Name: expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Wir danken dem Cellular Immunotherapies-Investigator Initiated Trials Award Intramural Funding Opportunity des Moffitt Cancer Center für die Bereitstellung der Finanzierung dieser Protokollentwicklung. Wir danken auch Dr. Claudio Anasetti für seine unschätzbare Hilfe und Anleitung durch dieses Projekt. Abschließend danken wir Dr. Justin Boucher für seine Einsichten und die Überprüfung des Manuskripts.

HINWEIS: Die IRB-Genehmigung wurde eingeholt, und die Einwilligung der Spender nach Aufklärung wurde eingeholt.
1. Lymphozytenisolierung
<ol><li>Das Aphereseprodukt in einen Reinraum überführen. HINWEIS: Die Prozessvalidierung wurde unter Verwendung der normalen Spenderapherese von einem externen kommerziellen Anbieter durchgeführt, der den Vorschriften für die Sammlung von Rohzellstoffen entspricht.</li>
	<li>Sammeln Sie Proben für Sterilitätstests, Zellzahl und Zellphänotypisierung.</li>
	<li>Elutriat auf der Gegenstromzentrifugationsvorrichtung unter Verwendung eines primären Mediums von Hanks Balanced Salt Solution mit 1% humanem Serumalbumin (HSA) und einem sekundären Medium Kochsalzlösung (0,9% Natriumchlorid Injektions-USP) oder Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS). Stellen Sie die Elutriationszentrifugationsgeschwindigkeit auf 900 × g ein und sammeln Sie Fraktionen basierend auf Durchflussrate und Zeit.</li>
	<li>Sammeln Sie Proben von Fraktion 2 und führen Sie die folgenden Tests durch: 2 ml für die Sterilitätsprüfung; 0,5 ml für Zellzahl und Lebensfähigkeit unter Verwendung von Acridinorange/Propidiumiodid (AO/PI); 5 × 106 Zellen für die Zellphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie.</li>
	<li>Expansion einer reinen Lymphozytenfraktion (Fraktion 2) von Zellen in Kultur bei 10 × 106 Zellen/cm2 in einem 1 L Geschlossensystem-Bioreaktor mit 5 μmol/L Zoledronsäure und 300 I.E./ml IL-2.</li>
	<li>Sieben Tage lang in einem bei 37 °C eingestellten Inkubator mit 5% CO2 inkubieren.</li>
</ol>2. Alpha-Beta (αβ) T-Zell-Depletion
<ol><li>Ernte von Zellen aus dem 1 L-Bioreaktorkolben mit geschlossenem System. Schweißen Sie ein 1-Liter-Transferpaket steril an die rote Linie des Bioreaktors mit geschlossenem System und verwenden Sie die entsprechende pharmazeutische Pumpe, um die Zellen in das Transferpaket zu übertragen.</li>
	<li>Nehmen Sie die folgenden Proben: 10 ml für verbrauchte mittlere Sterilität; 0,5 ml Zellen für Zellanzahl und Lebensfähigkeit unter Verwendung von AO / PI; 5 × 106 Zellen für die Durchflusszytometrie</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen bei ~5 × 108 Zellen/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder (PBS/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)) Puffer + 0,5% HSA und biotinyliertem TCR αβ-spezifischem Antikörper.</li>
	<li>Den Shaker in den Kühlschrank stellen und die Zellen bei 2-8 °C ca. 15 min unter Schütteln inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit insgesamt 600 ml PBS/EDTA-Puffer + 0,5% HSA. Zentrifuge zur Entfernung des ungebundenen Antikörpers bei 200-500 × g für 15 min bei 2-8 °C. Resuspend ~5 × 108 Zellen/ml im PBS/EDTA-Puffer + 0,5% HSA mit Anti-Biotin-spezifischen Mikrokügelchen (7,5 ml/1 Durchstechflasche).</li>
	<li>Den Shaker in den Kühlschrank stellen und die Zellen bei 2-8 °C ca. 15 min unter Schütteln inkubieren. Nach der Inkubation werden die Zellen bei 200-500 × g für 15 min bei 2-8 °C zentrifugiert, um die ungebundenen Mikrokügelchen zu entfernen. Resuspend ~ 6 × 107 Zellen / ml in PBS / EDTA-Puffer + 0,5% HSA und übertragen Sie sie in einen Transferpackbeutel.</li>
	<li>Installieren Sie den Schlauchsatz in der magnetischen Zelltrennvorrichtung in klinischer Qualität, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen, legen Sie die Packungen mit dem PBS / EDTA-Puffer und das Transferpaket mit dem Zellprodukt in das Instrument und spitzen Sie es auf Anweisung des Geräts.</li>
	<li>Wählen Sie das Depletion 1.2-Protokoll für die Depletion der markierten αβ T-Zellen aus.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zielfraktion (angereicherte γδ T-Zellen) und resuspenieren Sie die Zellen in Medium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum.</li>
	<li>Nehmen Sie eine 0,5 ml Probe und führen Sie eine Zellzahl und Lebensfähigkeit mit AO / PI-Färbung durch. Bringen Sie die Zellen auf eine Endkonzentration von etwa 1 × 106 Zellen / ml. Nehmen Sie eine Probe von 5 × 106 Zellen des Produkts für die Durchflusszytometrie-Phänotypisierung nach der Depletion.</li>
</ol>3. Co-Kultur mit aAPCs
<ol><li>Bestrahlung von 5 × 107 aAPCs/Kolben bei 100 Gy auf das Röntgengerät.</li>
	<li>Verwenden Sie die aAPCs in Co-Kultur im Verhältnis 10:1 mit den γδ T-Zellen. Die bestrahlten aAPCs (5 × 107 Zellen/Kolben) und γδ T-Zellen (5 × 106 Zellen/Kolben) werden in 1 L-Bioreaktorflaschen mit 1 L Kulturmedium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum, gegeben. Samen Sie bis zu 10 Kolben.</li>
	<li>Die Zellen in Kultur für 10 Tage in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 ausdehnen.</li>
	<li>Überwachen Sie den Glukose- und Laktatspiegel alle 3-4 Tage mit Streifen, Glukose und einem Laktatmessgerät.</li>
	<li>Wenn die Glukose auf 250 mg/dl sinkt, wird das Volumen im Kolben mit einer pharmazeutischen Pumpe auf 200 ml reduziert, indem eine 1-Liter-Transferpackung zur roten Linie des Bioreaktors des geschlossenen Systems steril geschweißt wird.</li>
	<li>Mischen Sie die Zellen in den verbleibenden 200 ml und nehmen Sie eine 0,5 ml Probe für die Zellzählung und Lebensfähigkeitsmessung durch AO-PI-Färbung. Wenn die Zellzahl ≥109 beträgt, teilen Sie einen Kolben in zwei Kolben auf und füllen Sie jeden Kolben bis zu 1 l mit AIM-V, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum. Wenn die Zellzahl <109 beträgt, füttern Sie die Zellen mit einem frischen Liter Kulturmedium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.6 für alle Kolben und bringen Sie sie bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator zurück. Wiederholen Sie die Schritte 3.4-3.7 alle 3 bis 4 Tage.</li>
</ol>4. Zellernte
<ol><li>Am Ende von 10 Tagen in Co-Kultur alle Bioreaktorkolben ernten. Ernten Sie jeweils 1 Bioreaktorkolben und fassen Sie alle Zellen in einer Transferpackung von geeigneter Größe zusammen. Schweißen Sie das Transferpaket steril an die rote Linie des Bioreaktors des geschlossenen Systems und verwenden Sie die pharmazeutische Pumpe, um die Zellen in das Transferpaket zu übertragen.</li>
	<li>Entfernen Sie die folgenden Qualitätskontrollproben: 1% des Arzneimittels (DP) für die Sterilität durch Blutkultur und Grammfärbung; 0,5 ml für Zellzählung und Lebensfähigkeit mit AO/PI; 5-10 × 106 Zellen für die Durchflusszytometrie (siehe Abbildung 1 zur Gating-Strategie); 0,5 ml für Endotoxin; 0,5 ml für gramm Färben; 106 Zellen wurden für Mykoplasmentests auf 10 ml verbrauchtes Medium aufgespießt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200-500 × g für 15 min bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen in einer Lösung aus ausgewogener kristalloider Lösung + 0,5% HSA bei 200-500 × g für 15 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie sie in einem Zielvolumen von 100-300 ml balancierter kristalloider Lösung + 0,5% HSA.</li>
</ol>5. Release-Tests
<ol><li>Durchführung von Qualitätskontrolltests der γδ-T-Zelle DP auf Folgendes: Reinheit und Identität durch Durchflusszytometrie (Lebend/Tot, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); Lebensfähigkeit durch AO/PI-Färbung; Endotoxin; Mykoplasmentest durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR); Sterilität durch Grammfärbung und aerobe und anaerobe Blutkulturen; Rest-K562-Assay mittels Durchflusszytometrie (CD3-CD16-CD56-CD71+).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation:+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study.">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation.">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li><li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment,+risk+factors,+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li><li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph++leukemia+model.">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).</li><li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;&#948;+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-&#945;&#946;+/CD19++lymphocytes.">&#947;&#948; T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-&#945;&#946;+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li><li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+T+cell+receptor:+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors.">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells.">Large-scale expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li><li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+for+immunotherapy.">In vitro expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+V&#947;9V&#948;2+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer.">Allogeneic V&#947;9V&#948;2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Das Moffit Cell Therapy Lab hat ein Protokoll mit einer biphasischen Expansion von hochreinen γδ T-Zellen für den Einsatz als DP in klinischen Studien entwickelt. Dieses Protokoll bietet eine Herstellungsmethode nach cGMP-Richtlinien in einem geschlossenen System, die eine hochreine γδ-T-Zell-DP ergibt, die erfolgreich durch Zoledronsäure und die WCB-aAPCs aktiviert und expandiert wird. Dieses Protokoll wurde von der FDA für die Herstellung eines allogenen γδ-T-Zell-DP für AML-Patienten zugelassen. Mit gesunden Spendern konnten wir die kleine Population von Spender-γδ-T-Zellen in nur 7 Tagen von 2,06 ± 0,45% auf 54,45 ± 28,34% erweitern. Nach der 7-tägigen Expansion mit Zoledronsäure wurde beobachtet, dass Spender 2 eine Zunahme der NK-Population aufwies.
Zoledronsäure hemmt die Farnesyldiphosphat-Synthase (FDPS) in Monozyten, was wiederum zur Akkumulation von Isopentenylpyrophosphat (IPP) führt, was mit einer signifikanten Zunahme der Proliferation von T-Zellen und natürlichen NK-Zellen korreliert wurde7,8,9. Diese erhöhte NK-Population behindert die 2. Expansionsphase mit den aAPCs, da die aAPCs nur zur weiteren Expansion der NK-Zellen beitragen werden. Aus diesem Grund wurden die Spenderkriterien modifiziert, um Spender mit hohen NK-Populationen auszuschließen. Nach Erschöpfung der αβ-T-Zellen wurden die γδ-T-Zellen weiter auf 76,61 ± 27,51% angereichert. Dieses einzigartige Protokoll umfasst eine zweite Erweiterung unter Verwendung der von Moffit hergestellten aAPCs, um auf die CD8-, CD28- und CD127L-Rezeptoren in den γδ-T-Zellen abzuzielen. Diese zweite Expansionsphase mit den aAPCs ergab einen DP mit ≥65% für CD3+TCR γδ+ T Zellen, ≤1% TCRαβ T und <35% CD3-CD16+CD56+ NK Zellen. Aufgrund der Verwendung von K562-abgeleiteten aAPCs musste nachgewiesen werden, dass diese aAPCs <1% des Endprodukts ausmachten.
Das Moffit CTF entwickelte einen durchflusszytometrischen Assay, der für die Freisetzungskriterien verwendet wird, um den Prozentsatz der verbleibenden K562-Zellen in der endgültigen DP zu messen. Dieser durchflusszytometrische Assay mildert alle Probleme bei der Verwendung von Zelloberflächenantigenen zur Identifizierung der K562-Zellen. Da aktivierte T-Zellen CD71 exprimieren können, entwickelten wir eine Strategie, um alle T-Zellen und NK-Zellen auszuschließen, indem wir auf CD3-CD56- und CD16-Populationen gating und dann die CD71+ Zellen untersuchten, die ausschließlich K562-Zellen wären. Dieses Protokoll zeigt, dass die γδ-T-Zell-DP 0,48 ± 0,42% der verbleibenden K562-Zellen liefert und alle Freisetzungskriterien von ≥70% Lebensfähigkeit, Mykoplasmen-Negativität durch PCR, keine Organismen, die durch Grammfärbung gesehen werden, ≤2 EU / ml Endotoxin und keine endgültige (14 Tage) Blutkultursterilität erfüllt.

Leukämierezidigung ist die häufigste Todesursache nach hämatopoetischer Zelltransplantation (HCT) bei Patienten mit AML1,2,3. Ein besseres leukämiefreies Überleben wurde mit der erhöhten Erholung von Blut-γδ-T-Zellen nach HCT ohne erhöhtes Risiko für eine Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD)4 berichtet. Die Fähigkeit von γδ-T-Zellen, Antigene MHC-unabhängig zu erkennen und starke zytolytische und Th1-ähnliche Effektorfunktionen zu entwickeln, macht diese kleine Subpopulation von T-Zellen ideal für die Behandlung von AML-Patienten, die sich einer allogenen Transplantation mit Rückfallrisiko unterziehen5. Angesichts der Tatsache, dass die Vγ9Vδ2-T-Zellen eine untergeordnete Untergruppe von T-Lymphozyten im Bereich von 0,5% bis 5% der T-Zellen in der Peripherie6 sind, haben wir uns zum Ziel gesetzt, ein robustes System zur Erweiterung dieser seltenen Population von Blutzellen zu etablieren, um potenziell therapeutische Dosen für klinische Studien zu erreichen.
Obwohl andere erfolgreich γδ T-Zellen mit Zoledronsäure und sogar aAPCs erweitert haben, haben wir ein Verfahren entwickelt, das γδ T-Zellen potenziell um das 229.749-fache erweitern kann. Die Expansion ist biphasisch: Zuerst werden Lymphozyten durch Elutriation mit dem Trenninstrument gewonnen. Die Ausrüstung bietet ein geschlossenes System, das die Trennung von Zellen basierend auf ihrer Größe, Form und Dichte durch Gegenstromzentrifugation ermöglicht. Nach der Anreicherung für Lymphozyten wird die selektive Expansion von Vγ9Vδ2 T-Zellen durch Behandlung mit Zoledronsäure und IL-2 für 7 Tage erreicht. Unmittelbar nach dieser Behandlung werden TCR-αβ T-Zellen mit Hilfe der Mikrokügelchentechnologie depletiert, was eine anschließende Erweiterung der γδ-T-Zellen mit K562-abgeleiteten aAPCs ermöglicht.
Für die Prozessvalidierung wurden nur 5 × 106 Zoledronsäure-expandierte γδ T-Zellen für die Phase-2-Cokulturexpansion mit aAPCs verwendet. In dieser zweiten Expansionsphase werden γδ-T-Zellen unter Verwendung einer aktuellen Good Manufacturing Practices (cGMP)-konformen Working Cell Bank (WCB) aus gentechnisch veränderten K562-abgeleiteten AAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) aktiviert, die bei Moffitt hergestellt werden. Die Begründung für diese biphasische Expansion basiert auf der Fähigkeit von Zoledronsäure, die Farnesyldiphosphat-Synthase (FDPS) in Monozyten zu hemmen, was zur Akkumulation von Isopentenylpyrophosphat führt, das die Vγ2Vδ2-Zellen direkt stimuliert. In der zweiten Expansionsphase bieten die von K562 abgeleiteten aAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) eine robuste Stimulation für alle T-Zellen. Das Zellprodukt wurde jedoch bereits für die γδ-T-Zellen angereichert, was zu einer robusten Expansion der γδ-T-Zellen führt.
Durch die Verwendung von speziellen Geräten und Kolben ist das Verfahren ein funktional geschlossenes System, wodurch das Risiko einer Kontamination verringert wird. Darüber hinaus ermöglicht der 1-l-Bioreaktor mit geschlossenem System ein maximales Wachstum und eine maximale Ausdehnung der Zellen in einem Gesamtvolumen von 1 L Medium mit minimalem Fütterungsbedarf. Der Vorteil der Moffitt-Methode besteht darin, dass sie ein schnelles, reproduzierbares und sehr praktikables GMP-System zur Herstellung eines hochreinen, aus dem Spender gewonnenen γδ-T-Zellprodukts für die allogene Verabreichung bietet. Diese Methode kann auf jede klinische Studie angewendet werden, die darauf abzielt, menschliche γδ T-Zellen, die Vγ2Vδ2-T-Zellrezeptoren exprimieren, als adoptive Immuntherapie zu verwenden, um immunität gegen Mikroben und Tumore bei Krebspatienten mit partieller und vollständiger Remission zu vermitteln. Darüber hinaus bietet es eine robuste Plattform für die Entwicklung und Produktion von γδ-chimären Antigenrezeptor-positiven (CAR+) T-Zellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>285-GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin 25%</td>
			<td>Grifolis</td>
			<td>65483-16-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalyte A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>2B2543Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoledronic Acid (Zometa)</td>
			<td>Hos pira</td>
			<td>4215-04--8</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS10</td>
			<td>BIOLIFE SOLUTIONS</td>
			<td>210374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL syringe</td>
			<td>JMS</td>
			<td>992861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18g Needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials 1.8 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367610Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 mL Transfer Pack</td>
			<td>TERUMO BCT INC</td>
			<td>1BBT060CB71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Plasma Transfer Set</td>
			<td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td>
			<td>03-220-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra Tubing Set</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>70800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 MCS GREX</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td>81100-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acacia Pump boot</td>
			<td>MPS Medical In</td>
			<td>17789HP3MLL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-070-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dornase Alpha</td>
			<td>Genentech, Inc</td>
			<td>50242-100-40/186-0055</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL 0.22 um Filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>157-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Filter 170um</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>V2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACs Tubing set</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-090-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS TCR&#945;/&#946; Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-021-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-Type blood set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>FWL4C2498H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 mL Flask</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>65483-116-071</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM-V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0870112BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Gemini Bio-Product</td>
			<td>100H41T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Liter Transfer pack</td>
			<td>Independent Medical Associates</td>
			<td>T3109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000&#160; pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5991040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF-250</td>
			<td>KOLBio</td>
			<td>CF-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra</td>
			<td>TERUMOBCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Vios CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product

Obwohl Vγ9Vδ2-T-Zellen eine untergeordnete Untergruppe von T-Lymphozyten sind, ist diese Population wegen ihrer Fähigkeit gefragt, Antigene in einer MHC-unabhängigen Weise zu erkennen und eine starke zytolytische Effektorfunktion zu entwickeln, die sie zu einem idealen Kandidaten für die Krebsimmuntherapie macht. Aufgrund der geringen Häufigkeit von Gamma-Delta (γδ) T-Zellen im peripheren Blut haben wir ein effektives Protokoll entwickelt, um ein hochreines γδ-T-Zell-Arzneimittel für die erstmalige Verwendung von allogenen γδ-T-Zellen bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) stark zu erweitern. Unter Verwendung einer gesunden Spenderapherese als allogene Zellquelle werden die Lymphozyten mit einem validierten Gerät für eine Gegenstromzentrifugationsmethode zur Trennung von Zellen nach Größe und Dichte isoliert. 
Die lymphozytenreiche Fraktion wird genutzt, und die γδ T-Zellen werden bevorzugt mit Zoledronsäure (FDA-zugelassen) und Interleukin (IL)-2 für 7 Tage aktiviert. Nach der bevorzugten Expansion von γδ-T-Zellen werden ein magnetisches Zelltrennvorrichtung klinischer Qualität und TCRαβ-Kügelchen verwendet, um kontaminierende T-Zell-Rezeptor-(TCR)αβ-T-Zellen zu depletieren. Die hochangereicherten γδ-T-Zellen durchlaufen dann eine zweite Expansion unter Verwendung von künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (aAPCs), die aus K562-Zellen abgeleitet sind - gentechnisch verändert, um ein einkettiges variables Fragment (scFv) für CD3 und CD28, 41BBL (CD137L) und IL15-RA zusammen mit Zoledronsäure und IL-2 zu exprimieren. Die Aussaat aller day-7 angereicherten γδ T-Zellen in Kokultur mit den aAPCs erleichtert die Herstellung hochreiner γδ T-Zellen mit einer durchschnittlichen Faltenausdehnung von >229.000-fach aus gesundem Spenderblut.

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Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Vorgestellt wird ein Protokoll für die Expansion von Gamma-Delta (γδ) T-Zell-Arzneimittel. Lymphozyten werden durch Elutriation isoliert und γδ-angereichert mit Zoledronsäure und Interleukin-2. Alpha-Beta-T-Zellen werden mit einem magnetischen Trenngerät in klinischer Qualität erschöpft. Die γδ-Zellen werden mit K562-abgeleiteten, künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen ko-kultiviert und expandiert.

Erweiterung und Anreicherung von Gamma-Delta (γδ) T-Zellen aus Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Die Gamma-Delta-T-Zellen haben eine starke zytotoxische Aktivität gegen viele Krebsarten, einschließlich akuter myeloischer Leukämie. Zirkulierende Gamma-Delta-T-Zellen in einem Blut sind jedoch relativ selten, insbesondere bei Patienten mit malignen Erkrankungen. Die Infusion von spenderabgeleiteten, X-vivo expandierten Gamma-Delta-T-Zellen ist vielversprechend, um das Wiederauftreten von Leukämie zu reduzieren und das Überleben von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie zu verbessern.Die vorgeschlagene Methode erreicht in drei einfachen Schritten eine mehr als 200.000-fache Gamma-Delta-T-Zellexpansion und erreicht therapeutisch relevante Dosen eines hochreinen Gamma-Delta-T-Zellprodukts. Also Ligating eines IEL zur Expansion, Alpha-Beta-T-Zell-Depletion durch magnetische Sortierung und Bounty-Sekundärexpansion mit AAPCs. Die vorgeschlagene Methode erweitert den Nutzen von Gamma-Delta-T-Zellen für Krankheiten wie Krebs und Autoimmunerkrankungen, indem sie schnell eine große Anzahl von Zellen erzeugt, die von der Stange verwendet werden können.Dieser Prozess könnte angepasst werden, um Gamma-Delta-Zellen mit verschiedenen Anreicherungsmethoden zu erweitern und zusätzliche Manipulationen wie Transduktion hinzuzufügen. Die Demonstration des Verfahrens wird in LA, einem Zelltherapie-Technologen, drei aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit der Elutriation der Brauseproduktprobe auf der Gegenstromzentrifugationsvorrichtung unter Verwendung eines primären Mediums der ausgewogenen Hanks-Salzlösung mit 1% humanem Serumalbumin und dem sekundären Medium der Kochsalzlösung oder DPBS.Mit der Elutriationszentrifugationsgeschwindigkeit bei 900 mal G sammeln Sie Fraktionen basierend auf Durchflussrate und Zeit. Sammeln Sie die Proben aus dem zweiten Bruchteil, um die Sterilitätstests, die Zellzahl und die Zellphänotypisierung durch Durchflusszytometrie durchzuführen. Von Der zweiten Fraktion expandieren Sie eine reine Lymphozytenfraktion von Zellen in Kultur bei 10 mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Zentimeter im Quadrat, mit fünf Mikromol pro Liter Zoledronsäure und 300 Einheiten pro Milliliter Interleukin-2 in einem Ein-Liter-Bioreaktor mit geschlossenem System.Inkubieren Sie das System sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Nach der Inkubation ernten Sie Zellen aus dem Ein-Liter-Bioreaktorkolben mit geschlossenem System. Schweißen Sie dazu ein Ein-Liter-Transferpaket steril an die rote Linie des Bioreaktors und verwenden Sie die entsprechende pharmazeutische Pumpe, um die Zellen in das Transferpaket zu übertragen.Nehmen Sie die Proben zur Untersuchung der verbrauchten mittleren Sterilität, der Zellzahl und der Zellphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie. Aus der verbleibenden Probe werden die Zellen fünfmal 10 bis acht Zellen pro Milliliter im PBS-EDTA-Puffer mit 0,5% HSA und biotinyliertem T-Zell-Rezeptor, Alpha-Beta-spezifischem Antikörper, erneut suspendiert. Und die Zellen bei zwei bis acht Grad Celsius mit Schütteln inkubieren.Nach 15 Minuten waschen Sie die Zellen mit 600 Millilitern PBS-EDTA-Puffer mit 0,5 HSA und zentrifugieren Sie bei 200 bis 500 mal G für 15 Minuten bei zwei bis acht Grad Celsius, um den ungebundenen Antikörper zu entfernen. Dann suspendieren Sie die Zellen bei etwa fünf mal 10 bis acht Zellen pro Milliliter in PBS-EDTA-Puffer, der 0,5% HSA und 7,5 Milliliter pro Fläschchen antibiotinspezifischer Mikrokügelchen enthält. Wie bereits beschrieben, inkubieren Sie die Zellen mit Schütteln, bevor Sie die Zellsuspension zentrifugieren, um die ungebundenen Mikrokügelchen zu entfernen.Sechsmal 10 bis zur siebten Zelle pro Milliliter im PBS-EDTA-Puffer mit 0,5% HSA erneut suspendieren. Sammeln Sie sie in einer Transfertasche. Spiken Sie es, wenn Sie vom Instrument angewiesen werden.Als nächstes installieren Sie ein Schlauchset in der magnetischen Zelltrennvorrichtung in klinischer Qualität. Legen Sie die Packungen mit dem PBS-EDTA-Puffer und die Transferpackung mit dem Zellprodukt in das Gerät. Für die Depletion der markierten Alpha-Beta-T-Zellen wählen Sie das Depletion 1.2-Protokoll in der Software aus.Dann zentrifugieren Sie das Zellprodukt, um die mit Gamma-Delta-T-Zellen angereicherte Zielfraktion zu sammeln. Suspendieren Sie die gesammelten Zellen in dem Medium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum. Führen Sie eine Zellzahllebensfähigkeit und Durchflusszytometrie Phänotypisierung nach der Depletion durch.Bringen Sie Zellen auf eine Endkonzentration von etwa einem mal 10 bis zur sechsten Zelle pro Milliliter. Bestrahlen Sie fünfmal 10 bis zur siebten künstlichen Antigen-präsentierenden Zelle oder AAPCs pro Kolben bei 100 Grau auf dem röntgenerzeugenden Instrument. Bereiten Sie eine Kokultur vor, indem Sie die bestrahlten AAPCs und Gamma-Delta-T-Zellen im Verhältnis von 10 zu eins in einem Liter geschlossenen System-Bioreaktorkolben platzieren.Mit einem Liter Kulturmedium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum, samen Sie bis zu 10 Kolben. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 10 Tage, mit einem Screening der Glukose- und Laktatspiegel alle drei bis vier Tage mit Streifen, Glukose und einem Laktatmessgerät. Wenn der Glukosespiegel auf 215 Milligramm pro Deziliter sinkt, reduzieren Sie das Volumen im Kolben auf 200 Milliliter.Mischen Sie die Zellen in die verbleibenden 200 Milliliter Medien und entfernen Sie eine 0,5 Milliliter Probe für die Zellzählung und Lebensfähigkeitsmessung durch Acridinorange oder Propidiumiodid-Färbung. Wenn die Zellzahl gleich oder größer als 10 bis neunt ist, teilen Sie den Inhalt eines Kolbens in zwei auf und füllen Sie jeden Kolben bis zu einem Liter mit AIM-V-Medium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum. Wenn die Zellzahl weniger als 10 bis neunt beträgt, füttern Sie die Zellen mit einem frischen Liter Kulturmedium, ergänzt mit 10% menschlichem AB-Serum, und geben Sie die Kolben in den Inkubator zurück.Am Ende von 10 Tagen in Co-Kultur ernten Sie die Bioreaktorkolben nacheinander und ziehen Sie alle Zellen in eine Transferpackung von geeigneter Größe. Nachdem Sie die Qualitätskontrollproben entnommen haben, zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 bis 500 mal G für 15 Minuten bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen in einer Lösung aus ausgewogener kristalloider Lösung, ergänzt mit 0,5% HSA bei 200 bis 500 mal G für 15 Minuten bei Raumtemperatur.Suspendieren Sie sie erneut in einem Zielvolumen von 100 bis 300 Millilitern ausgewogener kristalloider Lösung mit 0,5% HSA. Die Zellen trennten sich von der Post-Counterflow-Zentrifugationsfraktion. Zwei ergaben eine reine Lymphozytenpopulation mit einer ausgezeichneten durchschnittlichen Lebensfähigkeit von 95,80%Die spezifische Expansion der Gamma-Delta-T-Zellen mit Zoledronsäure hing vom anfänglichen Prozentsatz der natürlichen Killerzellen ab, die nach der Elutriation in der Lymphozytenfraktion vorhanden waren.Die Anreicherung der Gamma-Delta-T-Zell-Wirkstoffsubstanz mit T-Zell-Rezeptor-Alpha-Beta-Depletion war konsistent. Das Gamma-Delta T-Zell-Arzneimittel, das aus drei gesunden Spendern hergestellt wurde, erfüllte das Freisetzungskriterium von weniger als 1% der T-Zell-Rezeptor-Alpha-Beta-positiven T-Zellen, mit durchschnittlich 0,11% CD20-positiven B-Zellen und 0,00% T-Zell-Rezeptor-Alpha-Beta-positiven T-Zellen. Der durchschnittliche Prozentsatz an natürlichen Killerzellen im Endprodukt betrug etwa 17,06%, was das Freisetzungskriterium von weniger als 35% erfüllte Zelloberflächenfärbung und durchflusszytometrische Analyse wurden verwendet, um die Identität, Reinheit und Prozessverunreinigungen der Arzneimittelsubstanz und des Arzneimittels zu charakterisieren.Die zweite erneute Erweiterung, die aus der Kokultur der AAPC- und Gamma-Delta-T-Zell-Wirkstoffsubstanz erreicht wurde, erzeugte ein Gamma-Delta-T-Zell-Arzneimittelprodukt, das alle Freisetzungskriterien erfüllte. Pathons, die die T-Zell-Population anreichern, beeinflussen die Expansion und die Eigenschaften des Produkts. Vor Beginn ihres Anreicherungsprozesses ist eine ausreichende Prüfung und Untersuchung der Anreicherungsmethoden erforderlich.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Forschung

Krebsforschung

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolierung der menschlichen Endothelzellen aus normalen Colon und kolorektalen Karzinom - eine verbesserte Protokoll

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

Morphologie-basierte Unterscheidung zwischen gesunden und pathologischen Zellen mittels Fourier-Transformationen und Self-Organizing Maps

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Gewinnung von wässrigen Metaboliten aus kultivierten Adherenten Zellen für die metabolomische Analyse durch die kapitänische Spektrometrie Elektrophoresis-Mass

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Isolierung und Erweiterung zytotoxischer Cytokin-induzierter Killer-T-Zellen zur Krebsbehandlung

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolierung menschlicher mononukleärer Blutzellen und CD4+ T-Zellen von Patienten mit Sézary-Syndrom für transkriptomisches Profiling

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Erzeugung und Erweiterung primärer, maligner pleuraler Mesotheliom-Tumorlinien

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...