Name: expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells from Apheresed Human Product at JoVE.com

우리는 이 프로토콜 발달을 위한 자금을 제공하기 위한 Moffitt 암 센터에서 세포 면역 요법-조사자 개시 시험 상 교내 자금 조달 기회에 감사를 드립니다. 클라우디오 아나세티 박사의 귀중한 도움과 지도에 감사드립니다. 마지막으로, 우리는 원고에 대한 그의 통찰력과 검토에 대한 박사 저스틴 바우처에게 감사드립니다.

참고: IRB 승인을 받았고 기부자로부터 통보된 동의를 얻었습니다.
1. 림프구 격리
<ol><li>아페레시스 제품을 깨끗한 방으로 옮기. 참고: 원료 재료 수집 규정을 준수하는 외부 상용 벤더의 일반 기증자 apiheresis를 사용하여 공정 유효성 검사를 수행했습니다.</li>
	<li>멸균 테스트, 세포 수 및 세포 현상을 위해 샘플을 수집합니다.</li>
	<li>1% 인간 혈청 알부민(HSA)과 식염수 용액의 이차 매체(0.9% 염화나트륨 주입 USP) 또는 덜벡코의 인산염 버퍼살린(DPBS)을 이용한 카운터플로우 원심분리 장치에 용류한다. 용액 원심분리 속도를 900 × g 로 설정하고 유량과 시간에 따라 분수를 수집합니다.</li>
	<li>분수 2에서 샘플을 수집하고 다음 테스트를 수행 : 멸균 테스트를위한 2 mL; acridine 오렌지/프로피듐 요오드 (AO/ PI)를 사용하여 세포 수 및 생존을위한 0.5 mL; 5 × 106 세포에 의한 세포 피노티핑에 의한 유동 세포.</li>
	<li>1L 폐쇄시스템 생물반응기에서 10× 106 세포/cm2 에서 1L 의 세포 분획(분수 2)을 1L 폐쇄형 시스템 생물반응기에서 5μmol/L, IL-2의 300IU/mL로 확장한다.</li>
	<li>37°C에서 5%의 CO2로 설정된 인큐베이터에서 7일 동안 배양합니다.</li>
</ol>2. 알파 베타 (αβ) T 세포 고갈
<ol><li>1 L 폐쇄 시스템 생물 반응기 플라스크에서 세포를 수확합니다. 멸균-용접 1 L 이송 팩을 폐쇄시스템 생물반응기의 레드 라인으로 용접하고, 적절한 제약 펌프를 사용하여 세포를 이송 팩으로 이송한다.</li>
	<li>다음 샘플을 복용: 10 mL 소요 된 중간 멸균; AO/PI를 이용한 세포 수 및 생존가능성을 위한 세포의 0.5mL; 5 × 106 세포 유동 세포 측정</li>
	<li>인산염 완충식식염(PBS) 또는 (PBS/에틸렌디아민테트라아세산(EDTA)) 버퍼 + 0.5% HSA 및 생체음 TCR αβ 특이적 항체에서 ~5× 108 세포/mL에서 세포를 재연한다.</li>
	<li>셰이커를 냉장고에 넣고 셀을 2-8°C에서 약 15분 동안 흔들어 줍니다.</li>
	<li>PBS/EDTA 버퍼 + 0.5% HSA의 총 600mL로 셀을 세척합니다. 원심분리기는 2-8°C에서 15분 동안 200-500 × g 에서 언바운드 항체를 제거한다. PBS/EDTA 완충제에서 ~5× 108 세포/mL을 재일시 중단 + 0.5% HSA 에 안티 비오틴 특이 미생물(7.5 mL/1 유리병).</li>
	<li>셰이커를 냉장고에 넣고 셀을 2-8°C에서 약 15분 동안 흔들어 줍니다. 인큐베이션 후, 2-8°C에서 15분 동안 200-500 × g 의 세포를 원심분리하여 언바운드 마이크로비드를 제거한다. PBS/EDTA 버퍼 + 0.5% HSA에서 107 셀/mL을 × 6개의 셀/mL을 재일시 중단하고 전송 팩 백으로 옮기.</li>
	<li>제조업체의 지시에 따라 임상 등급 자기 세포 분리 장치에 튜브 세트를 설치하고, PBS/EDTA 버퍼와 계측기의 셀 제품으로 전사 팩을 배치하고 계측기의 지시에 따라 스파이크합니다.</li>
	<li>표지된 αβ T 세포의 고갈을 위해 고갈 1.2 프로토콜을 선택한다.</li>
	<li>원심분리기 표적 분획(농축γδ T 세포)을 배지로 분리하고 10%의 인간 AB 혈청으로 보충하였다.</li>
	<li>0.5mL 샘플을 채취하고 AO/PI 얼룩으로 셀 수와 생존력을 수행합니다. 약 1 × 106 세포/mL의 최종 농도에 세포를 가져옵니다. 유동 세포피토메트리 페노티핑 후 고갈을 위해 제품의 5 × 106 세포의 샘플을 채취한다.</li>
</ol>3. aAPC와의 공동 문화
<ol><li>X선 생성 기기의 100Gy에서 5 × 107 aAPC/플라스크를 조사합니다.</li>
	<li>γδ T 세포와 10:1 비율로 공동 배양에 aApC를 사용합니다. 조사된 aApC(5× 107 세포/플라스크) 및 γδ T 세포(5 × 106 세포/플라스크)를 1L 폐쇄시스템 생물반응기 플라스크에 1L의 인간 AB 세럼으로 보충한다. 최대 10개의 플라스크를 시드합니다.</li>
	<li>37°C 및 5% CO2에서 인큐베이터에서 10일 동안 배양세포를 확장한다.</li>
	<li>스트립, 포도당 및 젖산 미터를 사용하여 3-4 일마다 포도당 및 젖산 수준을 모니터링하십시오.</li>
	<li>포도당이 250 mg/dL로 떨어지면, 폐시스템 생물반응기의 레드 라인으로 1L 이송 팩을 멸균 용접하여 제약 펌프를 사용하여 플라스크의 부피를 200mL로 줄입니다.</li>
	<li>나머지 200mL에서 세포를 혼합하고, AO-PI 염색에 의한 세포 계수 및 생존성 측정을 위해 0.5mL 샘플을 채취한다. 셀 카운트가 ≥109인 경우, 플라스크 를 두 개의 플라스크로 나누고 AIM-V가 10%의 인간 AB 세럼으로 보충하여 각 플라스크를 최대 1L까지 채웁니다. 세포 수가 <109인 경우, 10%의 인간 AB 혈청으로 보충된 배양 배지의 신선한 리터로 세포를 공급한다.</li>
	<li>모든 플라스크에 대해 3.6단계를 반복하고 37°C 및 5% CO2에서 인큐베이터로 돌려보세요. 3~4일마다 3.4-3.7단계를 반복합니다.</li>
</ol>4. 세포 수확
<ol><li>공동 배양에서 10 일의 끝에서, 모든 생물 반응기 플라스크를 수확. 한 번에 1 개의 생물 반응기 플라스크를 수확하고 모든 세포를 적절한 크기의 이송 팩으로 풀을 넣습니다. 폐시스템 생물반응기의 레드 라인으로 이송 팩을 멸균-용접하고, 제약 펌프를 사용하여 세포를 이송 팩으로 이송한다.</li>
	<li>다음과 같은 품질 관리 샘플을 제거: 혈액 배양 및 그램 염색에 의해 멸균에 대 한 약물 제품의 1 %(DP); AO/PI를 이용한 세포 계산 및 생존가능성을 위한 0.5mL; 유동 세포측정을 위한 5-10 × 106 세포(게이팅 전략에 대한 그림 1 참조); 엔도독신용 0.5mL; 그램 염색에 대한 0.5 mL; 106 세포는 마이코플라즈마 테스트를 위해 소비된 배지의 10mL로 급증했습니다.</li>
	<li>실온에서 15 분 동안 200-500 × g 에서 세포를 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오.</li>
	<li>균형 잡힌 결정용액+ 0.5% HSA의 용액으로 셀을 실온에서 15분 동안 × 200-500g 에서 세척하십시오. 균형 잡힌 결정용액 + 0.5% HSA의 목표 부피 100-300 mL로 재보설한다.</li>
</ol>5. 릴리스 테스트
<ol><li>다음을 위해 γδ T 세포 DP의 품질 관리 테스트를 수행 : 흐름 세포측정에 의한 순도 및 정체성 (라이브 / 죽은, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); AO/PI 염색에 의한 생존 가능성; 엔도독신; 중합체 연쇄 반응 (PCR)에 의한 마이코플라즈마 테스트; 그램 염색 및 호기성 및 혐기성 혈액 배양에 의한 멸균; 잔류 K562 유동 세포측정제별 분석(CD3-CD16-CD56-CD71+).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation:+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study.">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation.">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li><li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment,+risk+factors,+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li><li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph++leukemia+model.">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).</li><li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;&#948;+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-&#945;&#946;+/CD19++lymphocytes.">&#947;&#948; T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-&#945;&#946;+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li><li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+T+cell+receptor:+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors.">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li><li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells.">Large-scale expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li><li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+V&#947;9V&#948;2+T+cells+for+immunotherapy.">In vitro expansion of V&#947;9V&#948;2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+V&#947;9V&#948;2+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer.">Allogeneic V&#947;9V&#948;2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li></ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Moffit 세포 치료 연구소는 임상 시험에서 DP로 사용하기 위해 고순수 γδ T 세포의 양면 확장을 가진 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 zoledronic 산 및 WCB aAPC에 의해 성공적으로 활성화되고 확장되는 고순수γδ T 세포 DP를 산출하는 폐쇄 된 시스템에서 cGMP 지침에 따라 제조 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 AML 환자를 위한 동종 γδ T 세포 DP의 제조를 위한 FDA에 의해 승인되었습니다. 건강한 기증자를 사용하여, 우리는 성공적으로 기증자 γδ T 세포의 작은 인구를 7 일 만에 확장 2.06 ± 0.45% 에 54.45 ± 28.34%. 졸레드로닉산으로 7일 간 확장된 후, 기증자 2가 NK 인구가 증가한 것으로 관찰되었다.
졸드로닉산은 단세포에서 파네실 디포스페이트 신타제(FDPS)를 억제하며, 이는 차례로 T 세포및 천연 NK 세포의 증식의 현저한 증가와 상관관계가 있는 이스토펜텐닐 파이로포산염(IPP)의 축적으로 이어진다. 이러한 증가된 NK 인구는 aAPC가 NK 세포의 추가 확장에기여할 것이기 때문에 aAPC와의 2단계 확장을 방해합니다. 이러한 이유로, 기증자 기준은 높은 NK 인구를 가진 기증자를 제외하기 위하여 수정되었습니다. αβ T 세포의 고갈 후, γδ T 세포는 27.51%± 76.61로 더욱 농축되었다. 이러한 독특한 프로토콜은 γδ T 세포내CD8, CD28 및 CD127L 수용체를 대상으로 Moffit 제조 aApC를 활용하는 제2 확장을 포함한다. aApC를 가진 이 두 번째 확장 단계는 CD3+TCR γδ+ T 세포에 대해 ≥65%, ≤1% TCRαβ T, 및 <3-CD16+CD56+ NK 셀에 대해 DP를 산출하였다. K562 유래 aAPC의 사용으로 인해 이러한 aAPC가 최종 제품의 <1%로 구성되어 있음을 입증할 필요가 있었습니다.
Moffit CTF는 최종 DP에서 잔류 K562 세포의 백분율을 측정하기 위해 방출 기준에 사용되는 유동 세포 분석법을 개발했습니다. 이러한 흐름 세포 분석은 K562 세포를 식별하기 위해 세포 표면 항원활용의 모든 문제를 완화한다. 활성화된 T 세포가 CD71을 발현할 수 있으므로 CD3-CD56 및 CD16-인구에 게이팅한 다음 전적으로 K562 세포인 CD71+ 셀을 검사하여 모든 T 세포와 NK 세포를 배제하는 전략을 고안했습니다. 이 프로토콜은 γδ T 세포 DP가 잔류 K562 세포의 0.48 ± 0.42%를 산출하고 ≥70% 생존율, PCR에 의한 마이코플라즈마 부정성, 그램 염색에 의해 본 유기체, ≤2 EU/mL 내독신의 EU/mL, 그리고 최종 성장(14일) 혈액멸을 입증한다.

백혈병 재발은 AML1,2,3를 가진 환자에서 조혈 세포 이식 (HCT) 후에 사망의 주요 한 원인입니다. 더 나은 백혈병 없는 생존은 접목 대 호스트 질병 (GVHD)4의 증가한 리스크 없이 HCT 후에 혈액 γδ T 세포의 증가한 복구로 보고되었습니다. γδ T 세포의 능력은 MHC 독립적 인 방식으로 항원을 인식하고 강한 세포 및 Th1 과 같은 이펙터 기능을 개발하여 T 세포의 이 경미한 하위 집단을 재발 위험에 처한 AML 환자의 치료에 이상적입니다5. Vγ9Vδ2 T 세포가 주변T 세포의 0.5%에서 5%에 이르는 T 림프구의 사소한 하위 집합이라는 점을 감안할 때, 우리는 임상 시험을 위한 잠재적으로 치료용량을 달성하기 위해 혈액 세포의 이 희소한 인구를 확장하는 견고한 시스템을 확립하기 시작했습니다.
다른 사람들은 졸레드로닉산과 심지어 aAPC를 사용하여 γδ T 세포를 성공적으로 확장했지만, 우리는 잠재적으로 229,749 배까지 γδ T 세포를 확장 할 수있는 프로세스를 개발했습니다. 팽창은 양면이다 : 첫째, 림프구는 분리 계측기를 사용하여 용광에 의해 얻어진다. 이 장비는 카운터플로우 원심분리에 의한 크기, 모양 및 밀도에 따라 셀을 분리할 수 있는 폐쇄 시스템을 제공합니다. 림프구를 농축한 후, Vγ9Vδ2 T 세포의 선택적 팽창은 7일 동안 졸레드로닉산 및 IL-2로 처리함으로써 달성된다. 이 치료 직후, TCR-αβ T 세포는 미생물 기술을 사용하여 고갈되어 K562 유래 aApC를 사용하여 γδ T 세포의 후속 확장을 허용합니다.
공정 검증을 위해, × 106 개의 졸레드로닉산 확장γδ T 세포만이 aApC를 이용한 상2 공동배양 확장을 위해 사용되었다. 이 확장 단계에서, γδ T 세포는 Moffitt에서 제조된 K562-CD3-41BBL(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)의 현재 양호한 제조 관행(cGMP)-호환 작업 세포 은행(WCB)을 사용하여 활성화된다. 이러한 biphasic 확장의 근거는 단세포에서 파네실 디포스페이트 신타제(FDPS)를 억제하는 조레드로닉산의 능력에 기초하여, Vγ2Vδ2 세포를 직접 자극하는 이스토닐 파이로포스페이트의 축적으로 이어진다. 확장의 두 번째 단계에서 K562 유래 aApC(K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)는 모든 T 셀에 강력한 자극을 제공한다. 그러나, 세포 생성물은 이미 γδ T 세포를 위해 농축되어, γδ T 세포의 견고한 팽창을 초래한다.
특정 장비와 플라스크를 사용하면 이 공정이 기능적으로 폐쇄되어 오염 위험이 줄어듭니다. 또한, 1L 폐쇄시스템 생물반응기는 수유를 위한 최소한의 필요를 가지고 총 1L의 배지에서 세포의 최대 성장과 확장을 용이하게 한다. Moffitt 방법의 장점은 동종 투여를 위한 매우 순수한 기증자 유래 γδ T 세포 제품을 생산하기 위해 신속하고 재현 가능하며 매우 실현 가능한 GMP 시스템을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 부분적이고 완전한 면제가 있는 암 환자의 미생물 및 종양에 대한 면역을 중재하기 위해 Vγ2Vδ2 T 세포 수용체를 채택 면역 요법으로 발현하는 인간 γδ T 세포를 사용하는 것을 목표로 하는 모든 임상 시험에 적용될 수 있다. 또한, γδ 키메라 항원 수용체 양성(CAR+) T 세포의 개발 및 생산을 위한 견고한 플랫폼을 제공한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>285-GMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin 25%</td>
			<td>Grifolis</td>
			<td>65483-16-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalyte A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>2B2543Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoledronic Acid (Zometa)</td>
			<td>Hos pira</td>
			<td>4215-04--8</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS10</td>
			<td>BIOLIFE SOLUTIONS</td>
			<td>210374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL syringe</td>
			<td>JMS</td>
			<td>992861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18g Needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials 1.8 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367610Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367811E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL conical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 mL Transfer Pack</td>
			<td>TERUMO BCT INC</td>
			<td>1BBT060CB71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Plasma Transfer Set</td>
			<td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td>
			<td>03-220-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra Tubing Set</td>
			<td>TerumoBCT</td>
			<td>70800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 MCS GREX</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td>81100-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acacia Pump boot</td>
			<td>MPS Medical In</td>
			<td>17789HP3MLL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-070-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dornase Alpha</td>
			<td>Genentech, Inc</td>
			<td>50242-100-40/186-0055</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL 0.22 um Filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>157-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Filter 170um</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>V2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACs Tubing set</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-090-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS TCR&#945;/&#946; Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-021-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-Type blood set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>FWL4C2498H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 mL Flask</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>65483-116-071</td>
			<td>FDA approved drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM-V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0870112BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Gemini Bio-Product</td>
			<td>100H41T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Liter Transfer pack</td>
			<td>Independent Medical Associates</td>
			<td>T3109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000&#160; pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5991040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF-250</td>
			<td>KOLBio</td>
			<td>CF-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elutra</td>
			<td>TERUMOBCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump</td>
			<td>WILSON WOLF MFG CORP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Vios CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expansion and enrichment of gamma-delta (&#947;&#948;) t cells from apheresed human product

Vγ9Vδ2 T 세포는 T 림프구의 사소한 하위 집합이지만, 이 인구는 주요 조직적합성 복합체(MHC)-독립적인 방식으로 항원을 인식하고 암 면역 요법에 이상적인 후보이기 쉬운 강력한 세포용 이펙터 기능을 개발하는 능력을 추구한다. 말초 혈액에서 감마 델타(γδ) T 세포의 저주파로 인해 급성 골수성 백혈병(AML)을 가진 환자에서 동종 γδ T 세포를 최초로 인간으로 사용하기 위한 고순수 γδ T 세포 약물 생성물을 크게 확장하는 효과적인 프로토콜을 개발했습니다. 건강한 기증자 아페레시스를 동종 세포 공급원으로 사용하여 림프구는 크기와 밀도로 세포를 분리하는 카운터플로우 원심분리 방법에 대한 검증된 장치를 사용하여 격리됩니다. 
림프구가 풍부한 분획이 활용되고, γδ T 세포는 7일 동안 졸레드로닉산(FDA 승인) 및 인터류신(IL)-2로 우선적으로 활성화된다. γδ T 세포의 우대 적 확장에 따라, 임상 급 자기 세포 분리 장치 및 TCRαβ 구슬은 오염 T 세포 수용체 (TCR)αβ T 세포를 고갈하는 데 사용된다. 고농축 γδ T 세포는 다음 설계 인공 항원 제시 세포를 사용하여 두 번째 확장을 겪습니다 (aApCs) K562 세포에서 유래 한 유전자 조작 단일 연쇄 가변 단편을 표현하기 위해 유전자 조작 (scFv) CD3 및 CD28, 41BBL (CD137L) 및 IL15-RA-zoledronic 산 및 IL-2와 함께. aApC와 공동 배양에서 하루 종일 농축 된 γδ T 세포를 하루 종일 파종하면 건강한 기증자 혈액으로부터 >229,000 배의 평균 배 확장과 함께 고순수 γδ T 세포의 제조를 용이하게합니다.

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Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

제시된 감마델타(γδ) T 세포 약품의 확장을 위한 프로토콜이다. 림프구는 졸레드로닉산 및 인터류신-2로 농축된 용류 및 γδ에 의해 분리된다. 알파 베타 T 세포는 임상 급 자기 분리 장치를 사용하여 고갈된다. γδ 세포는 K562 유래, 인공 항원 제시 세포와 공동 배양되고 확장된다.

감마 델타(γδ) T 세포의 확장 및 농축

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

감마 델타 T 세포는 급성 골수성 백혈병을 포함하여 많은 암 모형에 대하여 강력한 세포 독성 활동이 있습니다. 그러나, 혈액에 있는 감마 델타 T 세포를 순환하는 것은 악성종양을 가진 환자에서, 특히 희소합니다. 기증자 유래의 주입, X-vivo 확장 감마 델타 T 세포, 백혈병의 재발을 감소시키고, 급성 골수성 백혈병환자의 생존을 향상에 약속.제안된 방법은 200배, 000배 감마 델타 T 세포 확장을 달성하여 세 가지 쉬운 단계로 매우 순수한 감마 델타 T 세포 제품의 치료적 관련 용량에 도달합니다. 따라서 Iel을 확장, 알파 베타 T 세포 고갈에 의해 자기 분류 및 AApC와 바운티 이차 확장을 결합합니다. 제안된 방법은 선반에서 사용할 수 있는 많은 세포를 빠르게 생성하여 암 및 자가면역 질환과 같은 질병에 대한 감마 델타 T 세포의 실용성을 확장한다.이 프로세스는 다른 농축 방법을 사용하여 감마 델타 세포를 확장하고 변환과 같은 추가 조작을 추가하도록 조정할 수 있습니다. 절차를 보여주는 LA에서 리스 될 것입니다., 세포 치료 기술자, 내 실험실에서 세. 1%의 인간 혈청 알부민과 식염용 액의 보조 배지를 사용하여, 행크스 균형 소금 용액의 기본 매체를 사용하여, 카운터플로우 원심 분리 장치에 발포 제품 샘플의 용해로 시작합니다.용액 원심분리 속도는 G900배로 유량과 시간에 따라 분수를 수집합니다. 분수 2에서 샘플을 수집하여 혈류 세포측정에 의한 멸균 테스트, 세포 수 및 세포 피노티핑을 수행합니다. 분2에서, 1리터 폐쇄 시스템 생물 반응기에서 인터류신-2의 리터당 5마이크로몰과 인터류키인-2의 밀리리터 당 300 단위로 배양세포의 순수 림프구 분획을 10배 10배 10번에서 6세포제곱미터로 확장한다.이산화탄소는 섭씨 37도에서 7일간 시스템을 배양합니다. 인큐베이션 후, 하나의 리터 폐쇄 시스템 생물 반응기 플라스크에서 수확 세포. 이를 위해, 멸균은 1리터 이송 팩을 생물반응기의 레드 라인으로 용접하고, 적절한 제약 펌프를 사용하여 세포를 이송 팩으로 이송한다.유동 세포측정에 의한 소비된 중간 불균, 세포 수 및 세포 피노티핑의 테스트를 위해 샘플을 채취하십시오. 나머지 시료로부터, 밀리리터당 8번째 세포로 5배에서 10회, PBS-EDTA 버퍼에서 0.5%HSA 및 바이오티니화 T 세포 수용체, 알파 베타 특이적 항체를 함유한다. 그리고 흔들어 2 ~ 8섭씨에서 세포를 배양.15분 후, 0.5 HSA 및 원심분리기를 함유한 PBS-EDTA 버퍼 600밀리리터로 세포를 15분 동안 200~500회 G에서 2~8도의 반동항체를 제거한다. 이어서, 밀리리터당 8번째 세포에 약 5회 10회, PBS-EDTA 버퍼에서 0.5%HSA 및 항비오틴 특이적 마이크로비드의 바이알당 7.5 밀리리터를 함유하고 있다. 앞에서 설명한 바와 같이, 흔들리지 않는 마이크로비드를 제거하기 위해 세포 현탁액을 원심분리하기 전에, 흔들림으로 세포를 배양한다.0.5%HSA를 가진 PBS-EDTA 버퍼에서 밀리리터당 7번째 세포에 6회 10회 다시 중단한다. 그들을 전송 팩 가방에 수집합니다. 악기의 지시에 따라 스파이크합니다.다음으로, 임상 등급 자기 세포 분리 장치에 튜브 세트를 설치한다. PBS-EDTA 버퍼와 함께 팩을 배치하고 셀 제품이 있는 전송 팩을 기기에 넣습니다. 레이블이 지정된 알파 베타 T 셀의 고갈을 위해 소프트웨어에서 고갈 1.2 프로토콜을 선택합니다.그런 다음, 감마 델타 T 세포로 농축된 표적 분획을 수집하기 위해 세포 생성물을 원심분리한다. 10%의 인간 AB 혈청으로 보충된 배지에서 수집된 세포를 다시 중단한다. 세포 수 생존력 과 유동 세포측정량 계고 후 고갈을 수행한다.밀리리터당 6세포에 약 10회 의 최종 농도로 세포를 가져옵니다. 제7회 인공 항원 제시 세포 또는 플라스크당 AAPC에 5회 10회, X선 생성 기기의 100회색으로 조사한다. 조사된 AApCs 및 감마 델타 T 세포를 10의 비율로 배치하여 1리터 폐쇄 된 시스템 생물 반응기 플라스크에 공동 배양을 준비합니다.1리터의 배양 매체로, 10%의 인간 AB 세럼으로 보충되어 최대 10개의 플라스크를 시드합니다. 10일 간 37도, 이산화탄소 5%로 배양하고, 스트립, 포도당, 젖산 미터를 사용하여 3~4일마다 포도당과 젖산 수치를 선별합니다. 포도당 수준이 데시리터 당 215 밀리그램으로 떨어지면 플라스크의 부피를 200 밀리리터로 줄입니다.나머지 200밀리리터의 매체에 세포를 혼합하고, 아크리딘 오렌지 또는 요오드 스테닝에 의한 세포 계수 및 생존성 측정을 위한 0.5 밀리리터 샘플을 제거한다. 세포 수가 10대 9에 같거나 10개 이상인 경우, 플라스크 1개의 내용을 2개로 나누고 각 플라스크를 AIM-V 배지로 한 리터까지 채우고, 10%의 인간 AB 혈청으로 보충한다. 세포 수가 10에서 9번 미만인 경우, 10%의 인간 AB 혈청으로 보충된 신선한 1리터의 배양 배지로 세포를 공급하고 플라스크를 인큐베이터로 되돌려 보입니다.공동 배양에서 10 일의 끝에서, 생물 반응기 플라스크한을 한 번에 하나씩 수확하고, 적절한 크기의 전송 팩으로 모든 세포를 당깁니다. 품질 관리 샘플을 제거한 후 실온에서 15분 동안 200~500회 G에서 세포를 원심분리하고 상복부을 폐기한다. 균형 잡힌 결정용액의 용액으로 셀을 세척하여 실온에서 15분 동안 200~500회 G로 0.5%HSA로 보충합니다.0.5%의 HSA를 사용하여 균형 잡힌 결정형 용액의 100~300밀리리터의 목표 부피에서 다시 중단합니다. 포스트 카운터플로우 원심분리 분과 분리된 셀. 2개의 순수한 림프구 인구를 산출했습니다, 95.80%의 우수한 평균 생존가능성으로 감마 델타 T 세포 특정 확장, zoledronic 산은 용액 후 림프구 분획에 존재하는 천연 킬러 세포의 초기 비율에 의존합니다.감마 델타 T 세포 약물 물질의 농축, T 세포 수용체 알파 베타 고갈과 일관성이 있었다. 3명의 건강한 기증자로부터 제조된 감마 델타 T 세포 약 제품은, T 세포 수용체 알파 양성 T 세포의 1% 미만의 방출 기준을 충족했으며, 평균 0.11%CD20 양성 B 세포, 및 0.00%T-cell 수용체 알파 베타 양성 T 세포를 가졌다. 최종 제품에서 천연 킬러 세포의 평균 백분율은 약 17.06%로 35% 미만의 세포 표면 염색 및 유동 세포 측정 분석을 충족시켰으며, 약물 물질 및 약물 제품의 정체성, 순도 및 공정 불순물을 특성화하는 데 활용되었다.AAPC와 감마 델타 T 세포 약물 물질의 공동 배양에서 달성 된 두 번째 재 확장은 모든 릴리스 기준을 충족 감마 델타 T 세포 약물 제품을 생성했다. T 세포 인구를 풍요롭게 하는 병기는 제품의 확장과 특성에 영향을 미칩니다. 농축 과정을 개시하기 전에 농축 방법에 대한 충분한 고려와 조사가 필요합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

연구

암 연구학

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

정상적인 대 장 암과 대 장 암-향상 된 프로토콜에서 인간의 내 피 세포의 고립

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

건강 하 고 병 적인 사이 구별 형태학에 기초를 둔 세포 이용한 푸리에 변환 및 자기 조직 지도

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

모 세관 전기 영동-질량 분 광 법에의 한 대사체학 분석을 위해 배양 된 부착 세포 로부터 수성 대사 산물의 추출

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

암 치료를 위한 사이토카인 유발 킬러 T 세포의 격리 및 확장

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

전사 프로파일링을 위해 세자리 증후군 환자로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 및 CD4+ T 세포 분리

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

원발성, 악성 흉막 중피종 종양 라인의 생성 및 확장

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...