Name: expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

אנו מודים להזדמנות מימון פנים-אופן של אימונותרפיות-חוקרי תאים המעניקים הזדמנות מימון תוך-ארגונית ממרכז הסרטן של מופיט על מתן המימון לפיתוח פרוטוקול זה. אנו מודים גם לד"ר קלאודיו אנסטי על עזרתו והדרכתו רבת הערך באמצעות פרויקט זה. לבסוף, אנו מודים לד"ר ג'סטין בושה על תובנותיו וסקירת כתב היד.

הערה: אישור IRB הושג, והושגו הסכמה מדעת מהתורמים.
1. בידוד לימפוציטים
<ol><li>מעבירים את המוצר הספירה לחדר נקי. הערה: אימות התהליך בוצע באמצעות אפרזיס תורם רגיל מספק מסחרי חיצוני התואם לתקנות איסוף חומרי גלם סלולריים.</li>
	<li>לאסוף דגימות לבדיקות סטריליות, ספירת תאים, פנוטיפינג תאים.</li>
	<li>יש לאלוטר את מכשיר צנטריפוגת הזרימה הנגדית באמצעות מדיום ראשוני של תמיסת מלח מאוזנת של Hanks עם 1% אלבומין בסרום אנושי (HSA) ומדיום משני של תמיסת מלח (0.9% הזרקת נתרן כלורי USP) או תמיסת מלח עם אגירה פוספט של Dulbecco (DPBS). הגדר את מהירות צנטריפוגת ההבהה על 900 × g ולאסוף שברים בהתבסס על קצב הזרימה וזמן.</li>
	<li>לאסוף דגימות משבר 2 ולבצע את הבדיקות הבאות: 2 מ"ל לבדיקת סטריליות; 0.5 מ"ל לספירת תאים וכדאיות באמצעות אקרידין כתום / פרופידיום יודיד (AO / PI); 5 × 106 תאים עבור פנוטיפינג תאים על ידי ציטומטריית זרימה.</li>
	<li>הרחב שבר לימפוציטים טהור (שבר 2) של תאים בתרבית ב 10 × 106 תאים / cm2 ב 1 L סגור מערכת bioreactor עם 5 מיקרומול / ליטר של חומצה זולדרונית ו 300 IU / mL של IL-2.</li>
	<li>דגירה במשך שבעה ימים באינקובטור להגדיר על 37 °C (5%)</li>
</ol>2. אלפא-ביתא (αβ) דלדול תא T
<ol><li>קציר תאים מבקבוק הביו-ריאקטור של המערכת הסגורה 1 ליטר. סטרילי-ריתוך חבילת העברה 1 L לקו האדום של bioreactor המערכת הסגורה, ולהשתמש במשאבה התרופות המתאימה כדי להעביר את התאים לתוך חבילת ההעברה.</li>
	<li>קח את הדגימות הבאות: 10 מ"ל עבור סטריליות בינונית בילה; 0.5 מ"ל של תאים לספירת תאים וליכולת הכדאיות באמצעות AO/PI; 5 × 106 תאים לציטומטריית זרימה</li>
	<li>Resuspend התאים ב ~ 5 × 108 תאים / מ"ל מלוחים חוצצי פוספט (PBS) או (PBS / אתילנדימינטטראצטטי חומצה (EDTA)) חוצץ + 0.5% HSA ו- TCR ביוטינילציה αβ ספציפי לנוגדן.</li>
	<li>מניחים את השייקר במקרר ודגרת התאים ב 2-8 מעלות צלזיוס במשך כ 15 דקות עם רועד.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם סך של 600 מ"ל של חוצץ PBS / EDTA + 0.5% HSA. צנטריפוגה כדי להסיר את הנוגדן לא מאוגד ב 200-500 × גרם במשך 15 דקות ב 2-8 °C (70 °F). Resuspend ~ 5 × 108 תאים / מ"ל במאגר PBS / EDTA + 0.5% HSA עם חיידקים ספציפיים אנטי ביוטין (7.5 מ"ל / 1 מ"ל / 1 מעין).</li>
	<li>מניחים את השייקר במקרר ודגרת התאים ב 2-8 מעלות צלזיוס במשך כ 15 דקות עם רועד. לאחר הדגירה, צנטריפוגה התאים ב 200-500 גרם × במשך 15 דקות ב 2-8 °C (8 °F) כדי להסיר את החיידקים unbound. Resuspend ~ 6 × 107 תאים / מ"ל במאגר PBS / EDTA + 0.5% HSA ולהעביר אותם לתיק חבילת העברה.</li>
	<li>התקן את ערכת הצינורות בהתקן הפרדת התא המגנטי ברמה קלינית על-ידי ביצוע הוראות היצרן, מקם את האריזות עם מאגר PBS / EDTA ואת חבילת ההעברה עם מוצר התא במכשיר ותדוקר אותו בהוראת המכשיר.</li>
	<li>בחר בפרוטוקול דלדול 1.2 עבור דלדול תאי αβ T המסומנים בתווית.</li>
	<li>צנטריפוגה שבר היעד (תאי γδ T מועשר) ו resuspend התאים בינוני בתוספת עם 10% סרום AB אנושי.</li>
	<li>קח דגימה של 0.5 מ"ל ובצע ספירת תאים ויכולת ערך עם כתם AO /PI. להביא תאים לריכוז סופי של כ 1 × 106 תאים / מ"ל. קח מדגם של 5 × 106 תאים של המוצר עבור פנוטיפינג ציטומטריה זרימה לאחר דלדול.</li>
</ol>3. תרבות משותפת עם AAPCs
<ol><li>הקרנה של 5 × 107 aAPCs/בקבוקון ב-100 ג'י במכשיר יצירת קרני הרנטגן.</li>
	<li>השתמש ב- aAPCs בתרבית משותפת ביחס של 10:1 עם תאי ה- γδ T. מניחים את תאי ה- AAPCs המוקרנים (5 × 107 תאים/בקבוקון) ותאי T γδ (5 × 106 תאים/בקבוקון) בבקבוקי ביו-ריאקטור של מערכת סגורה של L עם 1 ליטר של מדיום תרבות בתוספת 10% סרום AB אנושי. זרע עד 10 צלוחיות.</li>
	<li>להרחיב את התאים בתרבית במשך 10 ימים באינקובטור ב 37 °C (5%) ו 5% CO2.</li>
	<li>יש לעקוב אחר רמות הגלוקוז והלקאט כל 3-4 ימים באמצעות רצועות, גלוקוז ומד לקטט.</li>
	<li>אם גלוקוז יורד ל 250 מ"ג / ד"ל, להפחית את הנפח בבקבוקון ל 200 מ"ל באמצעות משאבה פרמצבטית על ידי סטרילי-ריתוך חבילת העברה 1 L לקו האדום של bioreactor המערכת הסגורה.</li>
	<li>מערבבים את התאים ב-200 מ"ל הנותרים, ולוקח דגימה של 0.5 מ"ל לספירת תאים ומדידת כדאיות על ידי כתמי AO-PI. אם ספירת התאים היא ≥109, לפצל בקבוקון אחד לשני צלוחיות ולמלא כל בקבוקון עד 1 L עם AIM-V בתוספת 10% סרום AB אנושי. אם ספירת התאים היא <109, להאכיל את התאים עם ליטר טרי של מדיום תרבית בתוספת 10% סרום AB אנושי.</li>
	<li>חזור על שלב 3.6 עבור כל הבקבוקונים והחזיר אותם לאינקובטור ב 37 °C (5%) חזור על שלבים 3.4-3.7 כל 3 עד 4 ימים.</li>
</ol>4. קציר תאים
<ol><li>בסוף 10 ימים בתרבות משותפת, לקצור את כל בקבוקונים bioreactor. קציר 1 בקבוקון bioreactor בכל פעם, ולאגד את כל התאים לתוך חבילת העברה בגודל מתאים. סטרילי-לרתך את חבילת ההעברה לקו האדום של bioreactor המערכת הסגורה, ולהשתמש במשאבת התרופות כדי להעביר את התאים לתוך חבילת ההעברה.</li>
	<li>הסר את דגימות בקרת האיכות הבאות: 1% של מוצר התרופה (DP) עבור סטריליות על ידי תרבות הדם וכתמים גרם; 0.5 מ"ל לספירת תאים וליכולת כובש באמצעות AO/PI; 5-10 × 106 תאים לציטומטריית זרימה (ראה איור 1 לאסטרטגיית גינגינג); 0.5 מ"ל לאנדוטוקסין; 0.5 מ"ל להכתמת גרם; 106 תאים זינקו ל-10 מ"ל של בינוני עבור בדיקת Mycoplasma.</li>
	<li>צנטריפוגות התאים ב 200-500 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant.</li>
	<li>לשטוף את התאים בתמיסה של פתרון גבישי מאוזן + 0.5% HSA ב 200-500 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. resuspend אותם בנפח יעד של 100-300 מ"ל של פתרון גבישי מאוזן + 0.5% HSA.</li>
</ol>5. בדיקת שחרור
<ol><li>בצע בדיקות בקרת איכות של DP תא γδ T עבור הדברים הבאים: טוהר וזהות על ידי cytometry זרימה (חי/מת, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); הכדאיות על ידי כתמי AO / PI; אנדוטוקסין; בדיקת מיקופלסמה על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR); סטריליות על ידי כתמי גרם ותרביות דם אירוביות ואנאירוביות; שאריות K562 לפי ציטומטריית זרימה (CD3-CD16-CD56-CD71+).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation:+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study.">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation.">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li><li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment,+risk+factors,+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li><li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph++leukemia+model.">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).</li><li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;&#948;+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-&#945;&#946;+/CD19++lymphocytes.">&#947;&#948; T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-&#945;&#946;+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li><li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+T+cell+receptor:+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors.">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells.">Large-scale expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li><li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+for+immunotherapy.">In vitro expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+V&#947;9V&#948;2+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer.">Allogeneic V&#947;9V&#948;2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

המעבדה לטיפול בתאים Moffit פיתחה פרוטוקול עם הרחבה biphasic של תאי γδ T טהורים מאוד לשימוש כ- DP בניסויים קליניים. פרוטוקול זה מספק שיטת ייצור תחת הנחיות cGMP במערכת סגורה המניבה DP תא T טהור מאוד המופעל ומורחב בהצלחה על ידי חומצה זולדרונית ו- AAPCs של WCB. פרוטוקול זה אושר על ידי ה-FDA לייצור DP תא אלוגניים γδ T עבור חולי AML. באמצעות תורמים בריאים, הרחבנו בהצלחה את האוכלוסייה הקטנה של תאי T תורמים תוך 7 ימים בלבד מ-2.06 ± 0.45% ל-54.45 ± 28.34%. לאחר התרחבות של 7 ימים עם חומצה זולדרונית, נצפתה כי תורם 2 היה גידול באוכלוסיית NK.
חומצה זולדרונית מעכבת פרנסיל דיפוספט סינתאז (FDPS) במונוציטים, אשר, בתורו, מוביל הצטברות של איזופנטניל pyrophosphate (IPP), אשר היה בקורלציה עם עלייה משמעותית בשגשוג של תאי T ותאי NK טבעיים7,8,9. אוכלוסיית NK מוגברת זו מעכבת את השלב השני של התרחבות עם aAPCs, כמו aAPCs רק יתרום להתרחבות נוספת של תאי NK. מסיבה זו שונו הקריטריונים לתורם כדי לא לכלול תורמים עם אוכלוסיות NK גבוהות. לאחר דלדול תאי ה- αβ T, תאי ה- γδ T הועשרו עוד יותר ל- 76.61 ± 27.51%. פרוטוקול ייחודי זה כולל הרחבה שנייה המשתמשת ב- aAPCs המיוצרים על-ידי Moffit כדי למקד את קולטני CD8, CD28 ו- CD127L בתאי ה- γδ T. שלב ההרחבה השני עם ה- aAPCs הניב DP עם ≥65% עבור תאי CD3+ TCR γδ+ T, ≤1% TCRαβ T ותאי CD3-CD16+CD56+ NK <35%. בשל השימוש ב- AAPCs שמקורם ב- K562, היה צורך להוכיח כי aAPCs אלה היוו <1% מהמוצר הסופי.
Moffit CTF פיתחה זרימה ציטומטרית המשמשת לקריטריוני השחרור כדי למדוד את אחוז תאי K562 השיוריים ב- DP הסופי. זרימה זו של ציטומטריה מפחיתה את כל הבעיות של שימוש באנטג'נים של פני התא כדי לזהות את תאי K562. מכיוון שתאי T מופעלים יכולים לבטא CD71, הוצאנו אסטרטגיה לא לכלול את כל תאי ה- T ותאי ה- NK על-ידי גינגה באוכלוסיות CD3- CD56 ו- CD16 ולאחר מכן בדיקת תאי CD71+ , שיהיו אך ורק תאי K562. פרוטוקול זה מדגים כי DP תא γδ T מניב 0.48 ± 0.42% מתאי K562 שיורית ועונה על כל קריטריוני השחרור של ≥70% כדאיות, שליליות Mycoplasma על ידי PCR, אין אורגניזמים לראות על ידי כתמי גרם, ≤2 EU / mL של אנדוטוקסין, ואין צמיחה סופית (14 ימים) סטריליות תרבות הדם.

הישנות לוקמיה היא הגורם המוביל לתמותה לאחר השתלת תאים hematopoietic (HCT) בחולים עם AML1,2,3. הישרדות טובה יותר ללא לוקמיה דווחה עם התאוששות מוגברת של תאי γδ T בדם לאחר HCT ללא סיכון מוגבר למחלה שתל נגד מארח (GVHD)4. היכולת של תאי T לזהות אנטיגנים באופן עצמאי MHC ולפתח פונקציות אפקטים חזקים דמויי Th1 להפוך את זה תת-צפיפות קלה של תאי T אידיאלי לטיפול בחולי AML העוברים השתלה אלוגנית בסיכון להפחתה5. בהתחשב בכך שתאי Vγ9Vδ2 T הם תת-קבוצה מינורית של לימפוציטים T הנעים בין 0.5% ל -5% מתאי T בפריפריה6, יצאנו להקים מערכת חזקה להרחבת אוכלוסייה נדירה זו של תאי דם כדי להשיג מינונים טיפוליים פוטנציאליים לניסויים קליניים.
למרות שאחרים הרחיבו בהצלחה תאי γδ T באמצעות חומצה זולדרונית ואפילו AAPCs, פיתחנו תהליך שיכול להרחיב תאי T ב-229,749 פי 229,749. ההתרחבות היא דו-פאזית: ראשית, לימפוציטים מתקבלים על ידי התרוממות יתר באמצעות מכשיר ההפרדה. הציוד מספק מערכת סגורה המאפשרת הפרדה של תאים בהתבסס על גודלם, צורתם וצפיפותם על ידי צנטריפוגה של זרימת נגד. לאחר העשרה ללימפוציטים, הרחבה סלקטיבית של תאי Vγ9Vδ2 T מושגת על ידי טיפול בחומצה זולדרונית ו- IL-2 למשך 7 ימים. מיד לאחר טיפול זה, תאי TCR-αβ T מתרוקנים באמצעות טכנולוגיית microbead, ומאפשרים הרחבה מאוחרת יותר של תאי γδ T עם AAPCs שמקורם ב- K562.
לאימות תהליכים, רק 5 × 106 תאי T המורחבים בחומצה זולדרונית שימשו להרחבת תרבית משותפת שלב 2 עם aAPCs. בשלב השני של ההתרחבות, תאי γδ T מופעלים באמצעות בנק תאי עבודה תואם ייצור תקין (cGMP) התואם הנוכחי (cGMP) של AAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) המיוצרים ב- Moffitt. הרציונל של הרחבה biphasic זה מבוסס על היכולת של חומצה זולדרונית לעכב פרנסיל דיפוספט סינתאז (FDPS) במונוציטים, מה שמוביל להצטברות של איזופנטניל pyrophosphate, אשר מגרה ישירות את תאי Vγ2Vδ2. בשלב השני של ההתרחבות, ה- aAPCs שמקורם ב- K562 (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) מספקים גירוי חזק לכל תאי ה- T. עם זאת, מוצר התא כבר הועשר עבור תאי γδ T, וכתוצאה מכך התרחבות חזקה של תאי γδ T.
עם השימוש בציוד ספציפי ובקבוקונים, התהליך הוא מערכת סגורה מבחינה תפקודית, ובכך להפחית את הסיכון לזיהום. בנוסף, הביו-ריאקטור של המערכת הסגורה 1 ליטר מאפשר צמיחה והתרחבות מקסימלית של תאים בנפח כולל של 1 ליטר בינוני עם צורך מינימלי בהאכלה. היתרון של שיטת מופיט הוא שהיא מספקת מערכת GMP מהירה, ניתנת לשחזור, וישית מאוד כדי לייצר מוצר תאי γδ T טהור מאוד, שמקורו בתורם לניהול אלוגני. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל ניסוי קליני שמטרתו להשתמש בתאי γδ T אנושיים המבטאים קולטני תאי VγVδ2 T כאימונותרפיה מאמצת כדי לתווך חסינות מפני חיידקים וגידולים בחולי סרטן עם הפוגה חלקית ומלאה. בנוסף, הוא מספק פלטפורמה חזקה לפיתוח וייצור של תאי T קולטן אנטיגן כימרי (CAR+).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>285-GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin 25%</td>
			<td>Grifolis</td>
			<td>65483-16-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalyte A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>2B2543Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoledronic Acid (Zometa)</td>
			<td>Hos pira</td>
			<td>4215-04--8</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS10</td>
			<td>BIOLIFE SOLUTIONS</td>
			<td>210374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL syringe</td>
			<td>JMS</td>
			<td>992861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18g Needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials 1.8 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367610Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 mL Transfer Pack</td>
			<td>TERUMO BCT INC</td>
			<td>1BBT060CB71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Plasma Transfer Set</td>
			<td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td>
			<td>03-220-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra Tubing Set</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>70800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 MCS GREX</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td>81100-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acacia Pump boot</td>
			<td>MPS Medical In</td>
			<td>17789HP3MLL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-070-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dornase Alpha</td>
			<td>Genentech, Inc</td>
			<td>50242-100-40/186-0055</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL 0.22 um Filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>157-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Filter 170um</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>V2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACs Tubing set</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-090-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS TCR&#945;/&#946; Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-021-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-Type blood set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>FWL4C2498H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 mL Flask</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>65483-116-071</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM-V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0870112BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Gemini Bio-Product</td>
			<td>100H41T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Liter Transfer pack</td>
			<td>Independent Medical Associates</td>
			<td>T3109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000&#160; pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5991040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF-250</td>
			<td>KOLBio</td>
			<td>CF-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra</td>
			<td>TERUMOBCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Vios CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product

למרות שתאי Vγ9Vδ2 T הם תת-קבוצה מינורית של לימפוציטים מסוג T, אוכלוסייה זו מבוקשת על יכולתה לזהות אנטיגנים באופן עצמאי היסטו-תאימות (MHC) ולפתח פונקציית אפקט ציטוליטית חזקה שהופכת אותה למועמדת אידיאלית לאימונותרפיה של סרטן. בשל התדירות הנמוכה של תאי גמא-דלתא (γδ) T בדם ההיקפי, פיתחנו פרוטוקול יעיל להרחבה רבה של מוצר תרופתי תאי γδ T טהור ביותר לשימוש ראשון בבני אדם בתאי T אלוגניים בחולים עם לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). באמצעות אפרזיס תורם בריא כמקור תא אלוגניים, הלימפוציטים מבודדים באמצעות מכשיר מאומת עבור שיטת צנטריפוגה זרימה נגדית של הפרדת תאים לפי גודל וצפיפות. 
השבר העשיר בלימפוציטים מנוצל, ותאי ה- γδ T מופעלים באופן מועדף עם חומצה זולדרונית (שאושרה על ידי ה-FDA) ואינטרלוקין (IL)-2 למשך 7 ימים. בעקבות ההתפשטות המועדפת של תאי γδ T, מכשיר הפרדת תאים מגנטיים ברמה קלינית וחרוזי TCRββ משמשים לרוקן קולטן תאי T מזהמים (TCR)αβ T תאים. תאי ה-γδ T המועשרים ביותר עוברים לאחר מכן הרחבה שנייה באמצעות תאים מהונדסים המציגים אנטיגן מלאכותי (aAPCs) המופקים מתאי K562 שהונדסו גנטית לבטא שבר משתנה בעל שרשרת אחת (scFv) עבור CD3 ו-CD28, 41BBL (CD137L) ו-IL15-RA-יחד עם חומצה זולדרונית ו-IL-2. זריעת כל תאי ה-T המועשרים של היום-7 בתרבית-שיתוף עם ה-aAPCs מאפשרת ייצור של תאי T טהורים ביותר עם התרחבות קיפול ממוצעת של פי 229,000 > מדם תורם בריא.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

מוצג פרוטוקול להרחבת מוצר התרופה תא גמא-דלתא (γδ) T. לימפוציטים מבודדים על ידי ההבהרה ומועשרים בחומצה זולדרונית ואינטרלוקין-2. תאי אלפא-ביתא T מתרוקנים באמצעות התקן הפרדה מגנטי ברמה קלינית. תאי γδ מתורבתים במשותף עם תאים מלאכותיים שמקורם ב- K562 ומורחבים.

הרחבה והעשרה של תאי T של גמא-דלתא (γδ) ממוצר אנושי כדורי

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

לתאי גאמא-דלתא T יש פעילות ציטוטוקסית רבת עוצמה נגד סוגים רבים של סרטן, כולל לוקמיה מיאלואידית חריפה. עם זאת, מחזור תאי גמא-דלתא T בדם הם נדירים יחסית, במיוחד בחולים עם ממאירות. עירוי של תורם נגזר, X-vivo מורחב תאי גאמא דלתא T, יש הבטחה בהפחתת הישנות של לוקמיה, ושיפור ההישרדות של חולים עם לוקמיה מיאלואידית חריפה.השיטה המוצעת משיגה הרחבה של יותר מ-200, פי 000 של תאי גמא-דלתא T, ומגיעים למינונים רלוונטיים מבחינה טיפולית של מוצר תאי גמא-דלתא T טהור ביותר, בשלושה שלבים קלים. אז קשירת IEL להתרחבות, דלדול תאי אלפא ביתא T על ידי מיון מגנטי והרחבה משנית של שפע עם AAPCs. השיטה המוצעת מרחיבה את התועלת של תאי גמא-דלתא T למחלות כגון סרטן ומחלות אוטואימוניות על ידי יצירת מספר רב של תאים שניתן להשתמש בהם מהמדף.ניתן להתאים תהליך זה להרחבת תאי גמא-דלתא בשיטות העשרה שונות ולהוסיף מניפולציות נוספות כגון התמרה. הדגמת ההליך תהיה lithed בלוס אנג'לס, טכנולוג טיפול בתא, שלושה מהמעבדה שלי. התחל על ידי התרוממות דגימת המוצר תוססת, על מכשיר צנטריפוגה זרימה נגד, באמצעות מדיום ראשוני של תמיסת מלח מאוזנת Hanks, עם 1%אלבומין סרום אנושי המדיום המשני של תמיסת מלח או DPBS.עם מהירות צנטריפוגת ההבהה ב 900 פעמים G, לאסוף שברים המבוססים על קצב הזרימה וזמן. לאסוף את הדגימות משבריר שתיים כדי לבצע את בדיקות סטריליות, ספירת תאים פנוטיפינג התא על ידי ציטומטריית זרימה. משבריר שתיים, להרחיב שבר לימפוציטים טהור של תאים בתרבית ב 10 פעמים 10 עד התא השישי לסנטימטר בריבוע, עם חמישה מיקרומול לליטר של חומצה זולדרונית ו 300 יחידות למיליליטר של Interleukin-2 ב bioreactor מערכת סגורה ליטר אחד.לדגור על המערכת במשך שבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה, תאי קציר מבקבוק הביו-ריאקטור של המערכת הסגורה של ליטר אחד. כדי לעשות זאת, ריתוך סטרילי חבילת העברה ליטר אחד לקו האדום של bioreactor, ולהשתמש במשאבת התרופות המתאימה כדי להעביר את התאים לתוך חבילת ההעברה.קח את הדגימות לבדיקה של סטריליות בינונית בילה, ספירת תאים פנוטיפינג התא על ידי ציטומטריית זרימה. מהדגימה הנותרת, להשעות מחדש את התאים בחמש פעמים 10 לתאים השמיניים למיליליטר, במאגר PBS-EDTA המכיל 0.5% HSA וקולטן תאי T ביוטינילים, נוגדן ספציפי אלפא בטא. ותדגירה את התאים בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס עם רעד.לאחר 15 דקות, לשטוף את התאים עם 600 מיליליטר של חוצץ PBS-EDTA המכיל 0.5 HSA וצנטריפוגה ב 200 עד 500 פעמים G במשך 15 דקות, בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס, כדי להסיר את הנוגדן לא מאוגד. לאחר מכן, להשעות מחדש את התאים בערך חמש פעמים 10 לתאים השמיניים למיליליטר, במאגר PBS-EDTA המכיל 0.5%HSA ו 7.5 מיליליטר לנקינה של חיידקים ספציפיים אנטי ביוטין. כפי שתואר קודם לכן, לדגור על התאים עם רועד, לפני centrifuging ההשעיה התא כדי להסיר את החיידקים לא מאוגדים.השהה מחדש שש כפול 10 לתאים השביעיים למיליליטר במאגר PBS-EDTA עם 0.5% HSA. לאסוף אותם לתוך שקית חבילת העברה. ספייק זה כאשר הורה על ידי המכשיר.לאחר מכן, התקן ערכת צינורות בהתקן הפרדת תאים מגנטיים ברמה קלינית. מקם את החבילות עם מאגר PBS-EDTA ואת חבילת ההעברה עם מוצר התא לתוך המכשיר. עבור דלדול של תאי אלפא ביתא T שכותרתם, בחר את פרוטוקול דלדול 1.2 בתוכנה.לאחר מכן, צנטריפוגה המוצר התא כדי לאסוף את שבר היעד מועשר בתאי גאמא דלתא T. להשעות מחדש את התאים שנאספו במדיום, בתוספת 10% סרום AB אנושי. בצע את הכדאיות ספירת התאים ואת ציטומטריית הזרימה פנוטיפינג לאחר דלדול.להביא תאים לריכוז סופי של בערך פעם אחת כפול 10 לתא השישי למיליליטר. הקרנה חמש פעמים 10 לתאים המלאכותיים השביעיים המציגים אנטיגן או AAPCs לכל בקבוקון, ב-100 אפור במכשיר יצירת קרני הרנטגן. הכן תרבית משותפת, על ידי הצבת AAPCs מוקרן ותאי גאמא-דלתא T ביחס של 10 הוא לאחד, בבקבוקי ביו-ריאקטור מערכת סגורה ליטר אחד.עם ליטר אחד של בינוני תרבות, בתוספת 10% סרום AB אנושי, זרע עד 10 צלוחיות. לדגור על התרבות ב 37 מעלות צלזיוס, ו 5% פחמן דו חמצני במשך 10 ימים, עם הקרנה של רמות גלוקוז לקטט כל שלושה עד ארבעה ימים באמצעות רצועות, גלוקוז ומד לקטט. אם רמת הגלוקוז יורדת ל 215 מיליגרם לדסקיליטר, להפחית את הנפח בבקבוקון ל 200 מיליליטר.מערבבים את התאים ב-200 המיליליטר הנותרים של המדיה, ומסירים דגימה של 0.5 מיליליטר לספירת תאים ומדידת כדאיות על ידי כתמי תפוז אקרדין או פרופיליום יודיד. אם ספירת התאים שווה, או יותר מ-10 עד התשיעית, פצל את התוכן של בקבוקון אחד לשניים ומלא כל בקבוקון עד לליטר אחד במדיום AIM-V, בתוספת סרום AB אנושי של 10%. אם ספירת התאים היא פחות מ -10 עד התשיעי, להאכיל את התאים עם ליטר אחד טרי של מדיום תרבית, בתוספת 10% סרום AB אנושי, ולהחזיר את הבקבוקונים לאינקובטור.בתום 10 ימים בתרבית משותפת, קוצרים את הבקבוקים הביולוגיים בזה אחר זה, ומושכים את כל התאים לחבילת העברה בגודל המתאים. לאחר הסרת דגימות בקרת האיכות, צנטריפוגה התאים ב 200 עד 500 פעמים G במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולהשליך את supernatant. לשטוף את התאים בתמיסה של פתרון גבישי מאוזן, בתוספת עם 0.5%HSA ב 200 עד 500 פעמים G במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.להשעות אותם מחדש בנפח יעד של 100 עד 300 מיליליטר של פתרון גבישי מאוזן עם 0.5% HSA. התאים מופרדים משבר צנטריפוגה של זרימת הנגד לאחר. שניים הניבו אוכלוסיית לימפוציטים טהורה, עם יכולת ערך ממוצעת מצוינת של 95.80% תאי גמא-דלתא T התרחבות ספציפית, עם חומצה זולדרונית תלויה באחוז הראשוני של תאי הרג טבעיים הנמצאים בשבר הלימפוציטים לאחר ההבהרה.ההעשרה של חומר התרופה תא T-דלתא גמא, עם קולטן תא T אלפא בטא דלדול היה עקבי. מוצר התרופה תא T-דלתא המיוצר משלושה תורמים בריאים, עמד בקריטריון השחרור של פחות מ -1% של קולטן תאי T אלפא בטא חיוביים תאים, עם ממוצע של 0.11%CD20 תאי B חיוביים, 0.00%קולטן תאי T אלפא בטא חיוביים תאים. האחוז הממוצע של תאי הרג טבעיים במוצר הסופי היה סביב 17.06%אשר עמד בקריטריון השחרור של פחות מ 35% כתם פני התא וניתוח ציטומטרי זרימה, נוצלו כדי לאפיין את הזהות, טוהר וזיהום תהליך של חומר התרופה ומוצר סמים.ההרחבה המחודשת השנייה שהושגה מהתרבות המשותפת של חומר התרופה AAPC ו- Gamma-Delta T-cell, יצרה מוצר של תא T-T גמא-דלתא שעמד בכל קריטריוני השחרור. פטונים אשר מעשירים את אוכלוסיית תאי T משפיעים על ההתרחבות והמאפיינים של המוצר. נדרשת התחשבות מספקת ובדיקה של שיטות העשרה, לפני תחילת תהליך ההעשרה שלהן.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

בידוד של תאי אנדותל אדם נורמלי המעי הגס, סרטן המעי הגס - פרוטוקול משופר

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

מבוסס-מורפולוגיה ההבחנה בין בריא פתולוגיים תאים התמרת פורייה ניצול ומפות התארגנות עצמית

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

הפקת מיכלי מטבוליטים מחומרים מתורבתים מMetabolomic לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בספקטרומטר המסה

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

בידוד והתרחבות של Cy, ציטוטוקאין ציטוטופין המושרה הרוצח T תאים לטיפול בסרטן

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

בידוד תאים חד-גרעיניים של דם היקפי אנושי ותאי T מסוג CD4+ מחולי תסמונת סזארי לצורך פרופיל תעתיק

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

ייצור והרחבה של קווי גידול ראשוניים וממאירים במליאה של Pleural

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

זיהוי ולכידה בזמן אמת של תת-אוכלוסיות תאים פולשניות מתרביות משותפות

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...