4215-04--8</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS10</td>
			<td>BIOLIFE SOLUTIONS</td>
			<td>210374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL syringe</td>
			<td>JMS</td>
			<td>992861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18g Needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials 1.8 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367610Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 mL Transfer Pack</td>
			<td>TERUMO BCT INC</td>
			<td>1BBT060CB71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Plasma Transfer Set</td>
			<td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td>
			<td>03-220-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra Tubing Set</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>70800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 MCS GREX</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td>81100-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acacia Pump boot</td>
			<td>MPS Medical In</td>
			<td>17789HP3MLL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-070-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dornase Alpha</td>
			<td>Genentech, Inc</td>
			<td>50242-100-40/186-0055</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL 0.22 um Filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>157-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Filter 170um</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>V2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACs Tubing set</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-090-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS TCR&#945;/&#946; Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-021-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-Type blood set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>FWL4C2498H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 mL Flask</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>65483-116-071</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM-V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0870112BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Gemini Bio-Product</td>
			<td>100H41T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Liter Transfer pack</td>
			<td>Independent Medical Associates</td>
			<td>T3109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000&#160; pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5991040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF-250</td>
			<td>KOLBio</td>
			<td>CF-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra</td>
			<td>TERUMOBCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Vios CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product

Selv om Vγ9Vδ2 T-celler er en mindre delmængde af T-lymfocytter, er denne population efterspurgt for sin evne til at genkende antigener i et større histokompatibilitetskompleks (MHC)-uafhængig måde og udvikle stærk cytolytisk effektorfunktion, der gør det til en ideel kandidat til kræftimmunterapi. På grund af den lave frekvens af Gamma-Delta (γδ) T-celler i det perifere blod udviklede vi en effektiv protokol til i høj grad at udvide et meget rent γδ T-celler lægemiddelprodukt til første-i-menneskelig brug af allogene γδ T-celler hos patienter med akut myeloid leukæmi (AML). Ved hjælp af sund donoraferese som en allogen cellekilde isoleres lymfocytterne ved hjælp af en valideret enhed til en kontraflowcentrifugeringsmetode til at adskille celler efter størrelse og tæthed. 
Den lymfocyt-rige fraktion udnyttes, og γδ T-cellerne er fortrinsvis aktiveret med zoledronsyre (FDA-godkendt) og interleukin (IL)-2 i 7 dage. Efter præferenceudvidelsen af γδ T-celler anvendes en magnetisk celleadskillelsesanordning af klinisk kvalitet og TCRαβ-perler til at nedbryde forurenende T-cellereceptor (TCR)αβ T-celler. De højt berigede γδ T-celler gennemgår derefter en anden udvidelse ved hjælp af manipulerede kunstige antigen-præsenterende celler (aAPCs) afledt af K562 celler-genetisk manipuleret til at udtrykke enkeltkædet variabelt fragment (scFv) til CD3 og CD28, 41BBL (CD137L) og IL15-RA-sammen med zoledronsyre og IL-2. Såning hele dagen-7 beriget γδ T celler i co-kultur med aAPCs letter fremstillingen af meget ren γδ T-celler med en gennemsnitlig fold udvidelse af >229.000 gange fra sundt donorblod.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Præsenteret er en protokol for udvidelsen af Gamma-Delta (γδ) T celle stof produkt. Lymfocytter er isoleret ved opstemthed og γδ-beriget med zoledronsyre og interleukin-2. Alpha-beta T-celler er udtømt ved hjælp af en klinisk-grade magnetisk adskillelse enhed. ΓΔ-cellerne er co-cultured med K562-afledte, kunstige antigen-præsentere celler og udvidet.

Udvidelse og berigelse af Gamma-Delta (γδ) T-celler fra aferesed humant produkt

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Gamma-Delta T-cellerne har kraftig cytotoksisk aktivitet mod mange kræfttyper, herunder akut myeloid leukæmi. Gamma-Delta T-celler i blodet er imidlertid relativt sjældne, især hos patienter med maligniteter. Infusionen af donor afledte, X-vivo udvidet Gamma-Delta T celler, har løfte om at reducere gentagelsen af leukæmi, og forbedre overlevelsen af patienter med akut myeloid leukæmi.Den foreslåede metode opnår mere end 200.000 gange Gamma-Delta T celle ekspansion, nå terapeutisk relevante doser af en meget ren Gamma-Delta T celle produkt, i tre nemme trin. Så ligating en IEL til ekspansion, alpha beta T celle udtømning ved magnetisk sortering og bounty sekundær ekspansion med AAPCs. Den foreslåede metode udvider nytten af Gamma-Delta T-celler til sygdomme som kræft og autoimmune sygdomme ved hurtigt at skabe et stort antal celler, der kan bruges fra hylden.Denne proces kan tilpasses til at udvide Gamma-Delta celler ved hjælp af forskellige berigelse metoder og tilføje yderligere manipulationer såsom transduktion. Demonstrere proceduren vil blive tændt i LA, en celle terapi teknolog, tre fra mit laboratorium. Begynd med opsigtskning af bruseproduktprøven på kontraflowcentrifugeringsanordningen ved hjælp af et primær medium af Hanks afbalanceret saltopløsning med 1% human serum albumin og det sekundære medium saltvandsopløsning eller DPBS.Med elutriation centrifugering hastighed på 900 gange G, indsamle fraktioner baseret på flowhastighed og tid. Saml prøverne fra fraktion to til at udføre sterilitetstest, celleantal og cellefænotyping ved flowcytometri. Fra fraktion to, udvide en ren lymfocyt brøkdel af celler i kultur på 10 gange 10 til den sjette celler per centimeter i anden, med fem mikromol per liter zoledronsyre og 300 enheder pr milliliter interleukin-2 i en en liter lukket system bioreaktor.Inkuber systemet i syv dage ved 37 grader celsius, med 5% kuldioxid. Efter inkubation høst celler fra en liter lukket system bioreaktor kolbe. For at gøre dette skal steril svejse en overførselspakke på en liter til bioreaktorens røde linje og bruge den relevante farmaceutiske pumpe til at overføre cellerne til overførselspakken.Tag prøverne til test af brugt medium sterilitet, celleantal og celle phenotyping ved flow cytometri. Fra den resterende prøve skal cellerne suspenderes igen fem gange 10 til ottende celler pr. milliliter i PBS-EDTA-buffer, der indeholder 0,5% HSA og biotinyleret T-cellereceptor, alfa betaspecifikt antistof. Og inkubere cellerne ved to til otte grader Celsius med rysten.Efter 15 minutter vaskes cellerne med 600 milliliter PBS-EDTA buffer, der indeholder 0,5 HSA og centrifuge ved 200 til 500 gange G i 15 minutter, ved to til otte grader Celsius, for at fjerne det ubundne antistof. Derefter suspendere cellerne igen på ca. fem gange 10 til ottende celler pr. milliliter i PBS-EDTA-buffer, der indeholder 0,5% HSA og 7,5 milliliter pr. hætteglas med antibiotinspecifikke mikroperler. Som tidligere beskrevet inkuberes cellerne med rystelser, før du centrifugerer celleaffjedringen for at fjerne de ubundne mikroperler.Suspendere seks gange 10 til syvende celler pr. milliliter i PBS-EDTA-buffer med 0,5 % HSA. Saml dem i en overførselspakkepose. Spike det, når instrueret af instrumentet.Derefter skal du installere et slangesæt i den kliniske kvalitet magnetisk celleadskillelsesenhed. Placer pakningerne med PBS-EDTA-bufferen og overførselspakken med celleproduktet i instrumentet. For udtømning af de mærkede alfa beta T-celler skal du vælge udtømningsprotokollen 1.2 i softwaren.Derefter centrifugere celleproduktet til at indsamle målet brøk beriget med Gamma-Delta T celler. Ophæng de indsamlede celler i mediet igen, suppleret med 10% human AB serum. Udfør en celletælling levedygtighed og flow cytometri phenotyping post udtømning.Bring celler til en endelig koncentration på ca. en gange 10 til den sjette celler pr milliliter. Bestråle fem gange 10 til den syvende kunstige Antigen-præsentere celler eller AAPCs per kolbe, ved 100 grå på x-ray genererende instrument. Forbered en co-kultur, ved at placere bestrålede AAPCs og Gamma-Delta T celler i forholdet mellem 10 er til en, i en liter lukket system bioreaktor kolber.Med en liter kulturmedium, suppleret med 10% human AB serum, frø op til 10 kolber. Inkuber kulturen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 10 dage med en screening af glukose- og laktatniveauer hver tredje til fjerde dag ved hjælp af strimler, glukose og en laktatmåler. Hvis glukoseniveauet falder til 215 milligram pr. deciliter, reduceres volumenet i kolben til 200 milliliter.Bland cellerne i de resterende 200 milliliter medier, og fjern en 0,5 milliliterprøve til celletælling og levedygtighedsmåling ved aigennemsen orange eller propidium jodfarvning. Hvis celletallet er lig med, eller mere end 10 til niende, opdele indholdet af en kolbe i to og fylde hver kolbe op til en liter med AIM-V medium, suppleret med 10% human AB serum. Hvis celletallet er mindre end 10 til niende, fodre cellerne med en frisk en liter kulturmedium, suppleret med 10% human AB serum, og returnere kolberne til inkubatoren.Efter 10 dage i samkulturen høstes bioreaktorkolberne en ad gangen, og træk alle cellerne ind i en overførselspakke af passende størrelse. Når kvalitetskontrolprøverne er fjernet, centrifugeres cellerne ved 200 til 500 gange G i 15 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten kasseres. Vask cellerne i en opløsning af afbalanceret krystalloid opløsning, suppleret med 0,5% HSA ved 200 til 500 gange G i 15 minutter ved stuetemperatur.Re-suspendere dem i et mål volumen på 100 til 300 milliliter afbalanceret krystalloid opløsning med 0,5% HSA. Cellerne adskilt fra post counterflow centrifugation brøk. To gav en ren lymfocyt befolkning, med en fremragende gennemsnitlig levedygtighed på 95,80% Gamma-Delta T celler specifik ekspansion, med zoledronsyre afhang af den oprindelige procentdel af naturlige dræberceller til stede i lymfocyt fraktion efter opstemthed.Berigelsen af Gamma-Delta T-celle stof, med T-celle receptor alpha beta udtømning var konsekvent. Gamma-Delta T-celle lægemiddel fremstillet af tre sunde donorer, opfyldt frigivelse kriterium på mindre end 1% af T-celle receptor alpha beta positive T-celler, med et gennemsnit på 0,11% CD20 positive B-celler, og 0,00% T-celle receptor alpha beta positive T-celler. Den gennemsnitlige procentdel af naturlige dræberceller i det endelige produkt var omkring 17,06%, som opfyldte frigivelseskriteriet om mindre end 35% Celleoverfladefarvning og flowcytometrianalyse, blev udnyttet til at karakterisere identiteten, renheden og proces urenheder af lægemidlet stof og lægemiddelprodukt.Den anden re-ekspansion opnået fra co-kultur af AAPC og Gamma-Delta T-celle stof, genereret en Gamma-Delta T-celle lægemiddelprodukt, der opfyldte alle frigivelseskriterier. Patoner, der beriger T-cellepopulationen, påvirker produktets ekspansion og egenskaber. Der er behov for tilstrækkelig overvejelse og undersøgelse af berigningsmetoder, inden deres berigningsproces påbegyndes.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target Cell pre berigelse og hele genom forstærkning for enkelt celle Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolering af menneskelige endotelceller fra normale kolon og Colorectal karcinom - en forbedret protokol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

Morfologi-baserede skelnen mellem sund og patologiske celler udnytte Fourier transformeringer og selvorganiserende kort

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Ekstraktion af vandige metabolitter fra kultiverede Vedklædende celler til Metabolomic analyse af kapillar elektroforese-massespektrometri

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Anvendelse af menneskeskabte pluripotente stamceller til generering af tumor antigen-specifikke T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolering og udvidelse af cytotoksiske cytokin-induceret Killer T Celler til kræftbehandling

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolering af humane perifere blodmononukleære celler og CD4 + T-celler fra Sézary syndrom patienter til transkriptomisk profilering

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering og funktionel vurdering af stamceller fra brystkræft fra celle- og vævsprøver

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Generering og udvidelse af primære, maligne pleurale mesotheliom tumorlinjer

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Detektion og indfangning i realtid af invasive cellesubpopulationer fra co-kulturer

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...