Name: expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

We bedanken de Cellular Immunotherapies-Investigator Initiated Trials Award Intramural Funding Opportunity van Moffitt Cancer Center voor het verstrekken van de financiering voor deze protocolontwikkeling. We bedanken ook Dr. Claudio Anasetti voor zijn onschatbare hulp en begeleiding bij dit project. Tot slot bedanken we Dr. Justin Boucher voor zijn inzichten en beoordeling van het manuscript.

OPMERKING: IRB-goedkeuring werd verkregen en geïnformeerde toestemming werd verkregen van de donoren.
1. Lymfocytenisolatie
<ol><li>Breng het afereseproduct over naar een cleanroom. OPMERKING: Procesvalidatie werd uitgevoerd met behulp van normale donoraferese van een externe commerciële leverancier die voldoet aan de voorschriften voor het verzamelen van grondstoffen.</li>
	<li>Verzamel monsters voor steriliteitstests, celgetal en celfenotypering.</li>
	<li>Elutriate op het tegenstroomcentrifugatieapparaat met behulp van een primair medium hanks gebalanceerde zoutoplossing met 1% humaan serumalbumine (HSA) en een secundair medium zoutoplossing (0,9% natriumchloride-injectie USP) of Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS). Stel de elutriatiecentrifugatiesnelheid in op 900 × g en verzamel fracties op basis van stroomsnelheid en tijd.</li>
	<li>Verzamel monsters van fractie 2 en voer de volgende tests uit: 2 ml voor steriliteitstests; 0,5 ml voor celgetal en levensvatbaarheid met behulp van acridine oranje/propidiumjodide (AO/PI); 5 × 106 cellen voor celfenotypering door flowcytometrie.</li>
	<li>Breid een zuivere lymfocytenfractie (fractie 2) van cellen uit in cultuur bij 10 × 106 cellen/cm2 in een bioreactor met gesloten systeem van 1 L met 5 μmol/L zoledroninezuur en 300 IE/ml IL-2.</li>
	<li>Incubeer gedurende zeven dagen in een incubator op 37 °C met 5% CO2.</li>
</ol>2. Alfa-bèta (αβ) T-celdepletie
<ol><li>Oogst cellen uit de 1 L bioreactorkolf met gesloten systeem. Las een transferpakket van 1 L steriel op de rode lijn van de bioreactor met gesloten systeem en gebruik de juiste farmaceutische pomp om de cellen in het transferpakket over te brengen.</li>
	<li>Neem de volgende monsters: 10 ml voor gebruikte medium steriliteit; 0,5 ml cellen voor celgetal en levensvatbaarheid met behulp van AO / PI; 5 × 106 cellen voor flowcytometrie</li>
	<li>Resuspend de cellen bij ~5 × 108 cellen/ml in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) of (PBS/ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)) buffer + 0,5% HSA en gebiotinyleerd TCR αβ-specifiek antilichaam.</li>
	<li>Plaats de shaker in de koelkast en incubeer de cellen bij 2-8 °C gedurende ongeveer 15 minuten met schudden.</li>
	<li>Was de cellen met in totaal 600 ml PBS/EDTA-buffer + 0,5% HSA. Centrifugeer om het ongebonden antilichaam te verwijderen bij 200-500 × g gedurende 15 minuten bij 2-8 °C. Resuspend ~ 5 × 108 cellen / ml in PBS / EDTA-buffer + 0,5% HSA met anti-biotine-specifieke microbeads (7,5 ml / 1 injectieflacon).</li>
	<li>Plaats de shaker in de koelkast en incubeer de cellen bij 2-8 °C gedurende ongeveer 15 minuten met schudden. Centrifugeer na incubatie de cellen bij 200-500 × g gedurende 15 minuten bij 2-8 °C om de ongebonden microbeads te verwijderen. Resuspend ~ 6 × 107 cellen / ml in PBS / EDTA-buffer + 0,5% HSA en breng ze over naar een transferverpakkingszak.</li>
	<li>Installeer de slangenset in het magnetische celscheidingsapparaat van klinische kwaliteit door de instructies van de fabrikant te volgen, plaats de verpakkingen met de PBS/EDTA-buffer en de transferverpakking met het celproduct in het instrument en spike deze wanneer het instrument u dit opdraagt.</li>
	<li>Selecteer het Depletion 1.2-protocol voor de depletie van de gelabelde αβ T-cellen.</li>
	<li>Centrifugeer de doelfractie (verrijkte γδ T-cellen) en resuspend de cellen in medium aangevuld met 10% humaan AB-serum.</li>
	<li>Neem een monster van 0,5 ml en voer een celtelling en levensvatbaarheid uit met AO / PI-kleuring. Breng cellen tot een eindconcentratie van ongeveer 1 × 106 cellen/ml. Neem een monster van 5 × 106 cellen van het product voor flowcytometrie fenotypering na depletie.</li>
</ol>3. Co-cultuur met aAPCs
<ol><li>Bestraal 5 × 107 aAPCs/kolf met 100 Gy op het röntgengenererende instrument.</li>
	<li>Gebruik de aAPCs in co-cultuur in een verhouding van 10:1 met de γδ T-cellen. Breng de doorstraalde aAPCs (5 × 107 cellen/kolf) en γδ T-cellen (5 × 106 cellen/kolf) in 1 L bioreactorkolven met gesloten systeem met 1 L kweekmedium aangevuld met 10% humaan AB-serum. Zaai tot 10 kolven.</li>
	<li>Zet de cellen in cultuur gedurende 10 dagen uit in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.</li>
	<li>Controleer glucose- en lactaatspiegels elke 3-4 dagen met behulp van strips, glucose en een lactaatmeter.</li>
	<li>Als de glucose daalt tot 250 mg/dl, verlaagt u het volume in de kolf tot 200 ml met behulp van een farmaceutische pomp door een transferpakket van 1 L steriel te lassen aan de rode lijn van de bioreactor van het gesloten systeem.</li>
	<li>Meng de cellen in de resterende 200 ml en neem een monster van 0,5 ml voor celtelling en levensvatbaarheidsmeting door AO-PI-kleuring. Als het celgetal ≥109 is, splitst u één kolf in twee kolven en vult u elke kolf tot 1 l met AIM-V aangevuld met 10% humaan AB-serum. Als het celgetal <109 is, voedt u de cellen met een verse liter kweekmedium aangevuld met 10% humaan AB-serum.</li>
	<li>Herhaal stap 3.6 voor alle kolven en breng ze terug naar de couveuse bij 37 °C en 5% CO2. Herhaal stap 3.4-3.7 elke 3 tot 4 dagen.</li>
</ol>4. Celoogst
<ol><li>Aan het einde van 10 dagen in co-cultuur, oogst alle bioreactorkolven. Oogst 1 bioreactorkolf tegelijk en bundel alle cellen in een transferverpakking van de juiste grootte. Las het transferpakket steriel op de rode lijn van de bioreactor met gesloten systeem en gebruik de farmaceutische pomp om de cellen in het transferpakket over te brengen.</li>
	<li>Verwijder de volgende kwaliteitscontrolemonsters: 1% van het geneesmiddel (DP) voor steriliteit door bloedkweek en gramkleuring; 0,5 ml voor celtelling en levensvatbaarheid met behulp van AO/PI; 5-10 × 106 cellen voor flowcytometrie (zie figuur 1 voor gatingstrategie); 0,5 ml voor endotoxine; 0,5 ml voor gramkleuring; 106 cellen piekten in 10 ml verbruikt medium voor Mycoplasma-testen.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 200-500 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Was de cellen in een oplossing van gebalanceerde kristalloïde oplossing + 0,5% HSA bij 200-500 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Resuspend ze in een doelvolume van 100-300 ml gebalanceerde kristalloïde oplossing + 0,5% HSA.</li>
</ol>5. Vrijgeven testen
<ol><li>Uitvoeren van kwaliteitscontroletests van de γδ T-cel DP voor het volgende: zuiverheid en identiteit door flowcytometrie (Live/Dead, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); levensvatbaarheid door AO/PI-kleuring; endotoxine; Mycoplasma testen door polymerasekettingreactie (PCR); steriliteit door gramkleuring en aerobe en anaërobe bloedculturen; residuele K562-test door flowcytometrie (CD3-CD16-CD56-CD71+).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation:+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study.">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation.">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li><li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment,+risk+factors,+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li><li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph++leukemia+model.">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).</li><li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;&#948;+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-&#945;&#946;+/CD19++lymphocytes.">&#947;&#948; T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-&#945;&#946;+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li><li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+T+cell+receptor:+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors.">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells.">Large-scale expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li><li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+for+immunotherapy.">In vitro expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+V&#947;9V&#948;2+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer.">Allogeneic V&#947;9V&#948;2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Het Moffit Cell Therapy Lab heeft een protocol ontwikkeld met een bifasische expansie van zeer zuivere γδ T-cellen voor gebruik als DP in klinische onderzoeken. Dit protocol biedt een productiemethode onder cGMP-richtlijnen in een gesloten systeem dat een zeer zuivere γδ T-cel DP oplevert die met succes wordt geactiveerd en uitgebreid door zoledroninezuur en de WCB aAPCs. Dit protocol is goedgekeurd door de FDA voor de vervaardiging van een allogene γδ T-cel DP voor AML-patiënten. Met behulp van gezonde donoren hebben we met succes de kleine populatie donor γδ T-cellen in slechts 7 dagen uitgebreid van 2,06 ± 0,45% naar 54,45 ± 28,34%. Na de 7-daagse expansie met zoledroninezuur werd waargenomen dat donor 2 een toename van de NK-populatie had.
Zoledroninezuur remt farnesyldifosfaatsynthase (FDPS) in monocyten, wat op zijn beurt leidt tot de accumulatie van isopentenylpyrofosfaat (IPP), wat is gecorreleerd met een significante toename van de proliferatie van T-cellen en natuurlijke NK-cellen7,8,9. Deze toegenomen NK-populatie belemmert de 2e fase van expansie met de aAPCs, omdat de aAPCs alleen maar zullen bijdragen aan de verdere uitbreiding van NK-cellen. Om deze reden zijn de donorcriteria aangepast om donoren met een hoge NK-populatie uit te sluiten. Na depletie van de αβ T-cellen werden de γδ T-cellen verder verrijkt tot 76,61 ± 27,51%. Dit unieke protocol bevat een tweede uitbreiding met behulp van de door Moffit vervaardigde aAPCs om zich te richten op de CD8-, CD28- en CD127L-receptoren in de γδ T-cellen. Deze tweede expansiefase met de aAPCs leverde een DP op met ≥65% voor CD3+TCR γδ+ T cellen, ≤1% TCRαβ T en <35% CD3-CD16+CD56+ NK cellen. Vanwege het gebruik van van K562 afgeleide aAPCs moest worden aangetoond dat deze aAPCs <1% van het eindproduct uitmaakten.
De Moffit CTF ontwikkelde een flowcytometrische assay die wordt gebruikt voor de afgiftecriteria om het percentage resterende K562-cellen in de uiteindelijke DP te meten. Deze flowcytometrische test vermindert alle problemen van het gebruik van celoppervlakantigenen om de K562-cellen te identificeren. Omdat geactiveerde T-cellen CD71 kunnen uitdrukken, hebben we een strategie bedacht om alle T-cellen en NK-cellen uit te sluiten door gating op CD3- CD56- en CD16-populaties en vervolgens de CD71 + -cellen te onderzoeken, die uitsluitend K562-cellen zouden zijn. Dit protocol toont aan dat de γδ T-cel DP 0,48 ± 0,42% resterende K562-cellen oplevert en voldoet aan alle afgiftecriteria van ≥70% levensvatbaarheid, Mycoplasma negativiteit door PCR, geen organismen gezien door gramkleuring, ≤2 EU / ml endotoxine en geen groeifinale (14 dagen) bloedkweeksteriliteit.

Leukemie-terugval is de belangrijkste doodsoorzaak na hematopoëtische celtransplantatie (HCT) bij patiënten met AML1,2,3. Betere leukemievrije overleving werd gemeld met het verhoogde herstel van bloed γδ T-cellen na HCT zonder verhoogd risico op Graft-versus-Host Disease (GVHD)4. Het vermogen van γδ T-cellen om antigenen op een MHC-onafhankelijke manier te herkennen en sterke cytolytische en Th1-achtige effectorfuncties te ontwikkelen, maakt deze kleine subpopulatie van T-cellen ideaal voor de behandeling van AML-patiënten die een allogene transplantatie ondergaan met een risico op terugval5. Aangezien de Vγ9Vδ2 T-cellen een kleine subset van T-lymfocyten zijn, variërend van 0,5% tot 5% van de T-cellen in de periferie6, wilden we een robuust systeem opzetten om deze zeldzame populatie van bloedcellen uit te breiden om potentieel therapeutische doses voor klinische onderzoeken te bereiken.
Hoewel anderen met succes γδ T-cellen hebben uitgebreid met behulp van zoledroninezuur en zelfs AAPCs, hebben we een proces ontwikkeld dat mogelijk γδ T-cellen met 229.749-voudig kan uitbreiden. De expansie is bifasisch: eerst worden lymfocyten verkregen door elutriatie met behulp van het scheidingsinstrument. De apparatuur biedt een gesloten systeem dat de scheiding van cellen mogelijk maakt op basis van hun grootte, vorm en dichtheid door tegenstroomcentrifugatie. Na verrijking voor lymfocyten wordt selectieve expansie van Vγ9Vδ2 T-cellen bereikt door behandeling met zoledroninezuur en IL-2 gedurende 7 dagen. Onmiddellijk na deze behandeling worden TCR-αβ T-cellen uitgeput met behulp van microbead-technologie, waardoor de γδ T-cellen vervolgens kunnen worden uitgebreid met K562-afgeleide aAPCs.
Voor procesvalidatie werden slechts 5 × 106 zoledroninezuur-geëxpandeerde γδ T-cellen gebruikt voor de fase-2 co-cultuur expansie met aAPCs. In deze tweede fase van uitbreiding worden γδ T-cellen geactiveerd met behulp van een huidige Good Manufacturing Practices (cGMP)-conforme Working Cell Bank (WCB) van genetisch gemanipuleerde K562-afgeleide aAPCs (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) vervaardigd in Moffitt. De redenering van deze bifasische expansie is gebaseerd op het vermogen van zoledroninezuur om farnesyldifosfaatsynthase (FDPS) in monocyten te remmen, wat leidt tot de accumulatie van isopentenylpyrofosfaat, dat de Vγ2Vδ2-cellen direct stimuleert. In de tweede fase van expansie bieden de K562-afgeleide aAPCs (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) een robuuste stimulatie aan alle T-cellen. Het celproduct is echter al verrijkt voor de γδ T-cellen, wat resulteert in een robuuste expansie van de γδ T-cellen.
Met behulp van specifieke apparatuur en kolven is het proces een functioneel gesloten systeem, waardoor het risico op besmetting wordt verminderd. Bovendien vergemakkelijkt de 1 L bioreactor met gesloten systeem maximale groei en expansie van cellen in een totaal volume van 1 L medium met minimale behoefte aan voeding. Het voordeel van de Moffitt-methode is dat het een snel, reproduceerbaar en zeer haalbaar GMP-systeem biedt om een zeer zuiver, van donor afgeleid γδ T-celproduct te produceren voor allogene toediening. Deze methode kan worden toegepast op elke klinische studie die gericht is op het gebruik van menselijke γδ T-cellen die Vγ2Vδ2 T-celreceptoren tot expressie brengen als adoptieve immunotherapie om immuniteit tegen microben en tumoren te bemiddelen bij kankerpatiënten met gedeeltelijke en volledige remissie. Daarnaast biedt het een robuust platform voor de ontwikkeling en productie van γδ chimere antigeenreceptorpositieve (CAR+) T-cellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>285-GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin 25%</td>
			<td>Grifolis</td>
			<td>65483-16-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalyte A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>2B2543Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoledronic Acid (Zometa)</td>
			<td>Hos pira</td>
			<td>4215-04--8</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS10</td>
			<td>BIOLIFE SOLUTIONS</td>
			<td>210374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL syringe</td>
			<td>JMS</td>
			<td>992861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18g Needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials 1.8 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367610Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 mL Transfer Pack</td>
			<td>TERUMO BCT INC</td>
			<td>1BBT060CB71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Plasma Transfer Set</td>
			<td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td>
			<td>03-220-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra Tubing Set</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>70800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 MCS GREX</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td>81100-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acacia Pump boot</td>
			<td>MPS Medical In</td>
			<td>17789HP3MLL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-070-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dornase Alpha</td>
			<td>Genentech, Inc</td>
			<td>50242-100-40/186-0055</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL 0.22 um Filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>157-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Filter 170um</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>V2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACs Tubing set</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-090-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS TCR&#945;/&#946; Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-021-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-Type blood set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>FWL4C2498H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 mL Flask</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>65483-116-071</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM-V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0870112BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Gemini Bio-Product</td>
			<td>100H41T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Liter Transfer pack</td>
			<td>Independent Medical Associates</td>
			<td>T3109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000&#160; pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5991040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF-250</td>
			<td>KOLBio</td>
			<td>CF-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra</td>
			<td>TERUMOBCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Vios CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product

Hoewel Vγ9Vδ2 T-cellen een kleine subset van T-lymfocyten zijn, is deze populatie gewild vanwege zijn vermogen om antigenen op een belangrijke histocompatibiliteitscomplex (MHC) -onafhankelijke manier te herkennen en een sterke cytolytische effectorfunctie te ontwikkelen die het een ideale kandidaat maakt voor kankerimmunotherapie. Vanwege de lage frequentie van Gamma-Delta (γδ) T-cellen in het perifere bloed, ontwikkelden we een effectief protocol om een zeer zuiver γδ T-cellengeneesmiddel sterk uit te breiden voor het eerste gebruik van allogene γδ T-cellen bij patiënten met acute myeloïde leukemie (AML). Met behulp van gezonde donoraferese als allogene celbron worden de lymfocyten geïsoleerd met behulp van een gevalideerd apparaat voor een tegenstroomcentrifugatiemethode om cellen te scheiden op grootte en dichtheid. 
De lymfocytenrijke fractie wordt gebruikt en de γδ T-cellen worden bij voorkeur geactiveerd met zoledroninezuur (FDA-goedgekeurd) en interleukine (IL) -2 gedurende 7 dagen. Na de preferentiële expansie van γδ T-cellen worden een magnetisch celscheidingsapparaat van klinische kwaliteit en TCRαβ-kralen gebruikt om contaminerende T-celreceptor (TCR)αβ T-cellen uit te putten. De sterk verrijkte γδ T-cellen ondergaan vervolgens een tweede expansie met behulp van gemanipuleerde kunstmatige antigeen-presenterende cellen (aAPCs) afgeleid van K562-cellen - genetisch gemanipuleerd om single-chain variabel fragment (scFv) tot expressie te brengen voor CD3 en CD28, 41BBL (CD137L) en IL15-RA- samen met zoledroninezuur en IL-2. Het zaaien van alle dag-7 verrijkte γδ T-cellen in co-kweek met de aAPCs vergemakkelijkt de vervaardiging van zeer zuivere γδ T-cellen met een gemiddelde vouwuitbreiding van >229.000-voudig uit gezond donorbloed.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Gepresenteerd is een protocol voor de uitbreiding van Gamma-Delta (γδ) T-cel geneesmiddel product. Lymfocyten worden geïsoleerd door elutriatie en γδ-verrijkt met zoledroninezuur en interleukine-2. Alfa-bèta T-cellen worden uitgeput met behulp van een magnetisch scheidingsapparaat van klinische kwaliteit. De γδ-cellen worden samen met K562-afgeleide, kunstmatige antigeen-presenterende cellen en uitgebreid.

Uitbreiding en verrijking van gamma-delta (γδ) T-cellen uit ontfereend menselijk product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

De Gamma-Delta T-cellen hebben krachtige cytotoxische activiteit tegen veel kankersoorten, waaronder acute myeloïde leukemie. Circulerende Gamma-Delta T-cellen in een bloed zijn echter relatief zeldzaam, vooral bij patiënten met maligniteiten. De infusie van donor afgeleide, X-vivo uitgebreide Gamma-Delta T-cellen, zijn veelbelovend in het verminderen van de herhaling van leukemie en het verbeteren van de overleving van patiënten met acute myeloïde leukemie.De voorgestelde methode bereikt meer dan 200.000-voudige Gamma-Delta T-celexpansie en bereikt therapeutisch relevante doses van een zeer zuiver Gamma-Delta T-celproduct, in drie eenvoudige stappen. Dus het ligeren van een IEL tot expansie, alfa bèta T-celuitputting door magnetische sortering en bounty secundaire expansie met AAPCs. De voorgestelde methode breidt het nut van Gamma-Delta T-cellen voor ziekten zoals kanker en auto-immuunziekten uit door snel een groot aantal cellen te creëren die van de plank kunnen worden gebruikt.Dit proces kan worden aangepast om Gamma-Delta-cellen uit te breiden met behulp van verschillende verrijkingsmethoden en extra manipulaties zoals transductie toe te voegen. Het demonstreren van de procedure zal worden uitgevoerd in LA, een celtherapietechnoloog, drie van mijn laboratorium. Begin met het opheffen van het monster van het bruisproduct, op het tegenstroomcentrifugatieapparaat, met behulp van een primair medium van Hanks gebalanceerde zoutoplossing, met 1% humaan serumalbumine en het secundaire medium zoutoplossing of DPBS.Met de elutriatiecentrifugatiesnelheid op 900 keer G, verzamel fracties op basis van stroomsnelheid en tijd. Verzamel de monsters van fractie twee om de steriliteitstests, het celgetal en de celfenotypering uit te voeren door middel van flowcytometrie. Breid van fractie twee een zuivere lymfocytenfractie van cellen in cultuur uit op 10 maal 10 tot de zesde cellen per centimeter in het kwadraat, met vijf micromol per liter zoledroninezuur en 300 eenheden per milliliter Interleukine-2 in een bioreactor van één liter gesloten systeem.Incubeer het systeem zeven dagen lang bij 37 graden celsius, met 5% koolstofdioxide. Oogst na incubatie cellen uit de bioreactorkolf van één liter gesloten systeem. Om dit te doen, las steriel een transferpakket van één liter aan de rode lijn van de bioreactor en gebruikt u de juiste farmaceutische pomp om de cellen in het transferpakket over te brengen.Neem de monsters voor het testen van de gebruikte medium steriliteit, celtelling en celfenotypering door middel van flowcytometrie. Van het resterende monster, opnieuw suspensie van de cellen op vijf keer 10 tot de achtste cellen per milliliter, in PBS-EDTA buffer met 0,5% HSA en gebiotinyleerde T-cel receptor, alfa bèta specifiek antilichaam. En incubeer de cellen bij twee tot acht graden Celsius met schudden.Was de cellen na 15 minuten met 600 milliliter PBS-EDTA-buffer met 0,5 HSA en centrifugeer gedurende 15 minuten op 200 tot 500 maal G, bij twee tot acht graden Celsius, om het ongebonden antilichaam te verwijderen. Vervolgens suspensies de cellen opnieuw op ongeveer vijf keer 10 tot de achtste cellen per milliliter, in PBS-EDTA-buffer met 0,5% HSA en 7,5 milliliter per injectieflacon met anti-biotinespecifieke microbeads. Zoals eerder beschreven, incubeer de cellen met schudden, voordat u de celsuspensie centrifugeert om de ongebonden microbeads te verwijderen.Zes keer 10 tot de zevende cel per milliliter opnieuw suspenseren in PBS-EDTA-buffer met 0,5% HSA. Verzamel ze in een transferverpakkingszak. Spike het wanneer geïnstrueerd door het instrument.Installeer vervolgens een slangenset in het magnetische celscheidingsapparaat van klinische kwaliteit. Plaats de verpakkingen met de PBS-EDTA-buffer en de transferverpakking met het celproduct in het instrument. Voor de uitputting van de gelabelde alfa bèta T-cellen selecteert u het depletion 1.2-protocol in de software.Centrifugeer vervolgens het celproduct om de doelfractie verrijkt met Gamma-Delta T-cellen te verzamelen. Suspensie van de verzamelde cellen in het medium opnieuw, aangevuld met 10% humaan AB-serum. Voer een celtelling levensvatbaarheid en flowcytometrie fenotypering na uitputting uit.Breng cellen tot een eindconcentratie van ongeveer één keer 10 tot de zesde cel per milliliter. Bestraal vijf keer 10 tot de zevende kunstmatige antigeen-presenterende cellen of AAPCs per kolf, bij 100 grijs op het röntgengenererende instrument. Bereid een co-kweek, door de bestraalde AAPCs en Gamma-Delta T-cellen in de verhouding van 10 is op één te plaatsen, in bioreactorkolven van één liter gesloten systeem.Met één liter kweekmedium, aangevuld met 10% humaan AB-serum, zaait u tot 10 kolven. Incubeer de cultuur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 10 dagen, met een screening van glucose- en lactaatspiegels om de drie tot vier dagen met behulp van strips, glucose en een lactaatmeter. Als het glucosegehalte daalt tot 215 milligram per deciliter, verlaag dan het volume in de kolf tot 200 milliliter.Meng de cellen in de resterende 200 milliliter media en verwijder een monster van 0,5 milliliter voor celtelling en levensvatbaarheidsmeting door acridine oranje of propidiumjodidekleuring. Als het celgetal gelijk is aan of meer dan 10 tot de negende, splitst u de inhoud van een kolf in tweeën en vult u elke kolf tot één liter met AIM-V medium, aangevuld met 10% humaan AB-serum. Als het celgetal minder dan 10 tot de negende is, voedt u de cellen met een vers kweekmedium van één liter, aangevuld met 10% humaan AB-serum, en brengt u de kolven terug naar de incubator.Oogst aan het einde van 10 dagen in co-kweek de bioreactorkolven één voor één en trek alle cellen in een transferverpakking van de juiste grootte. Na het verwijderen van de kwaliteitscontrolemonsters, centrifugeer de cellen op 200 tot 500 keer G gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Was de cellen in een oplossing van een gebalanceerde kristalloïde oplossing, aangevuld met 0,5% HSA bij 200 tot 500 maal G gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Suspensie ze opnieuw in een doelvolume van 100 tot 300 milliliter gebalanceerde kristalloïde oplossing met 0,5% HSA. De cellen gescheiden van de post-tegenstroom centrifugatiefractie. Twee leverden een zuivere lymfocytenpopulatie op, met een uitstekende gemiddelde levensvatbaarheid van 95,80% De gamma-delta T-cellen specifieke expansie, waarbij zoledroninezuur afhankelijk was van het initiële percentage natuurlijke killercellen dat aanwezig was in de lymfocytenfractie na elutriatie.De verrijking van Gamma-Delta T-cel geneesmiddelsubstantie, met T-cel receptor alfa bèta-uitputting was consistent. Het Gamma-Delta T-cel geneesmiddelproduct vervaardigd uit drie gezonde donoren, voldeed aan het afgiftecriterium van minder dan 1% van de T-celreceptor alfa bètapositieve T-cellen, met een gemiddelde van 0,11% CD20-positieve B-cellen en 0,00% T-celreceptor alfa bèta-positieve T-cellen. Het gemiddelde percentage natural killer-cellen in het eindproduct was ongeveer 17,06% dat voldeed aan het afgiftecriterium van minder dan 35% Celoppervlakkleuring en flowcytometrische analyse, werden gebruikt om de identiteit, zuiverheid en procesonzuiverheden van de geneesmiddelsubstantie en het geneesmiddel te karakteriseren.De tweede heruitbreiding die werd bereikt door de co-kweek van de AAPC en Gamma-Delta T-cel medicijnsubstantie, genereerde een Gamma-Delta T-celgeneesmiddelproduct dat aan alle afgiftecriteria voldeed. Pathonen die de T-celpopulatie verrijken, beïnvloeden de expansie en kenmerken van het product. Voldoende aandacht en onderzoek van verrijkingsmethoden is vereist, voorafgaand aan het begin van hun verrijkingsproces.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolatie van menselijke endotheliale cellen van normale Colon en colorectaal carcinoom - een verbeterde Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

Morfologie-gebaseerd onderscheid tussen gezonde en pathologische cellen met behulp van Fouriertransformaties en zelf-organiserende kaarten

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor Metabolomic analyse door capillaire elektroforese-massaspectrometrie

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolatie en uitbreiding van cytotoxische Cytokine-geïnduceerde Killer T-cellen voor kankerbehandeling

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isoleren van menselijke perifere bloedmonucleaire cellen en CD4 + T-cellen van patiënten met het Sézary-syndroom voor transcriptomische profilering

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolatie en functionele beoordeling van menselijke borstkankerstamcellen uit cel- en weefselmonsters

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Generatie en uitbreiding van primaire, maligne pleurale mesothelioomtumorlijnen

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Real-time detectie en vastlegging van invasieve celsubpopulaties uit coculturen

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...